Browsing by Author "Engin, Evren Doruk"

Now showing 1 - 6 of 6
  • No Thumbnail Available
    Item
    Diverse Responses of Neurons and Monocytes to Titanium Dioxide Nanoparticle Exposure
    (2019) Engin, Evren Doruk; https://orcid.org/0000-0001-9209-8858; Biyoteknoloji Enstitüsü; Engin, Ayşe Başak
    Introduction: The toxicity of titanium dioxide nanoparticles (TiO2NPs) in neurons occurs by glutamate signaling via N-methyl-d-aspartate (NMDA) receptors. Although cellular uptake of TiO2NPs may lead to oxidative stress in macrophages, it is not known whether TiO2NPs have toxic effects on U937 monocytic cell line. Material and Methods: Human neuroblastoma (SH-SY5Y) and U937 human monocytic cell lines were exposed to 25nm and 10nm TiO2NPs, in medium with or without fetal bovine serum (FBS). Mitochondrial metabolic activity was assessed using the MTT-assay before and after treatment with 15 mM N-acetylcysteine (NAC) and 0.1µM or 10µM neopterin. Results: TiO2NPs displayed no toxicity on SH-SY5Y and U937 cells in FBS-free medium. The addition of FBS resulted in a significant reduction in cell viability with both sizes of TiO2NPs on SH-SY5Y and U937 cells. In FBScontaining medium, NAC pretreatment significantly increased cell viability of SH-SY5Y cells in comparison to U937 cells. Both neopterin doses enhanced cell viability of TiO2NPs-exposed SH-SY5Y cells for all concentrations. Only a limited increase in the cell viability was achieved in 10nm TiO2NPs-exposed neurons by pretreatment with neopterin. Whereas, neopterin could not provide a constant amelioration for both 25nm and 10nm sized TiO2NPs-exposed U937 monocytic cells. TiO2NPs displayed size-dependent neuronal toxicity. In FBS-containing medium, both sizes of TiO2NPs caused reduction in cell viability of both cell lines. Conclusion: While toxicity of TiO2NPs emerged via NMDA and AMPA receptors in SH SY5Y cells, U937 cells were most probably activated by AMPA receptors only. Unlike SHSY5Y cells, NADPH oxidase complex inhibition was not effective in TiO2NPs exposed U937 cells.
  • No Thumbnail Available
    Item
    Escherichia coli'de heterolog rekombinant protein ekspresyonu sırasında oluşan stres yanıtının incelenmesi.
    (Biyoteknoloji Enstitüsü, 2013) Molla, Didem; Engin, Evren Doruk; Biyoteknoloji
    Endüstriyel, tıbbi, yaşam bilimleri gibi araştırmalarda sıklıkla kullanılan protein ve türevlerinin eldesi için kullanılan heterolog rekombinant protein üretimi, modern biyoteknolojinin en önemli araçlarından birisidir. Bakteriyel ekspresyon sistemleri, kullanım kolaylığı ve düşük maliyeti nedeniyle tercih edilen sistemlerdir. Ancak, heterolog rekombinant protein sentezinin indüklenmesi, bakteri hücresinin homeostazını bozan bir stres kaynağıdır. Hücrenin bu strese verdiği yanıtların izlenmesi ve protein ekspresyon koşullarının bu yanıtların en düşük düzeyde ortaya çıktığı duruma getirilmesi, bakteriyel ekspresyon sistemlerinin daha etkin kullanımı için akılcı bir yaklaşım olacaktır. Bu tez çalışmasında, sık kullanılan bakteriyel ekspresyon sistemlerinden biri olan pET sistemi ile protein üretiminin Escherichia coli (E.coli) hücreleri üzerinde yarattığı stres ve bu strese verilen yanıt incelenmiştir. Bu amaçla, yeşil floresan proteini (GFP) geni, T7 promotoru arkasına yerleştirilmiş; protein ekspresyonu 28 ve 37°C sıcaklıkta gerçekleştirilmiştir. Ekspresyon esnasında bakteri hücrelerinde oluşan stres yanıtı, groEL, rseA, cspA, uspA, uspB, grpE ve pspA stres genlerinin transkripsiyon düzeylerinin ölçümü, floresan mikroskopi ile GFP sentezleyen toplam hücre kitlesi ve inklüzyon cismi oluşumunun değerlendirilmesi ile takip edilmiştir. Ayrıca, her iki sıcaklıkta indüklenen kültürlerden izole edilen çözünür haldeki proteinlerin elektroforetik bant profilleri, aynı kültürlerden saflaştırılamayan inklüzyon cismi fraksiyonu ile karşılaştırılmıştır. Düşük sıcaklıkta indüklenen kültürlerden, deneyin başlangıcında daha hızlı GFP ifadelenmesi ve inklüzyon cismi oluşumu gözlenmiş, ancak inkübasyon sonlandırıldığında daha az miktarda çözünür protein izole edilebildiği saptanmıştır. Bu kültürlerde groEL, rseA, cspA, uspA, uspB ve pspA transkripsiyonunun ilk bir saat içinde, grpE'nin ise dördüncü saatte, 37°C kültürlerine göre daha yüksek seyrettiği saptanmıştır. Düşük sıcaklıkta T7 promotoru ile indüksiyonun, hücrenin translasyonel sistemini doyurarak şaperon yetmezliğine yol açtığı, böylece 37°C kültürlerine göre daha az çözünür protein üretimine neden olduğu düşünülmektedir.
  • No Thumbnail Available
    Item
    Özgün bir ışık kontrollü T7-promotoru-GFP ifade sisteminin geliştirilmesi ve GFP ifadesinin incelenmesi
    (Biyoteknoloji Enstitüsü, 2019) Soydemir, Ege; Engin, Evren Doruk; Other
    Mikrobiyal biyoteknolojinin önemli alanlarından biri sentetik biyoloji ve genetik mühendisliği araçları kullanılarak mikrobiyal hücre fabrikaları ile rekombinant protein üretimidir. Sentetik biyoloji araçları birçok vektör ve genetik devreyi içermektedir. Bu çalışmada pDawT ve pATG adı verilen iki farklı genetik mühendisliği aracı olan vektör üretilmiş ve test edilmiştir. Bu iki vektör aynı mikrobiyal hücre içerisine ko-transforme edilip pDawT+pATG genetik devresi tamamlanmıştır. pDawT plazmidinden T7 RNA polimeraz enzimi ~400nm uzun dalga UV ışığı indüklenmesi ile üretilmekte ve üretilen T7 RNA polimeraz, pATG plazmidi üzerinde bulunan PT7 promotorundan, bu promotorun kontrol ettiği genin transkripsiyonunu başlatmaktadır. Bu çalışmada E. coli DH5α bakterisinde, PT7 kontrolünde EGFP üretilmiş ve hücreler FITC filtresinde floresan mikroskop ile görüntülenmiştir. Görüntülenen hücrelerin RGB ve HSV piksel yoğunluğu ve dağılımı analiz edilmiş ve karşılaştırılmıştır. Üretilen pDawT+pATG genetik devresi ile birçok farklı bakteri veya mayada kullanılabilecek özgün bir optokontrollü rekombinant protein üretim aracı üretilmiştir.
  • No Thumbnail Available
    Item
    Quorum sensing in Escherıcıa coli'de antimikrobiyal direncinden sorumlu mutasyonların oluşumundaki rolünün araştırılması
    (Biyoteknoloji Enstitüsü, 2014) Öztürk, Aslınur Gülnaz; Engin, Evren Doruk; Other
  • No Thumbnail Available
    Item
    Rekombinant insan insulin peptidinin bakteriyal ekspresyon sistemi kullanarak üretimi
    (Biyoteknoloji Enstitüsü, 2015) Can, Ceren; Engin, Evren Doruk; Biyoteknoloji
    Insulin which is produced by pancreas with situated beta cells, has polypeptide structure. Insulin has 5400 daltons with a molecular weight and fifty one amino acids. Moreover the insulin hormone is the result of connected to each other by disulfide bonds of the A chains and B chains. This hormone plays a role in the regulation of blood sugar in human body. When the deterioration of the balance of blood glucose arises in the human body, it causes diabetes. This disease is seen among many people in the world, which is named such as Type 1 diabetes, Type 2 diabetes, gestational diabetes, and diabetes by specific causes. In this thesis the main goal is produced using bacterial production of human insulin producers systems for therapeutic, use recombinant DNA technology. Therefore, they are vectors encoding the entire sequence of the insulin gene have been created. The generated vectors used for the production bacteria system, transferred to the Escherichia coli, K12-JM109 and BL21 (DE3) cells and they are used for protein production. After that the protein production and purification have been optimized with the detailed study.
  • No Thumbnail Available
    Item
    Yeşil floresan protein ifadeleyen escherichia coli hücre fabrikalarda fenotipik heterojenitenin adaptasyona etkisi
    (Biyoteknoloji Enstitüsü, 2021) Ertüzün, Seniha Gözde; Engin, Evren Doruk; Other
    Gelişen Biyoteknoloji uygulamalarının getirdiği en büyük katkılardan biri heterolog protein üretimidir. Sentetik biyoloji ve genetik mühendisliği sayesinde heterolog protein eldesi için kolay manipüle edilebilen, hızlı, düşük maliyetli ve yüksek verimli mikrobiyal hücre fabrikaları üretimi mümkün hale gelmiştir. Mikrobiyal hücre fabrikalarından elde edilen birçok kimyasal ve bileşen, endüstriyel ve sağlık sektörleri başta olmak üzere birçok alanda rol almaktadır. Hücre fabrikaların oluşturulmasında kullanılmak üzere kurgulanan hücrelerin gürbüz, yüksek biyokütle ve verime sahip olmalarının yanında ürettikleri peptidlerin fonksiyonel ve çözünür nitelikte olmaları büyük önem taşır. İfadelenecek gen her ne kadar rasyonel tasarımlarla hücreye aktarılmış olsa da hücre bankalarının istenilen özelliklerde oluşturulması büyük ölçüde evrimsel süreçler ile mümkün olmaktadır. Bu tez çalışmasında, T7 promotörü kontrolünde yeşil floresan protein üreten ΔrecA ve ΔmutS genotipe sahip E. coli hücre fabrikaları elde edilmiştir. Hücrelerin düşük ve yüksek heterolog rekombinant protein ifade heterojenitesi gösterdikleri fermantasyon koşulları optimize edilmiş ve bu koşullarda pasajlar boyunca indüklenen kültürlerin proteomik ve genomik parmak izi profillemesi yapılmıştır. Böylece, genetik olarak stabil ΔrecA bakteriler ile nokta mutasyonlar geliştirmeye yatkın ΔmutS hücre fabrikalarının adaptasyon hızları karşılaştırılmıştır.