Escherichia coli'de heterolog rekombinant protein ekspresyonu sırasında oluşan stres yanıtının incelenmesi.
No Thumbnail Available
Date
2013
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Biyoteknoloji Enstitüsü
Abstract
Endüstriyel, tıbbi, yaşam bilimleri gibi araştırmalarda sıklıkla kullanılan protein ve türevlerinin eldesi için kullanılan heterolog rekombinant protein üretimi, modern biyoteknolojinin en önemli araçlarından birisidir. Bakteriyel ekspresyon sistemleri, kullanım kolaylığı ve düşük maliyeti nedeniyle tercih edilen sistemlerdir. Ancak, heterolog rekombinant protein sentezinin indüklenmesi, bakteri hücresinin homeostazını bozan bir stres kaynağıdır. Hücrenin bu strese verdiği yanıtların izlenmesi ve protein ekspresyon koşullarının bu yanıtların en düşük düzeyde ortaya çıktığı duruma getirilmesi, bakteriyel ekspresyon sistemlerinin daha etkin kullanımı için akılcı bir yaklaşım olacaktır. Bu tez çalışmasında, sık kullanılan bakteriyel ekspresyon sistemlerinden biri olan pET sistemi ile protein üretiminin Escherichia coli (E.coli) hücreleri üzerinde yarattığı stres ve bu strese verilen yanıt incelenmiştir. Bu amaçla, yeşil floresan proteini (GFP) geni, T7 promotoru arkasına yerleştirilmiş; protein ekspresyonu 28 ve 37°C sıcaklıkta gerçekleştirilmiştir. Ekspresyon esnasında bakteri hücrelerinde oluşan stres yanıtı, groEL, rseA, cspA, uspA, uspB, grpE ve pspA stres genlerinin transkripsiyon düzeylerinin ölçümü, floresan mikroskopi ile GFP sentezleyen toplam hücre kitlesi ve inklüzyon cismi oluşumunun değerlendirilmesi ile takip edilmiştir. Ayrıca, her iki sıcaklıkta indüklenen kültürlerden izole edilen çözünür haldeki proteinlerin elektroforetik bant profilleri, aynı kültürlerden saflaştırılamayan inklüzyon cismi fraksiyonu ile karşılaştırılmıştır. Düşük sıcaklıkta indüklenen kültürlerden, deneyin başlangıcında daha hızlı GFP ifadelenmesi ve inklüzyon cismi oluşumu gözlenmiş, ancak inkübasyon sonlandırıldığında daha az miktarda çözünür protein izole edilebildiği saptanmıştır. Bu kültürlerde groEL, rseA, cspA, uspA, uspB ve pspA transkripsiyonunun ilk bir saat içinde, grpE'nin ise dördüncü saatte, 37°C kültürlerine göre daha yüksek seyrettiği saptanmıştır. Düşük sıcaklıkta T7 promotoru ile indüksiyonun, hücrenin translasyonel sistemini doyurarak şaperon yetmezliğine yol açtığı, böylece 37°C kültürlerine göre daha az çözünür protein üretimine neden olduğu düşünülmektedir.
Description
Keywords
Escherichia coli, heterolog rekombinant protein