İnsan lösemi monosit hücrelerinin forbol-12-miristat-13-asetat ile makrofaj benzeri hücrelere farklılaşması

Abstract

Bu çalışmada monositlerden makrofaja farklılaşmada Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA)’nın uygulama zamanı ve dozuna yönelik uygun bir model oluşturulması amaçlanmıştır. Bu amaçla insan lösemi monosit hücre hattı (THP-1) farklı doz ve uygulama sürelerinde PMA ile uyarılarak hücrelerin makrofaja farklılaşmaları morfolojik olarak gösterilmiş ve hücre canlılığı üzerine etkileri değerlendirilmiştir. Gereç ve THP-1 monosit hücreleri 6 kuyucuklu plaklarda 2x105 /mL hücre olacak şekilde süspanse olarak üretilmiştir. Daha sonra üzerlerine %10 FCS içeren RPMI 1640 ile 10, 20, 40 ve 60 ng/mL konsantrasyonlarda sulandırılan PMA ilave edilerek, 24, 48 ve 72 saat inkübe edilmiştir. Süspanse THP-1 monosit hücrelerin yapışan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşması, doku kültürü mikroskobunda hücre kültürü plaklarına tutunma ve fenotipik değişikliklerin gözlenmesi ile doğrulanmıştır. Canlı hücreler tripan mavisi boyama yöntemi ile belirlenmiştir. THP-1 hücreleri için fenotipik değişiklikleri ve hücre canlılığı açısından elde edilen en iyi sonuçlar 20 ng/mL PMA konsantrasyonu ve 48 saat inkübasyon süresi olarak saptanmış, bu konsantrasyon ve inkübasyon süresinde hücre canlılığı %92,2 olduğu bulunmuştur. 40 ng/mL PMA uygulaması 48. saatte 10 ve 20 ng/mL PMA uygulamasına göre hücre sayısında belirgin azalmaya neden olurken 72. saat uygulaması sonrası gruplar arasında fark görülmemiştir. Bu sonuçlar in vitro makrofaj modellerinin gerçek fizyolojik şartları tam olarak yansıtması için THP-1 monositlerinin makrofaja farklılaşmasının optimize edilmesi gerekliliğini göstermektedir. Bu çalışmada en iyi hücre farklılaşmasının THP-1 hücrelerine 20 ng/mL PMA eklenmesi ve bu hücrelerin 48 saat inkübasyona bırakılması ile ortaya çıktığı sonucuna varılmıştır.

In this study, it was aimed to evaluate appropriate model of application time and dosage of Phorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA) to get activated macrophages from monocytic cell line THP-1 cells. The differentiation of THP-1 cells into macrophages when stimulated with different dosage and application time of phorbol myristic acid (PMA) was shown morphologically and the effects on cell viability were evaluated. THP-1 cells were produced as suspension as 2x105 cells/mL in 6-well plates. Afterwards, THP-1 monocyte cells were treated with PMA of 10, 20, 40, 60 ng/mL concentrations and incubated for 24, 48 and 72 hours. Differentiation of suspended THP-1 cells into adherent macrophage-like cells was confirmed by tissue-culture microscope by observing cell adherence to cell culture flasks and phenotypic changes. Cell viability was determined by trypan blue staining. The best results for phenotypic changes and cell viability for THP-1 cells were obtained with 20 ng/mL PMA at 48h incubation time and the cell viability was detected as 92.2%. The administration of 40 ng/mL PMA resulted in a significant decrease in cell count compared to 10 and 20 ng/ml PMA administration at the 48h, but no difference was observed between groups after 72h application. These findings show that the differentiation of THP-1 monocytes into macrophages needs to be optimized in order to reflect the real physiologic conditions of macrophage models used in in vitro studies. These findings suggest that THP-1 cells are well differentiated by 20 ng/mL PMA at 48h incubation.