Sülfonamidleri içeren farmasötik preparatlardaki etkin maddelerin cevap yüzey metodolojisine dayanan aşırı performanslı sıvı kromatografisi ile miktar tayinleri

Abstract

Bu doktora tezinde, trimetoprim ve sülfonamidleri içeren veteriner preparatların kantitatif analizi için yeni aşırı performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) yöntemleri geliştirilmiştir. Bu kapsamda sülfadiazin-trimetoprim, sülfadoksin-trimetoprim ve sülfadimidin-trimetoprim kombinasyonları araştırma konusu olarak seçilmiştir. UPLC yöntemlerinin geliştirilmesinde cevap yüzey metodolojisinden yararlanılmıştır. Optimizasyon süreçlerinde dar taban genişliğini ve etkin kromatografik ayrımı en kısa sürede sağlayan deneysel koşulların belirlenmesi için tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli olmak üzere farklı deney tasarımları kullanılmıştır. Bu amaçla, cevap yüzey metodolojisindeki bağımlı değişken olarak literatürde daha önce tanımlanmış bir kromatografik cevap fonksiyonu seçilmiştir. Cevap yüzey metodolojisi gerçek optimal koşulların belirlenmesinin yanı sıra, faktörlerin ve faktör etkileşimlerinin cevap üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini sağlamıştır. Sülfadiyazin ve trimetoprimin analizi için yöntem geliştirme basamağında optimize edilecek üç kromatografik parametre seçilmiştir: kolon sıcaklığı, hareketli fazdaki tampon oranı ve akış hızı. Faktörlerin ve faktör etkileşimlerinin cevap üzerindeki etkilerini incelemek ve optimal kromatografik şartların belirlenmesi için tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlar kullanılmıştır. Tam faktöriyel ve Box-Behnken tasarımlarla hesaplanan optimal faktör seviyeleri kolon sıcaklığı için 38,9 °C, sodyum format tamponunun hareketli fazdaki oranı için %69,8 ve akış hızı için 0,26 mL/dk'dır. Diğer yandan, merkezi bileşenli tasarım ile belirlenen optimal kromatografik koşullar 44,9 °C kolon sıcaklığı, hareketli fazda %70,6 sodyum format tamponu ve 0,30 mL/dk akış hızıdır. Sülfadiyazin ve trimetoprim içeren tabletlerin analizi için bu optimal koşullar kullanılarak her ikisi de 2 dakikalık analiz süresine sahip olan iki farklı UPLC yöntemi geliştirilmiştir. Optimize edilen bu UPLC yöntemleri, validasyon ve sitem uygunluk parametrelerinin değerlendirilmesinden sonra, veteriner amaçlı tabletlerdeki sülfadiyazin ve trimetoprimin miktar tayinleri için başarıyla uygulanmışlardır. Sülfadoksin ve trimetoprimin miktar tayini için UPLC yönteminin geliştirilmesi sırasında bağımsız değişken olarak kolon sıcaklığı, tamponun pH değeri, hareketli fazdaki tampon yüzdesi ve akış hızı olmak üzere dört kromatografik parametre seçilmiştir. Bu parametrelerin optimal değerlerinin tayini için Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlar kullanılmıştır. Box-Behnken tasarımla elde edilen optimal koşullar kolon sıcaklığı için 56,8°C, sodyum asetat tamponunun pH değeri için 4,48, hareketli fazdaki sodyum asetat tamponunun yüzdesi için %55,6 ve akış hızı için 0,20 mL/dk olmuştur. Merkezi bileşenli tasarım ise farklı koşulların optimal olarak belirlenmesini sağlamıştır: 31,2 °C kolon sıcaklığı, %49,3 sodyum asetat tamponu (pH 3,89) ve 0,23 mL/dk akış hızı. Bu koşullar kullanılarak geliştirilen UPLC yöntemleri, 1,8 dakika içinde sülfadoksin ve trimetoprimin kromatografik ayrımını sağlamışlardır. Optimal olarak saptanan kromatografik koşullar birbirinden farklı olsa da, her iki yöntemle de birbirine benzer kromatogramlar elde edilmiştir. Optimize edilen bu yöntemlerin geçerlilikleri, sistem uygunluk parametreleri ve analitik validasyon testleri ile kanıtlanmıştır. Valide edilmiş bu optimal yöntemler, sülfadoksin ve trimetoprim içeren veteriner amaçlı enjeksiyonluk çözelti preparatlarının analizine başarıyla uygulanmışlarıdır. Sülfadimidin ve trimetoprimin analizinde optimize edilecek üç kromatografik faktör seçilmiştir: kolon sıcaklığı, hareketli fazdaki inorganik bileşenin yüzdesi ve akış hızı. Faktörlerin cevap üzerindeki etkisinin yorumlanması ve her bir faktörün optimal değerinin belirlenmesi için tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlardan yararlanılmıştır. Tam faktöriyel, Box-Behnken ve merkezi bileşenli tasarımlarla sırasıyla kolon sıcaklığı için 48,5 °C, 43,0 °C, 60,8 °C, hareketli fazdaki amonyum karbonat oranı için %53,6, %55,4, %52,0 ve akış hızı için 0,27 mL/dk, 0,27 mL/dk, 0,26 mL/dk değerleri optimal olarak saptanmıştır. Bu optimal kromatografik koşullar kullanılarak geliştirilen üç farklı UPLC yöntemi ile sülfadimidin ve trimetoprimin analizi 1,5 dakika içinde gerçekleştirilmiştir. Tayin edilen kromatografik koşulların sayısal değerleri birbirinden farklı olsa da, her üç yöntemle de benzer kromatogramlar elde edilmiştir. Sistem uygunluk ve analitik validasyon parametrelerinin değerlendirilmesinden sonra, geliştirilen UPLC yöntemleri, veteriner amaçlı enjeksiyonluk çözeltilerdeki sülfadimidin ve trimetoprimin miktar tayinleri için başarıyla uygulanmışlardır. Bu doktora tez çalışması, cevap yüzey metodolojisinin UPLC yöntemlerinin optimizasyonu için etkin bir yaklaşım olduğunu göstermiştir. Deney tasarımının seçimi, her bir parametre için optimal olarak saptanan değerleri etkilese de, bu optimal koşulların birlikte kullanımıyla elde edilen kromatografik çıktıyı kayda değer biçimde etkilememiştir. Bunun yanında, deney tasarımının seçimi deney sayısı ve deneysel çalışmaların süreci üzerinde oldukça etkili olmuştur. Bu çalışmada geliştirilen tüm yöntemlerin, seçilmiş veteriner preparatların analizi için uygun olduğu belirlenmiştir.