Periferik sinir yaralanması sıçan modelinde ekstraselüler matriks ve büyüme faktörlerinin sinir rejenerasyonuna etkisinin stereolojik ve histolojik olarak incelenmesi
Özet
Periferik sinirler hasar sonrası rejenere olma kapasitesine sahip olmakla birlikte ortamda bulunan Schwann hücrelerinin, büyüme faktörlerinin ve ekstraselüler matriks elemanlarının birbiriyle etkileşimi iyileşmede önemli bir rol oynamaktadır. Periferik sinir kesi hasarlarının tedavisinde altın standart kesik sinir uçlarının uç uca getirilerek dikilmesidir. Ancak sinir iyileşmesini artırma potansiyeline sahip dikişe ek olarak uygulanabilecek tedavi yöntemleri ile ilgili çalışmalar yoğun olarak devam etmektedir. Biz de çalışmamızda iyi bir fonksiyonel ve morfolojik geri kazanım elde edebilmek amacıyla literatürde daha önce ayrı ayrı kullanılarak sinir iyileşmesine etkileri gösterilen, ekstraselüler matriks elemanlarının sinir iyileşmesini inhibe edici etkisini azaltan kondroitinaz ABC (ChABC) enzimi ile akson büyümesini uyaran çeşitli büyüme faktörlerini içeren plateletten zengin plazma'nın (PRP) tek tek ve literatürde daha önce denenmemiş kombine uygulamalarının etkilerini araştırmayı amaçladık. Çalışmamızda 5 grup içinde toplam 40 adet 12 haftalık Wistar albino ratlar kullanıldı. Siyatik sinir hasarı bütün gruplarda sol tarafta dallanma bölgesinin 1 cm proksimalinden mikro makasla transvers kesi yapılarak oluşturuldu. Kesi grubu haricindeki gruplarda sinir onarımı aynı cerrah tarafından primer epinöral anastomoz (PEA) yapılarak gerçekleştirildi. Gruplar ve uygulamalar şu şekildeydi; Kesi grubu: PEA ile sinir onarımı yok; Salin grubu: PEA bölgesine 0,125 ml Salin uygulaması; Ch grubu: PEA bölgesine 2U/0,125ml ChABC uygulaması; PRP grubu: PEA bölgesine 0,125 ml PRP uygulaması; Ch+PRP grubu: PEA bölgesine kombine 2U/0,125 ml ChABC+ 0,125 ml PRP uygulaması. PRP uygulanan gruplara ait birer rattan cerrahi işlemden önce intrakardiyak kan alınarak iki aşamalı santrifüj işleminden geçirildi ve PRP elde edildi. Kan alınan ratlar deney dışı bırakıldı. 12 haftanın sonunda siyatik sinir dokuları perfüzyon fiksasyon ile sütur hattının merkezini ve distalini içerecek şekilde çıkarıldı. Her iki bölgeden ışık ve elektron mikroskobik inceleme için alınan örnekler %10 tamponlu formalin ve %2,5 gluteraldehit ile fikse edildikten sonra rutin takip işlemlerinden geçirildi. Sütur hattının merkezinden ve distalinden alınan parafin kesitler hematoksilin-eozin ve Mallory azan ile boyandı. Distal bölgeden alınan kesitler ayrıca Schwann hücreleri için anti-S-100 ve rejenere aksonlar için anti GAP-43 antikorları kullanılarak immünohistokimyasal olarak işaretlendi. Araldit bloklardan alınan yarı ince kesitler ise Toluidin mavisi ile boyandı. Parafin ve yarı ince kesitler Leica DM 500 ışık mikroskobuna bağlı Leica ICC50HD kamera ile inceleme sonrası fotoğraflandı. Hem distal hem de merkez bölge yarı ince kesitlerinde toplam miyelinli lif sayısı ve dejenere lif sayısı fraksiyonlama probu ile; distal bölge yarı ince kesitlerinde ise lif alanı, akson alanı, miyelin alanı, lif çapı, akson çapı ve miyelin kalınlığı nucleator probu ile stereoloji yazılımı (StereoInvestigator, MBF Bioscience) kullanılarak belirlendi. g-ratio (akson çapı/lif çapı) değerleri de hesaplandı. Fonksiyonel iyileşmeyi değerlendirmek için ratlara pre-op, post-op 6. ve 12. Haftalarda yürüme yolu testi yapıldı ve siyatik fonksiyon indeksi (SFI) belirlendi. Elde edilen SFI değerleri ile stereolojik sayım ve ölçüm verileri istatistiksel olarak IBM SPSS 22 programı kullanılarak değerlendirildi. p<0,05 değeri anlamlı kabul edildi. Bütün deney gruplarında epinöryum ve perinöryum içinde yanlış yönlenmiş rejeneratif akson filizleri ile endonöryum içinde miyelin debrisi fagosite eden makrofajlar ve Schwann hücreleri, damar komşuluğunda mast hücreleri izlendi. Kontrolle kıyaslandığında dejenere akson sayısı tüm deney gruplarında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksekken (p<0,05), deney grupları kendi aralarında kıyaslandığında anlamlı bir fark bulunmadı. Kontrolle kıyaslandığında toplam miyelinli lif sayısı CH+PRP grubu merkez bölgesinde istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksekti (p<0,05). Deney gruplarının distal bölgelerindeki miyelinli aksonların lif çapı, akson çapı, miyelin kalınlığı ve g-ratio değerleri kontrolle kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük olarak bulundu (p<0,05). SFI sonuçları 6 ve 12. hafta sonunda pre-op döneme göre tüm gruplarda fonksiyon yokluğu veya azlığını ifade edecek şekilde düşüktü ve fark istatististiksel olarak anlamlıydı (p<0,05). Makroskobik olarak kesi hasarı yapılan sol ekstremitede parmak kayıplarının izlenmesi tüm deney gruplarında yarı ince kesitlerde duyu liflerini oluşturan miyelinsiz aksonların gözlenmemesi nedeniyle miyelinli liflere göre duyu liflerindeki hasarın daha yoğun olduğunu düşündürdü. Sonuç olarak bu çalışmada, cerrahi tedaviye ek olarak uygulanan ChABC ve ChABC+ PRP'nin lokal uygulanmasının kesi bölgesi merkezinde akson filizlenmesini artırarak sinir rejenerasyonuna olumlu katkısı olduğu görüldü. Kesi bölgesinin distalinde ince miyelinli ve küçük çaplı aksonların varlığı ile SFI değerlerinin pre-op döneme göre düşük olmasına bağlı olarak sinir rejenerasyonunun 12. hafta sonunda hala devam ettiği sonucuna varıldı.