Hipoksik ve normoksik ortam şartlarında osteojenik nesile farklılaştırılmış insan adipoz kökenli mezenkimal kök hücrelerin gen/mikrorna ifade profillerinin karşılaştırmalı analizi
Özet
Hücresel tedaviler kapsamında, kök hücrelerin in vitro çoğaltılma ve farklılaştırma işlemlerinin gerçekleştirildiği ortamın oksijen düzeyine bağlı olarak, hücre çoğalma dinamiğinde, elde edilen hücresel ürünün özelliklerinde ve transplantasyon sonrası etkinlik düzeyi bakımından farklı sonuçlara ulaşıldığı rapor edilmektedir. Sunulan tez çalışmasında hipoksik ve normoksik şartlar altında karşılaştırmalı olarak insan yağ doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin karakteristik özellikleri ve osteojenik nesile farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi amaçlanmıştır.Yapılan çalışmada insan yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücreler hem normoksik (%20 O2) hem de hipoksik (%2 O2) ortam koşullarında kültüre edildi. Kültüre edilen hücrelerin mezenkimal kök hücre karakteri taşıdığı akım sitometri bulguları, soy analizi ve mikroskop görüntüleri ile gösterildi. Hücreler %70-80 bolluğa ulaştıklarında osteojenik farklılaştırma besiyerine geçildi. Osteojenik farklılaşma alkalin fosfataz aktivesi (ALP) ve Ca+2 tayini, immunohistokimya (OSC, BSP) ve histokimya (von Kossa, Alizarin kırmızısı) boyamaları ile tespit edildi. Belirlenen zaman noktalarında (7., 14., 21., 28. gün) hücre kültürlerinden total RNA izolasyonu gerçekleştirildi. RNA izolasyonundan sonra cDNA sentezi yapılarak hücrelerin miRNA ekspresyon seviyeleri RT-PCR kullanılarak analiz edildi.Çalışma sonucunda kültüre edilen hücrelerin hem hipoksik hem de normoksik ortam şartlarında mezenkimal kök hücre karakteri taşıdığı yapılan analizler ile gösterildi. Yapılan osteojenik farklılaşma sonucunda her iki ortamda histokimya ve immunohistokimya boyamaları pozitif olarak görülse de hipoksik ortamda günlere bağlı olarak bir azalma gözlenmiştir. Hücrelerde her iki ortamda da ALP aktivitesi 14.günden sonra düşmüştür. Ca+2 analizi sonucunda da 7.günden itibaren bir düşüş gözlenmiştir. Belirlenen zaman noktalarında gerçekleştirilen RNA izolasyonunda, RNA miktarlarının ve saflığının çalışma için yeterli olduğu görülmüştür. Yapılan miRNA analizi sonucunda miR106, miR148b, miR26a ve miR22 ekspresyonlarının hipoksik koşullarda arttığı gözlenmiştir. Sonuç olarak hipoksik ortamda miRNA ekspresyonunundaki artışın osteojenik farklılaşmayı baskıladığı düşünülebilir.