Bazı laktik asit bakterilerinde 16s rdna dizi analizi ve 16s-23s rdna ara bölge (ısr) temel alınarak gerçekleştirilen filogenetik analizler
Abstract
Laktik asit bakterilerinin (LAB) endüstriyel uygulamaları düşünüldüğünde, araştırmaların en temel amacı kullanılabilecek olan LAB suşlarının seçimidir. Suş bazında güvenilir tiplendirme yöntemleri hem LAB starter kültürlerin performanslarının incelenmesinde hem de fonksiyonel gıda ürünlerinde katkı maddesi olarak kullanılacak olan kültürlerin incelenmesinde önem kazanmaktadır. Bu nedenle, herhangi bir suşun spesifik ve belirgin olarak ayrımını sağlayan güvenilir yöntemlerin uygulanması oldukça önemlidir. Günümüzde, LAB tanımlama/tiplendirme çalışmaları ilgi odağı olan fenotipik yöntemlerden daha kesin ve hassas sonuçlar veren moleküler yöntemlere (genotipik) doğru kaymıştır. Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Mikrobiyal Genetik laboratuarımızdaki kültür koleksiyonunda mevcut bulunan Laktik Asit Bakterilerine ait 148 adet suşun tanımlanması daha önceki çalışmalarda fenotipik testlerin kullanımı ile yapılmıştır. Çalışmamızda, bu 148 adet suşun tür/tür içi ayrımında ise 16S- rDNA dizi analizinin ve 16S-23S ISR (internal spacer region) RFLP tekniğinin taksonomik potansiyelinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Çalışmamızda; öncelikli olarak 16S rDNA bölgelerine özgü primerler [pB (50-70) (5’TAA CAC ATG CAA GTC GAA CG)3’ve 1492 R (5’ TAC CTT GTT ACG ACT T 3’)] kullanılarak PZR işlemi gerçekleştirilmiş ve 16S rDNA PZR ürününün saflaştırılması neticesinde dizi analizinden elde edilen veriler uygun veri bankaları ile kıyaslanarak sonuçlar Laktik Asit Bakterilerine ait bu suşların tek bir basamak ile tanımlamasında kullanılmıştır. Bununla beraber aynı suşlara ait 16S-23S ISR (internal spacer region) gen bölgesi evrensel primerlerin [G1 5’ GAAGTCGTAACAAGG 3’ ve L1 5’ CAAGGCATCCACCGT 3’] kullanımı ile amplifiye edilerek AluI, DdeI, HaeIII, HinfI, SspI, DraI, VspI ve TaqI gibi değişik restriksiyon endonükleazların kullanımı ile RFLP analizine tabi tutulmuştur. Bant paternlerine ait görüntüler daha ileriki analizlerde kullanılmak üzere GelCompare II, Version 4,1 (AppliedMath) bilgisayar yazılım programına aktarılmıştır. Bantların arasındaki benzerlik ise “Dice product moment correlation coefficient” ile ifade edilip % değerine dönüştürüldükten sonra UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) analizi ile kümeleme (clustering) işlemi yapılmış ve neticede türler/suşlar arasındaki genetik benzerlik dendogram olarak gösterilmiştir. Kümeleri birbirinden ayırt etmek için korelasyon katsayısı %90 olarak belirlenmiştir. Kullanmış olduğumuz restriksiyon enzimlerine bağlı olarak tür/suş seviyesinde birbirleri ile oldukça yakın ilişkide bulunan LAB suşlarının ayrımında bu tekniğin ayrım gücü son derece başarılı bulunmuştur. Örneğin VspI enzimi sadece Pediococcus türlerinde kesim yapmıştır. Bununla beraber, ISR-RFLP tekniğinin en büyük limitasyonu birbirine oldukça yakın türler arasında benzer profiller yansıtmasıdır.