BEHÇET HASTALARI VE SAĞLIKLI KONTROLLERDE AĞIZ EPİTEL HÜCRELERİNİN ANTİBAKTERİYEL ETKİNLİĞİNDE BETA DEFENSİNLERİN (HBD-1, HBD-2 VE HBD-3) ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI

Abstract

Behçet hastalığı (BH), tekrarlayıcı oral aftlar, genital ülserler, deri lezyonları ve üveyit ile karakterize, sistemik, inflamatuar bir hastalıktır. Behçet hastalarında, oral epitel hücrelerinin antibakteriyel etkinliğinde sağlıklı kontrollere kıyasla azalma olduğu tespit edilmiş, ancak bu azalmanın mekanizması açıklanamamıştır. Beta defensinler, çeşitli mukozalarda eksprese olan ve konağın infeksiyöz patojenlere karşı ilk savunmasında rol alan antimikrobiyal etkili peptidlerdir. Çeşitli oral patolojilerde beta defensin ekspresyonunun azaldığı veya antibakteriyel etkinliğinin değiştiği gösterilmiştir. Bu çalışmada, Behçet hastalarında oral patojenlere karşı azaldığı gösterilen konak savunmasında, ağızda eksprese olduğu bilinen, insan beta defensinleri (HBD)-1, -2 ve -3’ün ekspresyonunda bir değişiklik olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca, HBD-1 geni üzerinde tanımlanmış ve özellikle kistik fibrozis gibi solunum sistemini ilgilendiren hastalıklarda enfeksiyonlara yatkınlıkla ilişkili olabileceği öngörülen polimorfizmlerin Behçet hastaları ile sağlıklı kontroller arasında görülme sıklığında fark gösterip göstermediği de araştırılmıştır. Literatürde Behçet hastalarında bu konuda yapılmış çalışma bulunmamaktadır. Bu amaçla, aktif ve inaktif Behçet hastaları ile sağlıklı kontrollerden tükürük ve polimorfizm araştırması için kan örnekleri alınmıştır. Tükürükten elde edilen oral epitel hücrelerinden mikroorganizma (S. pyogenes ve P. aeruginosa) ile uyarım öncesinde ve uyarım sonrası üçüncü saatte bakterisidal etkinin değerlendirilmesi için seri sulandırımlar yapılarak kanlı agara pasaj yapılmış, ayrıca beta defensin (HBD-1, -2, ve -3) ekspresyonlarının değerlendirilmesi amacıyla RNA ekstrakte edilmiştir. Kantitatif beta defensin ekspresyon analizi, LightCycler cihazı (Roche, Almanya) kullanılarak gerçek zamanlı PZR (real time PCR) analizi ile yapısal gen seti kontrol olarak kullanılarak yapılmıştır. Polimorfizm değerlendirmesi, PZR-enzimle kesim yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.Kontrol grubunda yer alan bireylerden yapılan hazırlık çalışmalarında, ağız epitel hücrelerinin P. aeruginosa ile uyarımında herhangi bir antibakteriyel etkinlik sergilemediği görülmüş, bu nedenle çalışmanın sonraki kısımlarında P. aeruginosa ile uyarım yapılmamıştır. S. pyogenes ile yapılan uyarım sonucunda 3. saatte yaklaşık %94’lük bir bakterisidal etki tespit edilmiş, bu nedenle kontrol hasta gruplarının ağız epitel hücrelerinin bakterisidal aktivitesi ve defensin ekspresyonları uyarım öncesinde ve uyarım sonrası üçüncü saatte çalışılmıştır. Elde edilen sonuçlar, hasta gruplarının (aktif ve inaktif Behçet hastaları) ağız epitel hücrelerinin bakterisidal etkisinin daha yüksek olduğunu (%96) göstermiş, ancak kontrol ve hasta grupları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.Uyarım öncesi ve uyarım sonrası üçüncü satte, kontrol ve hasta gruplarında HBD-1 ekspresyonları gözlenmemiş, değişen derecelerde HBD-2 ve -3 ekspresyonu gözlenmiştir. HBD-2 ve -3 ekspresyonları kontrol ve hasta gruplarında bireysel farklılıklar göstermekle birlikte, ortalamaları karşılaştırıldığında gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark izlenmemiştir.HBD-1 geni polimorfizmleri (HBD-1 geni ekzon 1’de 5’ UTR bölgesinde yer alan -52 G/A, -44 G/C, -20 G/A polimorfizmleri ve ekzon 2 3’UTR’de yer alan +5 G/A polimorfizmi) hasta ve kontrol gruplarında karşılaştırıldığında; -52GA (p<0.001) ve -44GG (p=0.005) genotiplerinin hasta grubunda kontrollere kıyasla daha sık olduğu görülmüştür. Allel sıklıkları karşılaştırıldığında, -52A (p=0.039) ve -44G (p<0.001) allellerinin Behçet hastalarında kontrollere kıyasla anlamlı olarak daha sık görüldüğü bulunmuştur. -20G/A ve +5G/A polimorfizmlerinin sıklığı iki grup arasında anlamlı fark göstememiştir (p=0.102 ve p=0.919). Hasta ve kontrol grupları, DEFB1 geni promotor bölgesinde yer alan -52, -44 ve -20 polimorfizmlerinin oluşturduğu haplotipler açısından değerlendirildiğinde, 13 ayrı haplotip tespit edilmiştir. Bu haplotiplerin iki grup arasındaki dağılımı karşılaştırıldığında, GG/GG/GG haplotipinin kontrol grubunda (p=0.001, OR =9.31), GA/GC/GA haplotipinin ise hasta grubunda (p=0.01, OR=3.11) daha sık görüldüğü anlaşılmıştır. Diğer haplotipler açısından gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark tespit edilmemiştir. Sonuçlarımız, Behçet hastalarında oral epitel hücrelerinin bakterisidal etkinliğinin kontroller kadar yüksek olduğunu, ancak uyarım sonrası üçüncü saatte tespit edilen bakterisidal etkiden beta defensinlerin ekspresyonunun sorumlu olmadığını göstermektedir. Diğer inflamatuar proteinler (inflamatuar sitokinler vb) ve hücreler (nötrofiller) bu etkide rol oynuyor olabilir. Bununla birlikte, HBD-1 ekspresyonu üzerine etkili olduğu bilinen polimorfizmlerin sıklıkları hasta ve kontrol gruplarında karşılaştırıldığında, genotipik ve haplotipik farklılıklar tespit edilmiştir. Bu farkların HBD-1 ekspresyonu üzerine etkileri ve Behçet hastalığındaki rolleri üzerine daha kapsamlı çalışmaların yapılması uygundur.