Türkiye'de şap viruslarının tanı ve tiplendirilmesinde multipleks RT-PCR tekniği geliştirilmesi ve tanısal değerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Türkiye'de şap virusu saha izolatlarının moleküler tanısı ve tiplendirilmesi için multipleks RT-PCR tekniği geliştirilmesi amaçlandı. Bu amaçla, 2006-2008 yıllarına ait toplam 272 adet şap virusu enfekte tanı materyali ile 1999-2001 yıllarında şap hastalığı odaklarından gönderilerek, Şap Enstitüsü rutin tanı faaliyetleri sonucunda Asia-1 yönünden pozitif olarak saptanan ve Enstitü dil epitel arşivinde stoklanan 15 adet tanı materyali kullanıldı. Şap virusu genomunda VP1 ve 2AB bölgeleri hedef alınarak biri ortak (reverz primer) 3'ü şap virus serotip spesifik primerlerden oluşan multipleks PCR stratejisine yönelik primer tasarımı gerçekleştirilerek bu primerlerin kullanıldığı multipleks RT-PCR tekniği geliştirildi ve optimize edildi. Araştırmada kullanılan 272 adet saha materyali ve 15 adet Asia-1 arşiv saha materyali olmak üzere toplam 287 adet tanı materyalinin ELISA ile 131 adedi (%45.6) düzeyinde şap virusu (A,O ya da Asia-1) yönünden pozitif bulunurken, söz konusu tanı materyalinin (272 adet) geliştirilen RT-PCR protokolü ile 211 adedi (%77.5) şap virusu A, O serotipleri yönünden pozitif olarak saptandı. Elde edilen verilerin istatistik analizi sonucunda, direkt saha materyallerine uygulanan ELISA ve multipleks RT-PCR sonuçlarının arasındaki farklılık ile şap virusu O serotipi pasaj sıvılarına uygulanan ELISA ve multipleks RT-PCR sonuçlarının arasındaki farklılık önemli (p<0.05) olarak saptandı. Sonuç olarak, bu çalışmada tasarımı yapılan primerler kullanılarak uygulanan multipleks RT-PCR tekniğinin WOAH tarafından referans test olarak önerilen ELISA yöntemine göre önemli bir avantaj oluşturduğu, hızlı, güvenilir bir yöntem olduğu belirlendi. Bununla birlikte, ELISA'nın WOAH'ın kabul ettiği referans test olması göz önüne alınarak, diagnostik başarının artırılması için ELISA ile negatif olarak saptanan tanı materyaline multipleks RT-PCR uygulanması önerildi. AbstractIn this study, development of multiplex RT-PCR technique for differentiation of FMDV field isolates in Turkey was aimed. Two hundred and eighty seven FMDV infected samples collected between years, 2006-2008 and 15 archive epithelium of FMDV Asia-1 collected between years 1999-2001 and determined positive following routine diagnosis at FMD Institute constituted the material of the study. Primers (one common reverse and 3 FMDV type specific forward primers) were designed from the gene sequences VP1 and 2AB region of FMDV genome. The most appropriate primer sets were determined following in-silico (computer-based analysis) and in-vitro (laboratory PCR assays) analyses. Multiplex RT-PCR technique was developed and optimized using these novel primers. A total of 287 FMDV samples; 272 field samples (tongue epitelium) of FMDV A and O serotypes, and 15 archieved field samples of FMDV Asia -1 serotype were used in the study. Of the 287 diagnostic samples, a total of 131 (45.6%) were found to be positive in ELISA tests against the virus serotypes A, O, and Asia-1, while 211 (77.5%) out of 272 samples were positive in the novel multiplex RT-PCR protocol developed to detect A and O serotypes. Following the statistical analysis of the obtained results, significant difference (p<0.05) was detected in the results of ELISA and multiplex-PCR assays applied to direct field samples, and also to FMDV serotype O virus passage fluids. As a conclusion, multiplex RT-PCR technique performed with the originally designed primers were determined as a rapid, reliable method, and providing a significant advantage over to the ELISA method suggested as a reference test by the WOAH in the present study. Nevertheless, with the consideration of ELISA as a reference assay suggested by WOAH, investigation of ELISA negative samples with multiplex RT-PCR is suggested for the improvement of diagnostic success.