P2X7 reseptörlerinin aktive ettiği porların geçirgenlik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

P2X7 bir katyon kanalıdır ve büyük moleküllere geçirgen olan seçici olmayan büyük bir por oluşturduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, HEK-K4 (kalıcı olarak sıçan P2X7 reseptörü eksprese ettirilen) ve RAW 264.7 (endojen olarak fare P2X7 reseptörü taşıyan) hücrelerinde farklı yük ve molekül ağırlıktaki floresan boyalar kullanarak, P2X7 reseptörünün aktive ettiği porun geçirgenlik özellikleri ve hücre içi kalsiyumun bu porun aktivasyonundaki rolünü inceledik. Bu boyalar pozitif yüklü Ethidium Bromide, YO-PRO-1, YO-YO-1, TO-TO-1 ve negatif yüklü Lucifer Yellow, Calcein.Hücre dışı kalsiyum (1 mM) varlığında, P2X7 aktivasyonundan sonra HEK-K4 hücreleri YO-PRO-1 ve Lucifer Yellow boyalarını geçirdi. İlginç olarak, hücredışı kalsiyum yokken Lucifer Yellow girişi ortadan kalkarken YO-PRO-1 girişi etkilenmedi. YO-PRO-1 girişi hücreiçi kalsiyumun çelasyonuyla da bloke olmadı. RAW 264.7 hücrelerinde, hücre dışında kalsiyum yokken ATP uygulanması YO-PRO-1 ve Lucifer Yellow girişini indükledi. RAW hücrelerinde, hücreiçi kalsiyumun çelasyonuyla bu boyaların girişinin engellenmediğini de bulduk. ATP uygulaması olmaksızın hücreiçi kalsiyum bir iyonoforla ((Br-A23187 10 uM) doğrudan arttırıldığında, HEK-K4 hücrelerinde Lucıfer Yellow, RAW 264.7 hücrelerinde de YO-PRO-1 ve Lucifer Yellow girişi gözledik. Bu bulgular HEK-K4 ve RAW 264.7 hücrelerinde P2X7 reseptörünün aktive ettiği büyük floresan boyaların girişinden sorumlu farklı seçicilik özelliği olan birden fazla yolağın olduğunu göstermiştir. Bu yolaklar hücreiçi kalsiyumuna olan bağımlılıklarıyla ayrılabilir.AbstractP2X7 is a cation channel and has been known to form a non-selective large ?pore? which is permeable to large molecules. In this study, we investigated permeability properties of P2X7-activated pores and role of intracellular [Ca2+] in activation of these pore in HEK-K4 (stabily expresses rat P2X7 receptor) and RAW 264.7 (endogenly expresses mouse P2X7 receptor) cells by using fluorescence tracers with different charges and molecular weights. These dyes are positively charged Ethidium Bromide, YO-PRO-1, YO-YO-1, TO-TO-1 and negatively charged Lucifer Yellow, Calcein. In the presence of extracellular Ca2+ (1mM), after P2X7 stimulation HEK-K4 cells permeates YO-PRO-1 and also Lucifer Yellow dyes. Interestingly, in the absence of extracellular Ca2+ Lucifer Yellow uptake disappeared but YO-PRO-1 did not and also YO-PRO-1 uptake was not blocked by intracellular Ca2+ chelation. In RAW 264.7 cells ATP application induced both YO-PRO-1 and Lucifer Yellow uptake in the absence of extracelluler Ca2+. We also found that in RAW cells uptake of these dyes were not supressed by intracellular Ca2+ chelation. When intracellular [Ca2+] is increased directly by an ionophore (Br-A23187 10 uM), without ATP application, uptake of Lucifer Yellow in HEK-K4 and uptake of YO-PRO-1 and Lucifer Yellow in RAW cells is activated. These findings show that more than one pathway with different permeant selectivity is responsible for the P2X7 activated uptake of large fluorescent tracers in RAW 264.7 and HEK-K4 cells. Also these pathways can be seperated by their dependency on intracellular Ca2+.