T.C.

ANKARA ÜNIVERSITESI

 

ARAŞTIRMA FONU PROJESI

KESIN RAPORU

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Proje Başlıðı : Ballota glandulosissima Hub.-Mor. & Patzak

ve Ballota inaequidens Hub.-Mor. & Patzak’in diterpen ve flavonoit içeriklerinin YBSK ile karşılaştırılması

Proje Yürütücüsü :Doç.Dr. Gülçin SALTAN

Proje Numarası : 20000803020

Başlama Tarihi : 2000

Bitiş Tarihi : 2002

Rapor Tarihi : 16.09.2002

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu Müdürlüðü

ANKARA-2002

 

 

I. Projenin Türkçe ve Ingilizce Adı ve Özetleri                                                                          

 

Ballota glandulosissima Hub.-Mor. & Patzak ve Ballota inaequidens Hub.-Mor. & Patzak’in diterpen ve flavonoit içeriklerinin YBSK ile karşılaştırılması

 

Bu çalışmaya Türkiye’de bulunan Ballota nigra subsp. kurdica hariç tüm tür ve tür altı seviyedeki taksonların tamamı toplanarak başlanmıştır. Toplanan 16 taksonun her birinin asetonlu ekstresi hazırlanmış, ITK ve YBSK ile bu türlerin kimyasal içerikleri karşılaştırılmıştır. Bu analizler sonucu diterpen ve flavonoit yönünden en zengin türler olan Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens etken madde izolasyonu için uygun türler olarak saptanmıştır. Etken madde izolasyonunda kolon kromatografisi ve preparatif ITK dan yararlanılmış ve bu izolasyon yöntemleri sonucunda Ballota glandulosissima’dan kumatakenol, pakipodol, 5-hidroksi-7,3’,4’ trimetoksi flavon, velutol, salvigenol, korimbosol, retusol isimli 7 adet flavonoit izole edilmiştir. Ballota inaequidens’ten ise hispanolon ve ballonigrin isimli 2 adet diterpen ile 5-hidroksi-3,7,4’ trimetoksi flavon, retusol, 5-hidroksi-7,4’ dimetoksi flavon, pakipodol, filindulatol, 5-hidroksi-7,3’,4’ trimetoksi flavon isimli 6 adet flavonoit saf olarak izole edilmiştir.

Izole edilen bileşiklerin yapı tayinleri UV, kütle, 1H-NMR, 13C-NMR spektral yöntemleriyle saptanmıştır. Diterpenik bileşiklerin yapı tayininde ise tek ve çift dimensiyonlu NMR tekniklerinden (DEPT, COSY, HMBC, HMQC) yararlanılmıştır.

Izole edilen bu bileşiklerle birlikte daha önce Yüksek Lisans tez çalışmaları sırasında tarafımızdan Ballota saxatilis subsp. saxatilis’ten izole edilen diterpen yapısında dehidrohispanolon ile flavonoit yapısında ladaneol’de standart olarak kullanılarak, bitki ekstrelerinin bu bileşikleri taşıyıp taşımadıkları  yine ITK ve YBSK ile incelenmiştir. Bu analizlerden elde edilen kimyasal veriler “Flora of Turkey and the East Aegean Islands” da yer alan morfolojik karakterlerle kıyaslanarak kemotaksonomik bir sonuca gidilmiştir.

                                               

 

 

 

 

 

                                                SUMMARY

 

Compare of diterpene of flavonoid contents of Ballota glandulosissima Hub.-Mor. & Patzak Ballota inaequidens Hub.-Mor. & Patzak by HPLC

 

In this study, the diterpenoid and flavonoid content of Ballota species, growing in Turkey is determined. All of the species and subspecies except Ballota nigra subsp. kurdica are collected and investigated. Acetone extracts of the 16 taxa are prepared and the chemical constituents of the extracts are analyzed using TLC and HPLC. B. glandulosissima and B. inaequidens, which are found to be rich in diterpenoids and flavonoids, are chosen for the isolation of active compounds. Colon chromatography and preparative TLC are used for isolation; from B. glandulosissima 7 flavonoids, kumatakenin (jaranol), pachypodol, 5-hydroxy-7,3’,4’ trimethoxy flavone, velutin, salvigenin, corymbosin, retusin and from B. inaequidens 2 diterpenoids, hispanolone, ballonigrine and 6 flavonoids, 5-hydroxy-3,7,4’ trimethoxy flavone, retusin, 5-hydroxy-7,4’ dimethoxy flavone, pachypodol, filindulatin, 5-hydroxy-7,3’,4’ trimethoxy flavone are isolated.

The structures of the isolated compounds are determined using UV, MASS, 1H-NMR, 13C-NMR spectral methods. 1D and 2D NMR techniques (DEPT, COSY, HMBC, HMQC) are used for determining the structures of diterpenoid compounds.

In addition to these compounds, plant extracts are also analyzed for their dehydrohispanolone which is a diterpenoid and the flavonoid ladanein contents by using TLC and HPLC methods. The standards of these compounds were obtained from Ballota saxatilis subsp. saxatilis during our MS thesis studies.

By comparing the chemical data obtained from these analysis with the morphological characteristics found in “Flora of Turkey and East Aegean Islands”  chemotaxonomic results are obtained.

 

 

 

 

 

 

II. Amaç ve Kapsam

Ballota türleri Lamiaceae familyasına ait çok yıllık otsu bitkilerdir. Dünya’da 35 tür 14 alt tür ile temsil edilmekte, Türkiye’de ise 12 tür ve 8 alt türü bulunmaktadır. Bu taksonlardan 8 tanesi ülkemiz için endemiktir (Patzak, 1958, 1960; Davis, 1982; Greuter ve Raus, 1998).

Avrupa’da spazmolitik ve sedatif etkileri nedeniyle (Garnier ve ark., 1961) iyi tanınan bir bitki olan Ballota türleri Türkiye’de halk arasında şalba, çalba, balotu, ballık otu, nemnem otu, ısırgan, gezgez otu, köpek otu, karayerpırasası, elkurtaran, pat pat otu, leylim kara, somruk ve karınca somurcaðı gibi isimlerle bilinmekte, yine halk tarafından öksürükte, astımda, başaðrısında, mide bulantısında, hemoroitte, yara ve yanık tedavisinde kullanılmaktadır (Baytop, 1984; Meriçli ve ark., 1988; Yeşilada ve ark, 1993, Yeşilada ve ark., 1995; Eryaşar ve Tuzlacı, 1998; Tolon Fenercioðlu ve Tuzlacı, 1998; Tuzlacı ve Tolon, 2000). Bitki üzerinde günümüze kadar yapılan çalışmalarda; terpenoit, flavonoit, fenilpropanoit yapılı bileşikler izole edilmiştir. Ancak Dünya’da Ballota genusuna ait 35 tür bulunmasına karşın sadece 12 tür kimyasal yönden incelenebilmiştir. Türkiye’de yetişen Ballota pseudodictamnus subsp. lycia, B. cristata, B. inaequidens, Ballota saxatilis subsp. brachyodonta, Ballota glandulosissima, Ballota latibracteolata, Ballota rotundifolia, Ballota macrodonta, Ballota nigra subsp. uncinata, Ballota nigra subsp. kurdica tür ve alttürleri üzerinde yapılmış fitokimyasal bir çalışmaya rastlanmamıştır.

Ballota genusu endemik türler açısından zengindir. Ayrıca diðer ülkelere göre kıyaslandıðında tür sayısı açısından en zengin ülke 12 türe sahip olan Türkiye’dir. Ülkemiz bu özelliði ile Ballota genusu için gen merkezi niteliðindedir. Biyolojik aktiviteye sahip kimyasal bileşikler açısından da çeşitlilik göstermesi bitkiyi ilginç hale getirmektedir. Ballota türlerinden bugüne kadar 38 labdan tipi diterpenoit, 24 flavonoit ve 8 fenilpropanoit yapısında madde izole edilmiştir. Bitkinin biyolojik etkisinin taşıdıðı bu bileşiklerden ileri geldiði göz önüne alınarak bu projede diterpenoit ve flavonoit açısından en zengin türler olan Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens’ten diterpen ve flavonoit izole etmek ve Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi ile diðer türlerdeki daðılımını  karşılaştırılması ve akrabalık ilişkilerinin deðerlendirilmesi hedeflenmiştir.

 

III. Materyal ve Yöntem

 

Bu çalışmada aşaðıda isimleri ve toplandıðı lokaliteler belirtilen bitkilerin kurutulmuş toprak üstü kısımları kullanıldı. Herbaryum için seçilen örnekler preslenip kurutulduktan sonra Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumuna (AEF) kaldırıldı.

1. Ballota acetabulosa Benth.

*B1 : Izmir: Yenifoça, yol kenarı 10 m 18.6.1998 B. Sever (1025)

AEF No: 21602                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

B1 : Izmir: Menderes, Ahmetbeyli köyü Sahilevleri civarı 19.6.1998 B. Sever (1026)

B1 : Izmir: Kuşadası; Dilek yarımadası Milli Parkı içi 19.6.1998 B. Sever (1029)

B1 : Izmir: Belkahve üstüi taşocaðı çevresi, 340-400 m 19.6.1998 B. Sever (1028)

 

2. Ballota pseudodictamnus Benth. subsp. lycia Hub.-Mor.

*C2 : Muðla: Fethiye; Ölüdeniz yolu, yol kenarı 20 m 12.6.1997 G. Saltan, B. Sever (1000)

AEF No: 21603                      Toplayan : G. Saltan ve B. Sever

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

3. Ballota inaequidens Hub.-Mor.&Patzak

*C3 : Antalya: Alanya; Alanya’ya gelmeden 2 km önce Hacımehmetli köyü, kuzey-batı yamaç kaya üzeri 200 m 20.7.1997 B. Sever (1017)

 

 

------------------------------------------

*Fitokimyasal çalışmalar için kullanılan örnekler

 

AEF No: 19901                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

C3 : Antalya: Alanya-Manavgat 23. km Alara köprüsü çevresi 10 m,19.7.1997 B. Sever (1016)

 

4. Ballota cristata P.H. Davis

*C3 : Isparta: Eðirdir; Kovada gölü yolu, Kıtır köyü yol kenarı 910 m 17.7.1997 B. Sever (1009)

C3 : Antalya: Kemer; Tahtalı dað, Yaylakuzdere-Gedelma arası, Yaylakuzdere girisi 1850 m, 18.7.1997 B. Sever (1011)

AEF No: 19899                      Toplayan : B. Sever ve arkadaşları

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

5. Ballota saxatilis Sieber ex J.&C. Presl subsp. saxatilis

C4 : Içel: Anamur-Kazancı yolu kaş yaylası 1600 m, 21.7.1997 B. Sever (1021)

*C4 : Içel: Anamur; Anamur’dan Ermenek’e çıkarken, Abanoz yaylasını geçince 1530 m 20.7.1997 B. Sever (1020)

AEF No: 19904                      Toplayan : B. Sever ve arkadaşları

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

C6 : Gaziantep: Sofu daðı, televizyon kulesi çevresi 1400 m 18.7.1998 B. Sever (1037)

C6 : Gaziantep: Dülükbaba Orman tesisleri içi, tarihi mezarlar çevresi 1200 m 18.7.1998 B. Sever (1039)

 

6. Ballota saxatilis Sieber ex J.&C. Presl subsp. brachyodonta Davis&Doroszenko

*C4 : Içel: Silifke; Kırobası köyü çıkışı kaya üzeri 1300-1400 m 3.7.1998 B. Sever (1036)

 

AEF No: 21605                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

C4 : Içel: Silifke; Ayaştürkmenli köyü, Şereki mavkii kaya üzeri, 1600 m 5.7.1998 B. Sever (1035)

C5 : Içel: Içel-Gözne yolu Dalakdere köyü kayalıklar 500 m, 6.7.1998 B. Sever (1032)

C5 : Içel: Gözne yolu, Kepirli yol ayrımı, kayalıklar 750-800 m 6.7.1998 B. Sever (1033)

C5 : Içel: Gözne yolu, Sarnıç çevresi 800 m 6.7.1998 B. Sever (1034)

 

7. Ballota glandulosissima Hub.-Mor. & Patzak

C3 : Antalya: Finike; şehir içi taş duvar üzeri, 5 m, 19.8.1997 B. Sever (1013)

AEF No: 19908                      Toplayan : B. Sever ve arkadaşları

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

C3 Antalya: Finike-Turunçova-Elmalı yolu 5-7. km’ler arası 175 m, 19.7.1997 B. Sever (1043)

*C3 : Antalya: Kumluca-Altınyaka yolu, Altınyaka’ya 10 km kala, dere yataðını 50 m geçince 500 m, 19.7.1997 B. Sever (1014)

AEF No: 19900                      Toplayan : B. Sever ve arkadaşları

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

8. Ballota larendana Boiss. & Heldr.

*A4 : Ankara: Kızılcahamam girişi sanayi sitesi ve petrol ofisi karşısındaki yamaçlar, 28.6.1998, B. Sever (1030)

AEF No: 21604                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

9. Ballota latibracteolata Davis & Doroszenko

C4 : Içel: Anamur Mamure kalesi içi ve çevresi 20.7.1997 B. Sever (1019)

AEF No: 19903                      Toplayan : B. Sever ve arkadaşları

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

*C4 : Antalya: Gazipaşa-Anamur arası, 24. km Zeytinada mevkii, yolun solu makilik alan 425 m 20.7.1997 B.sever (1018)

AEF No: 19902                      Toplayan : B. Sever ve arkadaşları

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

C4 : Içel: Gazipaşa-Anamur yolu, Zeytinada köyü, Akarca mevkii, kaya üzeri, 450-500 m, 20.7.1997 B. Sever (1023)

 

10. Ballota rotundifolia C. Koch

*A8 : Erzurum: Tortum gölü çevresi 1200 m, 11.9.1998 B. Sever (1041)

AEF No: 21606                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

A8 : Erzurum: Şenkaya, Deðirmenlidere köyü (Avunder)-Aydoðdu arası 1750 m,

11.9.1998 B. Sever (1044)

A8 : Erzurum: Akşar köyünü geçince Yeşildemet yol ayrımından 50 m önce, 1450 m, 11.9.1998 B. Sever (1045)

 

11. Ballota macrodonta Boiss. & Bal.

*B5 : Kayseri: Yahyalı; Ulupınar köyünden Çamlıca’ya giderken hareketli yamaçlar yol kenarı 1150 m, 2.8.1997 B. Sever (1024)

AEF No: 19907                      Toplayan : B. Sever ve arkadaşları

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

12. Ballota nigra L. subsp. nigra

*A5 : Sinop: Boyabat; Ilıca köyü, bahçe araları, 370 m, 9.10.1998 B. Sever (1048)

AEF No: 21609                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

 

A8 : Erzurum. Oltu; şehir içi, ev bahçeleri, 11.9.1998 B. Sever (1049)

A8 : Erzurum: Şenkaya; Aydoðdu köyü yol kenarı 11.9.1998 B. Sever (1050)

 

13. Ballota nigra L. subsp. foetida Hayek

*C2: Muðla: Döðüşbelen köyü yol kenarı, merkeze 20 km uzaklıkta, 12.7.1999 D. Alper , B. Sever

AEF No: 21608                      Toplayan : B. Sever ve D. Alper

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

14. Ballota nigra L. subsp. uncinata (Fiori & Bég) Patzak

B1 : Izmir; Menderes; Gökçealan köyü, 250 m, 19.6.1998 B. Sever (1027)

*C6 : Kahramanmaraş; şehir içi, kanlıdere köprüsü çevresi, 650-700 m, 16.7.1998 B. Sever (1037)

AEF No: 21607                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

 

15. Ballota nigra L. subsp. anatolica P.H. Davis

B3 : Afyon: Bolvadin; Dişli’den Bolvadin’e doðru Bolvadin’e 4 km kala yol kenarı 1050 m, 17.7.1997 B. Sever (1002), 19898

*B4 : Ankara: Gölbaşı; Göl çevresi, 28.6.1998 B. Sever (1031)

 

 

AEF No: 21601                      Toplayan : B. Sever ve ark.

                                                Teşhis eden: F. Tezcan

B9 : Van; Gevaş, bahçe araları 1730 m, 23.7.1998 B. Sever (1047)

B9 : Van: Akdamar adası 1730 m, 23.7.1998 B. Sever (1040)

 

 

16. Ballota nigra L. subsp. kurdica P.H.Davis

B9 : Bitlis: Tatvan, Karz Daðı, Sapur Köyü üstü, karışık orman, alpinik step, 1800-2600 m, 20.8.1972, H. Peşmen 3240 HUB 21984

Bu örnek tarafımızdan toplanmamıştır, gerekli açıklama tartışma ve sonuçta belirtilmiştir.

 

17. B. antalyense F.Tezcan & H.Duman (nom.nud.)

*C3: Antalya: Turunçova-Elmalı yolu 5-10. km arası, hareketli yamaçlar, taşlık alan, 150 m, 19.7.1997 B. Sever (1015)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ekstraksiyon ve Izolasyon Çalışmaları

Ekstraksiyon

 

Türkiye’nin çeşitli yerlerinden topladıðımız B. acetabulosa, B. pseudodictamnus subsp. lycia, B. cristata, B. inaequidens, B. saxatilis subsp. saxatilis, B. saxatilis subsp. brachyodonta, B. glandulosissima, B. larendana, B. latibracteolata, B. rotundifolia, B. macrodonta, B. nigra subsp. nigra, B. nigra subsp. anatolica, B. nigra subsp. uncinata, B. nigra subsp. foetida, B. antalyense türlerinin herbirinin ekstrelerini hazırlamak için Rodriguez ve arkadaşlarının (1979) kullandıðı ekstraksiyon yöntemi uygulandı.

Buna göre toz edilen  25’er g her bir  bitki numunesi 500 ml aseton ile 3 gün hareketli maserasyona bırakıldı. Maserasyon süresi tamamlandıktan sonra elde edilen sıvı ekstre pilili süzgeç kaðıdından süzüldü. Rotavaporda düşük basınç altında 500C’yi geçmeyen sıcaklıkta yoðunlaştırıldı. Yoðun ekstre 200 ml etil asetatta çözüldü, bir ayırma hunisine alınan etil asetatlı ekstre su ile yıkandı ve alttaki sulu faz atıldı. Üst fazdaki etil asetat rotavaporda yoðunlaştırıldı. Bu şekilde 16 adet bitki ekstresi hazırlanmış oldu.

 

Ekstrelerin Ince Tabaka Kromatografisi ve Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi ile Incelenmesi

 

Ince Tabaka Kromatografisi

 

Hazırlanan ekstreler  0,25 mm kalınlıðındaki Kieselgel 60 HF254 (Merck 5554) hazır plaklara uygulandı. En uygun solvan sistemini bulabilmek amacıyla kloroform : metanol’ün deðişik oranlardaki karışımı denendi.

            Kloroform : Metanol (90:10)

            Kloroform : Metanol (95:5)

            Kloroform : Metanol (98:2)

            Kloroform : Metanol (99:1)

            Kloroform : Metanol (90:0.5)

 

 

En uygun ayırım Kloroform : Metanol (100:0.5) solvan sistemi ile saðlandı. Bu sistemde sürüklenen plaklar kurutuldu. Plaklar UV lambası altında incelendiðinde birden fazla lekenin olduðu görüldü. Ardından terpenik bileşiklerin varlıðını araştırmak için Vanilin-sülfürik asit reaktifi ya da anisaldehit sülfürik asit reaktifi püskürtüldüðünde bazı lekelerin diterpenler için karakteristik olan pembe-mor renk verdiði gözlendi. Bu reaktiflerin hazırlanışı aşaðıda verilmiştir.

Vanilin-H2SO4 reaktifinin hazırlanışı :

% 5 sülfürik asitli etanol ( I.solüsyon)

% 1 Vanilinli etanol (II. solüsyon)

Plaklara önce I. solüsyon püskürtülür daha sonra II. solüsyon püskürtülür ve 1100C’lik etüvde 10 dakika bekletildikten sonra renklenme gözlenir. Bu reaktif  terpenler, fenilpropan türevleri ve fenollerin teşhisinde faydalanılan bir reaktiftir (Wagner ve ark., 1984).

Anisaldehit sülfürik asit reaktifinin hazırlanışı: 1 ml anisaldehit, 1 ml metanol ve 0.1 ml derişik sülfürik asit karışımında çözülür. Taze hazırlanmalıdır (Tanker M. ve ark., 1986).

Flavonoit yapıdaki bileşiklerin incelenmesi amacıyla ise amonyak reaktifinden yararlanıldı. Gün ışıðında hafif sarı renk veren bileşikler  amonyak buharına tutulduðunda renkler daha bariz olarak gözlendi.

 

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi

 

Diterpen ve flavonoit açısından zengin olan  Ballota türlerini seçmek amacıyla ekstreler ters faz YBSK ile de incelendi.

Kullanılan cihaz (Soft ware programı) : HP 1100

Analitik pompa : HP G 1311 A

Dedektör : UV dedektör

Kolon : Hıchrom  5 C18

Mobil faz : Metanol : Su (75:25)

Dalga boyu : 208 nm

Akış hızı : 0,8 ml/dak

Numune miktarı : 20 ml

Kullanılan solvan sistemi YBSK saflıðında olup kullanılmadan önce 0,45 mm milipor filtreden geçirildi ve degaze edildi.

Yapılan ITK ve YBSK analizleri sonucu hem ekstrelerin içerdiði bileşikler hakkında bilgi edinildi, aynı zamanda izolasyon için diterpen ve flavonoit açısından en zengin türler olan B. glandulosissima ve B. inaequidens belirlendi.

Kolon Kromatografisi

 

Ince Tabaka Kromatografisi ve Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi sonuçlarına dayanarak; diterpen ve flavonoit içeriði açısından zengin olarak belirlenen türler olan Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens kolon kromatografisiyle izolasyon için kullanıldı.

Ballota glandulosissima

            Bu amaçla yine Rodriguez ve arkadaşlarının (1979) kullandıðı ekstraksiyon yönteminden yararlanıldı. Ballota glandulosissima ’nın toprak üstü kısımlarından 500 g tartılıp toz haline getirildi. 5 lt aseton ile 3 gün hareketli maserasyona bırakıldı. Maserasyon süresi tamamlandıktan sonra pres yardımıyla sıkıldı. Elde edilen sıvı ekstre iri kirliliklerinden kurtarılmak üzere pilili süzgeç kaðıdından süzüldü. Rotavaporda düşük basınç altında 50 0C’yi geçmeyen sıcaklıkta yoðunlaştırıldı. Aseton uzaklaştırılıp

geriye kalan yoðun ekstre 250 ml etil asetat ile çalkalandı ve etil asetatlı ekstre ayırma hunisinde su ile yıkandı, alttaki sulu faz atıldı. Üst fazdaki etil asetat rotavaporda

yoðunlaştırıldı ve tartıldı. Ballota glandulosissima’dan elde edilen etil asetatlı ekstreyi (21,65 g) kolon kromatografisi yöntemiyle bileşiklerine ayırmak için; 300 g silikajel

(0,063-0,200 mm, 70-230 mesh ASTM, Merck) adsorban olarak kullanıldı. 21,65 g ekstre önce bir miktar etil asetat içinde çözüldü sonra 21,65 g silikajel ile slury yöntemi uygulandı. Silikajel kolona yaş halde dolduruldu, üzerine silikajele emdirilmiş ekstre ilave edildi. Aşaðıda belirtilen solvan sistemleri ile sırasıyla elüsyon gerçekleştirildi.

 

                        Sistem No                                Solvan sistemi                              

                               1                                         Petrol eteri (100)

                               2                                         Petrol eteri : Etil asetat (98:2)

                               3                                         Petrol eteri : Etil asetat (95:5)

                               4                                         Petrol eteri : Etil asetat (90:10)

                               5                                         Petrol eteri : Etil asetat (85:15)

                               6                                        Petrol eteri : Etil asetat (80:20)

                               7                                       Petrol eteri : Etil asetat (75:25)

                               8                                       Metanol (100) (yıkamak için)

Fraksiyonlar 2 saniyede 1 damla akacak şekilde 100’ er ml halinde toplandı, 30oC’ de alçak basınç altında 2 ml’ ye kadar yoðunlaştırılıp ince tabaka kromatografisi ile

kontrol edildi, benzer fraksiyonlar birleştirildi ve numaralandırıldı. Toplanan fraksiyonlardan bazıları üzerinde izolasyon ve saflaştırma işlemi uygulandı.

Ballota inaequidens

Ballota inaequidens ’in toprak üstü kısımlarından 500 g tartılıp toz haline getirildi. 5 lt aseton ile 3 gün hareketli maserasyona bırakıldı. Maserasyon süresi tamamlandıktan sonra pres yardımıyla sıkıldı. Elde edilen sıvı ekstre iri kirliliklerinden kurtarılmak üzere pilili süzgeç kaðıdından süzüldü. Rotavaporda düşük basınç altında yoðunlaştırıldı. Aseton uzaklaştırılıp geriye kalan yoðun ekstre 250 ml etil asetat ile çalkalandı ve etil asetatlı ekstre ayırma hunisinde su ile yıkandı, alttaki sulu faz atıldı. Üst fazdaki etil asetat rotavaporda yoðunlaştırıldı ve tartıldı. Ballota inaequidens’ten elde edilen etil asetatlı ekstre (35,49 g)’yi kolon kromatografisi yöntemi ile incelemek amacıyla 250 g silikajel ( 0,063-0,200 mm, 70-230 mesh ASTM, Merck ) adsorban olarak kullanıldı. 35,49 g ekstre önce bir miktar etil asetat içinde çözüldü sonra 35,49 g silikajel ile slury yöntemi uygulandı. Silikajel kolona yaş halde dolduruldu, üzerine silikajele emdirilmiş ekstre ilave edildi. Aşaðıda belirtilen solvanlarla sırasıyla elüsyon gerçekleştirildi.

 

                        Sistem No                                Solvan sistemi                              

                               1                                         Petrol eteri (100)

                               2                                         Petrol eteri : Etil asetat (98:2)

                               3                                         Petrol eteri : Etil asetat (95:5)

                               4                                         Petrol eteri : Etil asetat (90:10)

                               5                                         Petrol eteri : Etil asetat (85:15)

                               6                                        Petrol eteri : Etil asetat (80:20)

                               7                                       Petrol eteri : Etil asetat (75:25)

                               8                                       Metanol (100) (yıkamak için)  

Fraksiyonlar 2 saniyede 1 damla akacak şekilde 100’er ml halinde toplandı, 30oC’ de alçak basınç altında 2 ml’ ye kadar yoðunlaştırılıp ince tabaka kromatografisi ile kontrol edildi, benzer fraksiyonlar birleştirildi ve numaralandırıldı. Toplanan fraksiyonlardan bazıları üzerinde izolasyon ve saflaştırma işlemi uygulandı.

 

 

 

Preparatif ITK Ile Ayırma ve Saflaştırma

 

Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens’ten   kolon kromatografisi ile elde edilip ITK ile incelenen fraksiyonlardan bazılarında birden fazla bileşiðin bulunduðu görüldü. Benzer olanlar birleştirilip bileşiklerin birbirinden ayrılmasında preparatif ince tabaka kromatografisinden yararlanıldı.

Preparatif ITK ile temizlenmek üzere seçilen fraksiyonlar 0,5 cm kalınlıkta kaplanmış 20x20 cm boyutlarındaki Kieselgel 60 HF254 (Merck 5744) hazır cam plaklara kapiller yardımıyla bant şeklinde uygulandı. Kromatografi tankı içinde bulunan kloroform : metanol (100:0.5) solvan sisteminde sürüklendi ve sürüklenme işlemi tamamlandıktan sonra plak tanktan çıkarılıp kurutuldu. Ayrılan madde/maddeler UV lambası altında kontrol edilip ayrılan bileşiklerin yerleri işaretlendi. Ayrıca plaðın sol tarafında 1 cm’lik bir şerit açık bırakılıp diðer taraflar kapatıldı ve açıkta kalan kısma reaktif püskürtüldü (Vanilin- H2SO4 veya NH3) oluşan mor veya sarı renkli bantlar bir spatül yardımı ile kazındı, bir erlene koyulup üzerine etilasetat ilave edilip çalkalandı böylece maddenin çözünmesi saðlandı. Bu şekilde bir gece bekletildikten sonra uygun filtre kaðıdından (Wattman)  süzülerek maddenin adsorbandan ayrılması  saðlandı. Daha sonra da çözücü yoðunlaştırılarak ortamdan uzaklaştırıldı ve madde desikatörde kurutulup tartıldı.

Kristallendirme ve temizleme işlemleri sonunda B. glandulosissima’dan: BG-1, BG-2, BG-3, BG-4, BG-5, BG-7, BG8; B. inaequidens’ten ise BI-1, BI-2, BI-3, BI-4, BI-5, BI-7, BI-8, BI-9 kodlu bileşikler izole edildi.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Izole Edilen Bileşiklerin ITK ve YBSK ile Incelenmesi ve Türlere Göre Daðılımı

Ince Tabaka Kromatografisi

 

Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens ekstrelerinden izole edilen diterpen ve flavonoitlerin diðer Ballota türlerindeki daðılımını incelemek amacıyla bu yöntemlerden yararlanıldı.

Bileşiklerin ITK ile analizinde Kieselgel 60 HF254 (Merck 5554) ile 0,25 mm kalınlıkta kaplanmış 20x20 cm boyutlarındaki hazır alüminyum plaklar kullanıldı.

            Adsorban : Kieselgel 60 HF254

            Adsorban kalınlıðı : 0,25 mm

            Mobil faz : Kloroform : metanol (100:0.5)

            Sürüklenme mesafesi : 19 cm

            Belirteç : önce UV254  ve Vanilin-H2SO4 reaktifi (terpenik bileşikler için),                                               NH3 reaktifi (flavonoit yapıda bileşikler için).

 

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi

 

Incelemede hem ters faz hemde normal faz YBSK’dan yararlanıldı. Ancak ters faz YBSK ile iyi ayırım saðlanamadıðından (Phenomenex RP C18 Luna (250 x 4,6 mm) 5mm partikül büyüklüðündeki kolon kullanılmıştır),  normal faz YBSK tercih edildi ve bu amaçlada aşaðıda belirtilen solvan sistemleri denendi, en uygun sonuç n-hekzan: metanol (98:2) solvan sistemi ile alındı ve analizler bu solvan sistemi kullanılarak gerçekleştirildi.

En uygun solvan sistemini bulmak için denenen solvan sistemleri :

-Asetonitril : su (65:35) izokratik, ters faz

-Metanol : su (75:25) gradient sistem, ters faz

-Metanol : su (70:30) gradient sistem, ters faz

-Metanol : su (40:60) izokratik, ters faz

-Metanol : su (30:70) izokratik, ters faz

-Metanol : H3PO4’lü su (70:30) izokratik, ters faz

-Metanol : H3PO4’lü su (30:70) izokratik, ters faz

-Metanol : H3PO4’lü su (50:50)+% 0,3 iyon çifti izokratik, ters faz

-Metanol : H3PO4’lü su (50:50)+% 1,2 iyon çifti izokratik, ters faz

 

-Metanol : NaH2PO4 /perklorik asit tamponu (50:50) pH 2,6, izokratik , ters faz

-Metanol : NaH2PO4 /perklorik asit tamponu (50:50) pH 2,6, gradient sistem, ters faz

-Metanol : NaH2PO4 /perklorik asit tamponu (20:80) pH 2,6, izokratik , ters faz

-Metanol : NaH2PO4 /perklorik asit tamponu (40:60) pH 2,6, izokratik , ters faz

-n-Hekzan : isopropanol (95:5) gradient sistem, normal faz

-n-Hekzan : isopropanol (98:2) gradient sistem, normal faz

-n-Hekzan : metanol (95:5) gradient sistem, normal faz

*-n-Hekzan : metanol (98:2) gradient sistem, normal faz

Yukarıda belirtilen solvan sistemleri ile ayrıca farklı akış hızları (gradient uygulamalarda ise deðişik gradient sistemler) ve kolon sıcaklıklarında çalışılmıştır.

Kullanılan cihaz (Soft ware programı) : Shimadzu LC 10

Kolon fırını : Shimadzu CTO-10A

Analitik pompa : Shimadzu LC-10AD

Dedektör : Shimadzu SPD-M10AVP Photo Diod Array dedektör

Kolon : Zorbax-CN (4,6 mm ID x 25 cm)

Mobil faz : n-Hekzan : Metanol (hız gradienti)

                         Gradient program

             Zaman               Toplam akış

            0,00-9,59         ®       1,3 ml/dak

            9,60-13,00       ®        1,7 ml/dak

            13,1-22,0         ®        2,5 ml/dak

            22,1-35,0         ®        3,2 ml/dak

            35,0                 ®            stop

Dalga boyu : 190-360 nm arası taranmıştır

Numune miktarı : 20 ml

 

Solvan sistemleri : kullanılan solvan sistemleri YBSK saflıðında olup kullanılmadan önce 0,45 mm milipor filtreden geçirildi ve degaze edildi.

Standartlar : Solvan sistemleri : kullanılan solvan sistemleri YBSK saflıðında olup kullanılmadan önce 0,45 mm milipor filtreden geçirildi ve degaze edildi.

 

Standartlar : Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens’ten izole ettiðimiz BG-1, BG-2, BG-3, BG-4, BG-7, BI-1, BI-2, BI-3, BI-5, BI-8, BI-9 ve daha önceki çalışmamızda izole ettiðimiz dehidrohispanolon (BS-1) ve ladaneol (BS-2) standart madde olarak kullanıldı (Çitoðlu ve ark., 1998; Çitoðlu ve ark., 1999).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

--------------------------

* YBSK için seçilen solvan sistemi

 

 

Izole Edilen Bileşiklerin Yapı Tayini

 

Kolon ve preparatif ince tabaka kromatografileri yardımıyla birbirinden ayrılan bileşikler kristallendirme ya da kromatografik yöntemlerle saflaştırıldı ve her bir  bileşiðin yapısı aşaðıda belirtilen spektroskopik yöntemlerle tayin edildi.

UV spektrofotometresi : Schimadzu UV-160A ve UV 1601 PC cihazları kullanıldı. Bileşiklerin UV spektrumu metanolde alındı. Flavonoitlerin ayrıca kayma spektrumlarının alınabilmesi için her bir bileşiðin metanoldeki çözeltisine sırasıyla NaOMe, AlCl3, AlCl3/HCl, NaOAc, NaOAc/ H3BO3 çözeltileri eklendi. UV kayma belirteçlerinin hazırlanışı aşaðıda belirtildi.

NaOMe belirteci : 2,5 g sodyum küçük parçacıklar halinde 100 ml saf metanolde çözülerek hazırlandı

AlCl3 : 5 g susuz aluminyum (III) klorür 100 ml saf metanolde çözülerek hazırlandı

HCl : 50 ml derişik HCl  100 ml distile suda çözülerek hazırlandı           

NaOAc : toz halindeki susuz saf sodyum asetat krozede eritilerek asetik asitten kurtarıldı

H3BO3  : Toz halinde susuz borik asit kullanıldı (Mabry ve ark., 1970).

NMR spektrofotometresi : Bilesiklerin dötorokloroform (CDCl3) ve dimetilsülfoksit (DMSO) içinde hazırlanan çözeltilerinin 1H-NMR ve 13C-NMR spektrumları Bruker DPX-300 cihazı kullanılarak alındı.

EI-Kütle spektrometresi : Micromass UK  Platform-II cihazı kullanılarak yapıldı.

Erime Noktası Tayini : Büchi SMP-20 (0-300 0C) cihazı kullanıldı.

 

Ballota Türlerinden Izole Edilen Diterpen ve Flavonoitlerin Kemotaksonomik Açıdan Deðerlendirilmesi

 

Ballota türlerinden izole edilen diterpen ve flavonoitlerin kemotaksonomisi bir kümeleme analizi yöntemi olan UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Aritmetic Mean) metodu ile deðerlendirildi. Bu işlem için MVSP (Multivariate Statistical Package) versiyon 3,12 kullanıldı.

 

 

 

 

 

IV. Analiz ve  Bulgular

Kolon Kromatografisi ile Izolasyon ve Saflaştırma

 Ballota  glandulosissima’dan Izole Edilen Bileşikler

 

Rodriguez ve arkadaşlarının kullandıðı yönteme göre yapılan ekstraksiyon sonucunda B. glandulosissima’dan 21,65 g ekstre elde edildi. Bu ekstrenin deðişik solvan sistemleri ile elüsyonu sonucunda çeşitli fraksiyonlardan kristalizasyon ve preparatif ITK ile BG-1, BG-2, BG-3, BG-4, BG-5, BG-7, BG-8 ile kodlanan 7 adet bileşik elde edildi. Bu bileşiklerin erime noktası tayini, ITK ve YBSK yöntemleri yardımı ile saf olduðu anlaşıldı (Şekil 1).             

                                        Ballota glandulosissima

                                                (500 g)

                                                    ¯aseton

                                                           Asetonlu ekstre

                                                    ¯yoðunlaştırma etil asetat

                                        Etilasetatlı ekstre

                                                    ¯ su ile yıkama, yoðunlaştırma

                                           Yoðun ekstre

                                             (21,65 g)

                                                    ¯silikajel kolon kromatografisi

                                                                    ¯petrol eteri:etilasetat (100:0, 85:15)

                          Fraksiyon 1-21 (Petrol eteri:etil asetat) (98:2)

                                                (Fr A)

                                                     ¯

                        Fraksiyon 22-50 (Petrol eteri:etil asetat) (95:5)

                                                (Fr B)                                         

                                                     ¯

         Fraksiyon 51-122 (Petrol eteri:etil asetat) (90:10) ®BG-1, BG-2, BG-8, BG-7

                                                (Fr C)                                           

                                                    ¯

            Fraksiyon 123-140 (Petrol eteri:etil asetat) (85:15) ® BG-3, BG-4, BG-5

                                                (Fr D)

           

            Şekil 1. B. glandulosissima ekstresinin fraksiyonlanması ve bileşiklerin izolasyonu

 

B. inaequidens’den Izole Edilen Bileşikler

 

Rodriguez ve arkadaşlarının kullandıðı yönteme göre yapılan ekstraksiyon sonucunda B. inaequdens’dan 35,49 g ekstre elde edildi. Bu ekstrenin deðişik solvan sistemleri ile elüsyonu sonucunda çeşitli fraksiyonlardan kristalizasyon ve preparatif ITK ile BI-1, BI-2, BI-3, BI-4, BI-5, BI-7, BI-8, BI-9 ile kodlanan 8 adet bileşik elde edildi. Bu bileşiklerin erime noktası tayini, ITK ve YBSK yöntemleri yardımı ile saf olduðu anlaşıldı (Şekil 2).

                                         Ballota inaequidens

                                                (500 g)

                                                ¯aseton

                                                           Asetonlu ekstre

                                                    ¯yoðunlaştırma etil asetat

                                        Etilasetatlı ekstre

                                                    ¯ su ile yıkama, yoðunlaştırma

                                           Yoðun ekstre

                                             (35,49 g)

                                                    ¯silikajel kolon kromatografisi

                                                                    ¯petrol eteri:etilasetat (100:0, 80:20)

                          Fraksiyon 1-18 (Petrol eteri:etil asetat) (98:2)

                                                (Fr A)

                                                     ¯

                        Fraksiyon 19-52 (Petrol eteri:etil asetat) (95:5)

                                                (Fr B)                                         

                                                     ¯

            Fraksiyon 53-145 (Petrol eteri:etil asetat) (90:10) ®BI-8, BI-9,BI-1,BI-3

                                                (Fr C)                                           

                                                    ¯

            Fraksiyon 146-190 (Petrol eteri:etil asetat) (85:15) ® BI-2,BI-4,BI-5

                                                (Fr D)

                                                    ¯

                Fraksiyon 191-232 (Petrol eteri:etil asetat) (80:20) ®BI-7

                                                    ¯

                                                (Fr E)

            Şekil 2. B. inaequidens ekstresinin fraksiyonlanması ve bileşiklerin izolasyonu

 

 

 

Izole Edilen Bileşiklerin ITK ve YBSK ile Türlere Göre Daðılımının Incelenmesi

 

ITK sonuçlarına göre bileşiklerin Rf deðerleri saptandı (Tablo 1).

                       

Madde No

       Rf

BG-1

      0,17

BG-2

      0,52

BG-3

      0,63

BG-4

      0,35

BG-5

      0,59

BG-7

      0,61

BG-8

      0,75

BI-1

      0,80

BI-2

      0,75

BI-3

      0,76

BI-4

      0,52

BI-5

      0,69

BI-7

      0,63

BI-8

      0,73

BI-9

      0,85

           

            Tablo 1. Izole edilen bileşiklerin ITK sonuçlarına göre Rf deðerleri

 

                        Adsorban : Kieselgel 60 HF254 (Merck 5554)

                                Çözücü sistemi : Kloroform : metanol (100:0.5)

                                Revalatör : Vanilin-Sülfürik asit

                                Oda sıcaklıðı : 21 0C

 

Buna göre alınan kromatogramlardan BG-1 bileşiðinin: B. glandulosissima, Ballota nigra subsp. foetida ve B.nigra subsp. anatolica, BG-2 bileşiðinin: B. glandulosissima, B. inaequidens; BG-3 bileşiðinin: B. glandulosissima, B. inaequidens; BG-4 bileşiðinin: B. glandulosissima; BG-5 bilişiðinin; B. glandulosissima BI-1 bileşiðinin: B. inaquidens, B. saxatilis subsp. saxatilis, B. rotundifolia, B. nigra subsp. foetida; BI-2 bileşiðinin: B. inaquidens, B. saxatilis subsp. saxatilis,B. glandulosissima, B. nigra subsp. foetida; BI-3 bileşiðinin: B. inaquidens, B. rotundifolia; BI-5 bileşiðinin: B. inaquidens, B. saxatilis subsp. saxatilis; BI-8 bileşiðinin: B. acetabulosa, B. pseudodictamnus subsp. lycia, B. inaquidens, B. cristata, B. saxatilis subsp. saxatilis, B. rotundifolia; BI-9 bileşiðinin: B. acetabulosa, B. inaquidens, B. cristata, B. saxatilis subsp. saxatilis, B. saxatilis subsp. brachyodonta, B. larendana, B. nigra subsp. foetida, B. antalyense; BS1 bileşiðinin: B. acetabulosa, B. pseudodictamnus subsp. lycia, B. cristata, B. saxatilis subsp. saxatilis, B. saxatilis subsp. brachyodonta, B. larendana, B. latibracteolata, B. rotundifolia, B. macrodonta, B. nigra subsp. uncinata, B. antalyense; BS-2 bileşiðinin: B. acetabulosa, B. inaquidens, B. saxatilis subsp. saxatilis, B. latibracteolata, B. rotundifolia türlerinde bulunduðu görüldü.

Bu sonuçları daha güvenilir hale getirebilmek amacıyla  YBSK’dan yararlanıldı. Ters faz YBSK ile analiz yapıldı ancak normal faz YBSK ile daha saðlıklı sonuçlar alındı. Elde edilen kromatogramlara göre (Kromatogram 1-17) bitkilerin taşıdıðı bileşikler tablo halinde özetlendi (Tablo 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ballota Türlerinden Izole Edilen Diterpen ve Flavonoitlerin Kemotaksonomik Açıdan Deðerlendirilmesi

 

Farklı Ballota türlerinden izole edilen toplam 13 bileşiðin 16 taksondaki daðılımı YBSK analizi ile incelenmiştir ve sonuçlar tablo halinde özetlenmiştir (Tablo 2). Bu tablodaki kimyasal verilerin, morfolojik karakterlerle cluster analizi yöntemiyle kıyaslanması sonucu bir dendrogram elde edilmiş ve türler arası akrabalık ilişkileri ortaya konmaya çalışılmıştır (Şekil 3). Bu dendrogram matrisi ise Tablo 3’de verilmiştir.

Bu dendrograma göre Ballota glandulosissima ile Ballota acetabulosa birbirine en uzak türlerdir. Çalışılan 16 tür ve tür altı seviyedeki takson kimyasal içeriklerine göre 9 grup altında toplanmıştır. Buna göre:

I. grup, B. glandulosissima

II. grup, B. inaequidens

III. grup, B. nigra subsp. foetida

IV. grup, B. rotundifolia ve B. saxatilis subsp. saxatilis

V. grup, B. nigra subsp. anatolica ve B. nigra subsp. nigra

VI. grup, B. latibracteolata

VII. grup, B. antalyense, B. larendana, B. saxatilis subsp. brachyodonta

VIII. grup, B. nigra subsp. uncinata, B. macrodonta,B. pseudodictamnus subsp. lycia

 IX. grubu B. cristata ve B. acetabulosa oluşturur.

Ballota türleri morfolojik karakterleri gözönüne alınarak deðerlendirildiði zaman, Türkiye’de yetişen Ballota türlerinin 4 farklı seksiyon altında toplandıðı görülür. Bu seksiyonlar ve seksiyona ait türler aşaðıda verilmiştir.

1-Acetabulosa seksiyonu                               4-Microselidae seksiyonu

Ballota acetabulosa                                         B. cristata

2-Pseudodictamnus seksiyonu                                   B. saxatilis      

Ballota pseudodictamnus                                 B. larendana

3-Ballota seksiyonu                                        B. latibracteolata

B. nigra subsp. nigra                                       B. rotundifolia

B. nigra subsp. anatolica                                 B. macrodonta

B. nigra subsp. uncinata                                  B. inaequidens

B. nigra bubsp. foetida                                                B. glandulosissima

 

Ülkemizde yetişen Ballota türlerinin seksiyon bazında ayrılması morfolojik karakterler göz önüne alınarak yapılmıştır. Kullanılan karakterler daha çok kaliks şekli, kaliks diş sayısı ve yapısı ile tüy şeklidir. Bu morfolojik karakterler seksiyon ve tür ayırımında kullanılmasına raðmen türler arası akrabalık ilişkilerini açıklayamamaktadır. Bu nedenle kimyasal çalışma sonucunda oluşan gruplar ile morfolojik sınıflandırmadaki gruplar birbirleriyle birebir örtüşmemektedir. Daha açık bir ifade ile, morfolojik ayırımda kullanılan tüy yapısıyla kimyasal çalışma sonuçları uyumlu bir daðılım göstermekte  ancak kaliks şekli, kaliks diş sayısı gibi morfolojik karakterler ile yapılan ayırım,  kimyasal bulgular ile uyum göstermemektedir.

Buna göre I. grupta yer alan B. glandulosissima taşıdıðı fazla sayıda salgı tüyü nedeniyle diðer Ballota türlerinden morfolojik olarak kolayca ayrılmakta ve kimyasal bulgular bu sonucu desteklemektedir.

II. grubu oluşturan B. inaequidens bariz pedunkulu ile diðer akraba türlerden rahat bir şekilde ayrılmakta yine kimyasal bulgular bu sonucu desteklemektedir.

III. grubu oluşturan B. nigra subsp. foetida diðer B. nigra alt türlerinden morfolojik olarak kaliks diş yapısıyla ayrılmasına raðmen kimyasal olarak çok farklıdır.

IV. grupta yer alan B. rotundifolia ile B. saxatilis subsp. saxatilis morfolojik olarak kaliks diş yapısı ile birbirinden ayrılmasına raðmen kimyasal bulgular bu iki türü aynı grupta toplamıştır. Dolayısıyla morfolojik bulgularla kimyasal bulgular örtüşmemektedir.

V. grubu oluşturan B. nigra subsp. anatolica ve B. nigra subsp. nigra morfolojik olarak birbirine çok benzedikleri için kimyasal sonuçlar morfolojik yapıyı desteklemektedir.

VI. grupta yer alan B. latibracteolata morfolojik olarak geniş brakteol yapısıyla diðer Ballota türlerinden ayrılır, kimyasal olarakta diðer türlerden ayrılmaktadır.

VII: grubu oluşturan B. antalyense, B. larendana, B. saxatilis subsp. brachyodonta türleri morfolojik olarak tüy yapısı bakımından birbirine akraba türlerdir. Kimyasal sonuçlar da bunu desteklemektedir.

VIII. grupta yer alan B.nigra subsp. uncinata, B. macrodonta, B. pseudodictamnus subsp. lycia morfolojik olarak birbirinden tamamen farklı ve 3 farklı seksiyonda yer

 

 

alan türler olup kimyasal olarak gruplaşması morfolojik karakterlerle kimyasal yapının uyuşmadıðını gösterir.

IX. grubu oluşturan B. cristata ve B. acetabulosa dendroit tüy yapısıyla birbirine akraba olduðu için kimyasal olarak ta gruplaşmışlardır. Dolayısıyla kimyasal bulgularla morfolojik bulgular uyum göstermektedir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

V. Sonuç ve Öneriler

 

Bu çalışmada Türkiye’de yetişen Ballota türleri diterpen ve flavonoit içerikleri açısından incelenmiştir. Bu amaçla Türkiye’de yetişen tüm tür ve türaltı taksonları Ballota nigra subsp. kurdica dışında toplanmıştır. Bu bitkiye ait “Flora of Turkey and the East Aegean Islands” adlı eserde verilen lokalitelerden biri olan C6 : Maraş: Ahır daðı, 2000-2050 m’ ye gidilmiş ancak bitkiye rastlanamamıştır. B8: Muş: Teng vadisi’nde yapılan arazi çalşmalarında toplanan örneklerin ise Ballota nigra subsp. kurdica olmayıp Ballota nigra subsp. nigra olduðu saptanmıştır (Tezcan, 2001). Yine aynı çalışmada Türkiyenin çeşitli herbaryumlarında (AEF, ANK, EGE, ESSE, GAZI, HUB, ISTE, ISTF, ISTO, IZEF, KNYA) bulunan bitki örnekleri incelenmiş ancak yanlızca HUB’ta bulunan Bitlis: Tatvan H. Peşmen 3240 (HUB 21984) örneðinin bitkiye ait olduðu diðerlerinin yanlış teşhis olduðu saptanmıştır. Yine tarafımızdan yapılan arazi çalışmasında C3: Antalya: Finike, Turunçova-Elmalı yolu 5-10. km arası, hareketli yamaçlar, 150 m, 19.7.1997 olarak belirtilen lokaliteden toplanan bitki örneði F. Tezcan ve H. Duman tarafından Flora of Turkey’de yer almayan yeni bir tür olarak belirlenmiş ve bu taksona Ballota antalyense ismi verilmiştir (F.Tezcan & H. Duman nom.nud). Bu tür de kimyasal çalışmamıza dahil edilmiştir. Bu şekilde toplanan 16 taksonun asetonlu ekstresi Rodriguez ve arkadaşlarının (1979) kullandıðı yönteme göre hazırlanmış diterpen ve flavonoit açısından zengin türleri tespit edebilmek amacıyla ekstreler ITK ve YBSK ile incelenmiştir. YBSK yöntemi tarafımızdan oluşturulmuş ve bu incelemeler sonucunda kimyasal içerik açısından diðer türlere göre zengin olan Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens belirlenmiştir. Bu türler üzerinde daha önce hiç çalışma yapılmaması bitkileri daha ilginç hale getirmiştir. B. glandulosissima ve B. inaequidens’ten hareketle yine Rodriguez ve arkadaşlarının kullandıðı yönteme göre ekstre hazırlanmış, her bir ekstreden kolon kromatografisi ve Preparatif ITK yardımıyla saf bileşikler elde edilmiştir.

Ballota glandulosissima ekstresinden 7 adet flavonoit izole edilmiştir. Kumatakenol, pakipodol, 5-hidroksi-7,3’,4’ trimetoksi flavon, velutol, salvigenol, korimbosol, retusol. Flavonoitlerin yapıları UV kayma belirteçleriyle alınan UV spektrumları, 1H-NMR, 13C-NMR spektrumlarına ve ITK ile ötentik maddelerle mukayeselerine dayanarak aydınlatılmıştır.

Kumatakenol daka önce Ballota hirsuta, Hieracium intybaceum, Pogostemon cablin, Salvia glutinosa, Cistus ladanifer,Cistus laurifolius, Cistus monspeliensis, Cistus albidus, Cistus psilosepalus türlerinden elde edilmiş antimutajenik etkisiyle bilinen bir flavonoldür (Rodriguez ve ark., 1972; Wollenweber ve Mann, 1984; Ferreres ve ark., 1986; Wang ve ark., 1989; Miyazawa ve ark., 2000).

Pakipodol daha önce Plectranthus cylindraceus, Pogostemon cablin, Heterotheca grandiflora, Aglaia andamanica,Euodia glabra, Larrea tridentata türlerinden izole edilmiş bir flavonol olup (Valesi ve ark., 1972; Fraser ve Lewis, 1973; Sakakibara ve ark., 1976; Wollenweber ve ark., 1985; Miyazawa ve ark., 2000; Orabi ve ark., 2000) Ballota genusundaki varlıðı ilk kez bu çalışmayla açıklanmıştır. Ayrıca pakipodol antiviral etkilidir. Bu etkiyi ise viral RNA sentezi işleminde RNA polimerazı inhibe edip viral replikasyonu engelleyerek göstermektedir (Ninomiya ve ark., 1985; Ishitsuka ve ark., 1986; Pérez ve Carrasco, 1992). Başka bir çalışmada bileşiðin antiemetik etkisi olduðu gösterilmiştir. (Yang ve ark., 1999). Yine antimutajenik etkisinden bahseden çalışma da bulunmaktadır ( Miyazawa ve ark., 2000)

5-hidroksi-7,3’,4’ trimetoksi flavon daha önce Striga asiatica türünden elde edilen bir flavondur (Nakanishi ve ark., 1985). Ballota genusundaki varlıðı ilk kez bu çalışmayla açıklanmıştır.

Velutol daha önce, Lychnophara granmangolense, Achillea depressa, Lethedon tannaensis,Larreatridentata,Ceanothus velutines türlerinden elde edilen bir flavondur (Das ve ark., 1970; Sakakibara ve ark., 1976; Tsankova ve Ognyanov, 1985; Zahir ve ark., 1996; Grael ve ark., 2000). Ballota genusundaki varlıðı ilk kez bu çalışmayla açıklanmıştır. Ayrıca velutol’ün P-388 (murin lökoma) ve KB (insan nazofarenks karsinoması)’ na karsı in-vitro aktif olduðu bulunmuştur (Zahir ve ark., 1996).

Salvigenol (pisatirotol) Ballota hirsuta, Centaurea ornata, Orthosiphon  stamineus, Salvia aethiopis, Sideritis congesta türlerinden elde edilen bir flavondur. 6. karbonda metoksil sübstitüenti taşıması nedeniyle kemotaksonomik olarak önemlidir. 6. karbonda metoksil sübstitüenti taşıyan flavonoitler Ballota türleri ile Phlomis türlerini birbirinden ayıran önemli bir özelliktir (Ulubelen ve Uygur, 1976; Sezik ve Ezer, 1984; Ferreres ve ark., 1986;  Navarro ve ark., 1990; Tezuka ve ark., 2000).

Korimbosol daha önce Turbina corymbosa bitkisinden izole edilmiş bir flavondur (Garcia ve Perezamador, 1967). B halkasında 3’, 4’, 5’ konumlarında hidroksil grupları taşıması nedeniyle diðerlerinden farklıdır. Ballota genusundan ilk kez izole edilmiştir.

Retusol daha önce Ballota saxatilis subsp. saxatilis, Boesenbergia pandurata, Aframomum giganteum, Larrea tridentata, Chrysosplenium grayanum türlerinden elde edilen bir flavonoldür (Vidari ve ark., 1971; Sakakibara ve ark., 1976; Jaipetch ve ark., 1983; Arisawa ve ark., 1991; Çitoðlu ve ark., 1999). Ayrıca retusol’ün  KB (insan nazofarenks karsinoması)’ na karsı in-vitro sitotoksik olduðu bulunmuştur (Arisawa ve ark., 1991). Bunun yanısıra antiemetik etki de saptanmıştır (civcivler üzerinde bir araştırma yapılmış ve CuSO4 ile emezis oluşturulan civcivlere Pogostemon cablin isimli bitkinin n-hekzanlı ekstresi verilerek bu test gerçekleştirilmiştir)(Yang ve ark., 1999).

Sonuçta Ballota glandulosissima ekstresinden izole edilen 7 flavonoit aglikonundan 4 tanesi genus düzeyinde bitkiden ilk kez izole edilmiştir.

Ballota inaequidens ekstresinden ise hispanolon ve ballonigrin isimli diterpen yapıdaki iki bileşik ile 5-hidroksi-3,7,4’ trimetoksi flavon, retusol, 5-hidroksi-7,4’ dimetoksi flavon, pakipodol, filindulatol, 5-hidroksi-7,3’,4’ trimetoksi flavon isimli 6 adet flavonoit  saf olarak izole edilmiştir. Bu flavonoitlerden pakipodol, retusol, 5-hidroksi-7,3’,4’ trimetoksi flavon yine bu tez kapsamında Ballota glandulosissima’dan da izole edildiði için ayrıca tartışılmamıştır. Diðer flavonoitlerin yapı tayinleri UV kayma belirteçleriyle alınan UV spektrumları., 1H-NMR, 13C-NMR spektrumlarına ve ITK ile ötentik maddelerle mukayeselerine dayanarak aydınlatılmıştır.

5-hidroksi-3,7,4’ trimetoksi flavon daha önce Ballota saxatilis subsp. saxatilis, Heterotheca psammophila, Boesenbergia pandurata, Aframomum giganteum türlerinden elde edilen bir flavonoldür (Vidari ve ark., 1971; Jaipetch ve ark., 1983; Wollenweber ve ark., 1985; Çitoðlu ve ark., 1999).

5-hidroksi-7,4’ dimetoksi flavon daha önce, Ballota pseudodictamnus, Baccharis rhomboidalis, Boesenbergia pandurata türlerinden elde edilen bir flavondur (Silva ve ark., 1971; Savona ve ark., 1982; Jaipetch ve ark., 1983).

Filindulatol daha önce Cistus albanicus türünden elde edilen bir flavonoldür (Vogt ve ark., 1987). Ballota genusundaki varlıðı ilk kez bu çalışmayla açıklanmıştır. 8. konumda metoksil sübstitüenti taşımasıyla kemotaksonomik olarak önemlidir. Çünkü Lamiaceae familyasından izole edilmiş flavonollerin sadece % 18’inin 8. konumda metoksil sübstitüentine rastlanmıştır (Harborne, 1988).

Böylece Ballota inaequidens’ten izole edilen 6 flavonoitin 1 tanesi genus düzeyinde yeni flavonoittir.

Ballota inaequidens’ten izole edilen hispanolon ve dehidrohispanolon isimli diterpenlerin yapısı UV, kütle, 1H-NMR, 13C-NMR spektral yöntemleriyle aydınlatılmış ayrıca tek ve çift dimensiyonlu tekniklerden de yararlanılmıştır (COSY, DEPT, HMBC, HMQC).

Hispanolon daha önce Ballota hispanica, Ballota andreuzziana, Ballota saxatilis subsp. saxatilis, Ballota africana, Galleopsis angustifolia bitkilerinden izole edilmiş furanolabdan yapısında bir diterpendir (Savona ve ark., 1978; Rodriguez ve ark., 1979 ; Davies-Coleman ve ark., 1990; Çitoðlu ve ark., 1998).

Ballonigrin daha önce Ballota nigra, Ballota rupestris, Ballota pseudodictamnus, Ballota saxatilis subsp. saxatilis, Ballota lanata bitkilerinden izole edilmis furanolabdan yapısında bir diterpendir (Savona ve ark., 1976; 1977a, 1978,1982;  Çitoðlu ve ark., 1998).

Bu diterpenler de kemotaksonomik açıdan önemlidir, çünkü 7. karbon atomlarında oksijen fonksiyonunun bulunması Ballota’ları Marrubium’lardan ayıran bir özelliktir (Savona ve ark., 1982).

Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens’ten izole edilen ve yapıları spektral yöntemlerle aydınlatılan bu saf maddelere, daha önce tarafımızdan Ballota saxatilis subsp. saxatilis’ten izole edilen (Çitoðlu ve ark., 1998) dehidrohispanolon (BS-1) ve ladaneol (BS-2) eklenerek bu maddeler standart olarak alınmış ve bu maddelerin diðer Ballota türlerindeki daðılımları ITK ve yine tarafımızdan geliştirilen yöntemle YBSK da incelenmiştir. Bu analizlerden elde edilen kimyasal veriler  Flora of Turkey and the East Aegean Islands’ta verilen morfolojik verilerle karşılaştırılarak kemotaksonomik bir yaklaşım elde edilmiştir. Buna göre Ballota türlerinin birbirinden ayrılmasında en

önemli karakterler olan kaliks şekli, kaliks yapısı ve sayısı temel alınarak yapılan taksonomik ayırımın kimyasal verilerle tam olarak uyum göstermediði ancak tüy yapısı temel alındıðında uyum gösterdiði saptanmıştır. Ayrıca elde edilen dendrogram yardımıyla Ballota glandulosissima ile Ballota acetabulosa’nın birbirine en uzak türler olduðu saptanmıştır. Ballota glandulosissima taşıdıðı fazla sayıda salgı tüyüyle de diðer Ballota türlerinden kolayca ayrılmaktadır. Bulgular kısmında da belirttiðimiz gibi bu sonuçlar taksonomik bir çalışmaya ışık tutabilir. Ancak kesin bir deðerlendirme için daha fazla bileşik izolasyonu ve morfolojik karakterlerin yanı sıra anatomik, palinolojik ve sitogenetik karakterlerin de kullanılması gerekmektedir. Bu yöntemlerin ilvesiyle taksonomik problemler daha kolay aydınlatılabilecek akrabalık ilişkileri de daha rahat açıklanabilecektir.

Sonuç olarak yapılan bu çalışma ile Türkiye’de yetişen tüm Ballota türleri ve alt türleri toplanmış Ballota glandulosissima ve Ballota inaequidens’ten 2 si diterpen 13’ü flavonoit yapıda 15 adet saf madde izole edilmiştir. Bu maddelerden 5’inin Ballota genusundaki varlıðı ilk kez bu çalışmayla ortaya konmuştur. Saf halde elde edilen bu maddelerin yapıları aydınlatılıp diðer Ballota türlerindeki daðılımı YBSK ile incelenmiştir. Izole edilen iki flavonoit (salvigenol ve filindulatol) Lamiaceae familyası bitkilerinde nadir bulunan flavonoitlerdir.

Ayrıca kümeleme analizi yöntemiyle de türler arasındaki akrabalık ilişkileri de yorumlanmıştır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

VI. Kaynaklar

 

 

ARISAWA, M., HAYASHI, T., SHIMIZU, M., MORITA, N., BAI, H., KUZE, S.,         ITO, Y.  (1991). Isolation and cytotoxicity of two new flavonoids from Chrysosplenium grayanum and related flavonols. Journal of Natural Products,             54(3): 898-901.

 

BAYTOP, T. (1984). Türkiye’de Bitkilerle Tedavi. Istanbul Üniversitesi   Yayınları,          Istanbul, s: 371.

 

ÇITOÐLU, G., TANKER, M., SEVER, B. (1999). Flavonoid aglycones from Ballota      saxatilis subsp. saxatilis. Pharmaceutical Biology, 37(2): 158-160.

 

ÇITOÐLU, G., TANKER, M., SEVER, B., ENGLERT, J., ANTON, R.,             ALTANLAR, N. (1998). Antibacterial activities of diterpenoids isolated from     Ballota saxatilis subsp. saxatilis. Planta Medica, (64): 484-485.

 

DAS, K.C., FARMER, W.J., WEINSTEIN, B. (1970). Phytochemical studies, IX. A new            flavone, velutine. Journal of Organic Chemistry, 35(11): 3989-3990.

 

DAVIES-COLEMAN, M. T., RIVETT, D. E .A. (1990). Transformation of  hispanolone             from Ballota africana into 15,16-epoxy-9-hydroxylabda-     13(16),14-diene. South African Journal of Chemistry, 43(3/4): 117-119.

 

DAVIS, P.H. (1982). Flora of Turkey and The East Aegean Islands. Edinburgh Univ.      Press. Edinburg, vol: 7, p: 156-160.

 

ERYAŞAR, P., TUZLACI, E. (1998). Gönen (Balıkesir) halk hekimliðinde kullanılan        bitkiler. XII. Bitkisel Ilaç Hammaddeleri Toplantısı Hacettepe-Ankara: Mayıs 20-22.

 

FERRERES, F., TOMAS-BARBERAN, F. A. TOMAS-LORENTE, F. (1986).

            Flavonoid compounds from Ballota hirsuta. Journal of Natural Products, 49(3):           554-555.

 

FRASER, A.W., LEWIS, J.R.(1973). Two flavonols from Euodia glabra.          Phytochemistry, 12: 1787-1789.

 

GARCIA, J., PEREZAMADOR, M.C. (1967). Corymbosin, a glucoside from Turbina     corymbosa. Tetrahedron, 23(6): 2557-2561.

 

GARNIER, G., DEBRAUX, G., BÉZANGER-BEAUQUESNE, L. (1961). Ressources   Médicinales de la Flore Française. Vigot Fréres Éditeurs, Paris, p.:1156-1158.

 

.GRAEL, C.F.F., VICHNEWSKI, W., PETTODESOUZA, G.E., LOPES, J.L.C.,           ALBUQUERQUE, S., CUNHA, W.R. (2000). A study of the trypanocidal and      analgesic properties from Lychnophora granmongolense (Duerte) Semir &             Leitao Filho. Phytotherapy Research, 14(3): 203-206.

 

GREUTER, W., RAUS, T. (1998). Med-checklist Notulae, 17. Willdenowia, 28: 168.

 

 

HARBORNE, J.B. (1988). The flavonoids advances in research since 1980. Chapman and           Hall, London: 1988.

 

ISHITSUKA, H., NINOMIYA, Y., SUHARA, Y. (1986). Molecular basis of drug          resistance to new antirhinovirus agents. Journal of Antimicrobial          Chemotherapy 18:       suppl. B, 11-18.

 

JAIPETCH, T., REUTRAKUL, V., TUNTIWACHWUTTIKUL, P., SANTISUK, T.     (1983). Flavonoids in the black rhizomes of Boesenbergia pandurata. Phytochemistry, 22(2): 625-626.

 

MABRY, T.J., MARKHAM, K.R., THOMAS, M.B. (1970). The systematic      identification of flavonoids. Springer-Verlag, Berlin.Heidelber, New York.

 

MERIÇLI, A. H., MERIÇLI, F., TUZLACI, E. (1988). Flavonoids of  Ballota

            acetabulosa. Acta Pharmaceutica Turcica, 30: 143-144.

 

MIYAZAWA, M., OKUNO, Y., NAKAMURA, S., KOSAKA, H.(2000).          Antimutagenic activity of flavonoids from Pogostemon cablin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(3): 642-647.

 

NAKANISHI, T., OGAKI, J., INADA, A., MURATA, H., NISHI, M. (1985). Flavonoids of       Striga asiatica. Journal of Natural Products, 48(3): 491-493.

 

NAVARRO, J.J., CABALLERO, M.C., MORÁN, J.R., GRANDE, M., ANAYA, J.      (1990). Guaianolides and eudesmanolides from Centaurea ornata. Journal of      Natural Products, 53(3): 573-578.

 

NINOMIYA, Y., AOYAMA, M., UMEDA, I., SUHARA, Y., ISHITSUKA, H.             (1985). Comparative studies on the modes of action of the Antirhinovirus      agents Ro 09-0410,        Ro 09-0179, RMI-15,731, 4’, 6-dichloroflavan and enviroxime. Antimicrobial   Agents and Chemotherapy, 27(4): 595-599.

 

ORABI, K.Y., MOSSA, J.S., MUHAMMED, I., ALLOUSH, M.H., GALAL, A.M., EL-            FERALY, F.S., McPHAIL, E.T.(2000). New eudesmane sesquiterpene        from     Plectranthus cylindraceus. Journal of Natural Products, 63: 1665-1668.

 

PATZAK, V.A. (1958). Revision der Gattung Ballota section Acanthoprasium und          section Beringeria. Annalen des Naturhistorischen Museums in Wien:, 62: 57-86.

 

PATZAK, V.A. (1960). Zwei nene Ballota-Arten aus der Türkei nebst einem Nachtrag zur         Gattung Ballota. Annalen des Naturhistorischen Museums in Wien, 64: 42-56

 

PÉREZ, L., CARRASCO, L. (1992). Lack of direct correlation between p220 cleavage   and       the Shut-off of host translation after Poliovirus infection. Virology, 189:        178-186.

 

 

RODRIGUEZ, E., CARMAN, N.J., VANDER VELDE, G., McREYNOLDS, J.H.,        MABRY, T.J. (1972). Methoxylated flavonoids from Artemisia.         Phytochemistry,            11: 3509-3514.

 

RODRIGUEZ, B., SAVONA, G., PIOZZI, F. (1979). Two new unusual diterpenoids       from Ballota hispanica. Journal of  Organic  Chemistry, 44(13): 2219-2221.

 

SAKAKIBARA, M., DIFEO, D., NAKATANI, J.N., TIMMERMANN, B., MABRY, T.S.         (1976). Flavonoid methyl ethers on the external leaf surface of Larrea tridentata and        Larrea divaricata. Phytochemistry, 15: 727-731.

 

SAVONA, G., BRUNO, M., PIOZZI, F., BARBAGALLO, C. (1982). Diterpenes           from Ballota species. Phytochemistry, 21(8): 2132-2133.

 

SAVONA, G., PIOZZI, F., HANSON, J. R. (1978). 13-hydroxyballonigrinolide, a new     diterpenoid from Ballota lanata. Phytochemistry, 17: 2132-2133.

 

SAVONA, G., PIOZZI, F., HANSON, J. R., SIVERNS, M. (1976). Structures of            allotinone a diterpenoid from Ballota nigra. Journal of  Chemical Society Perkin     Trans I, 3(23): 1606-1609.

 

SAVONA, G., PIOZZI, F., HANSON, J. R., SIVERNS, M. (1977).Structures of             three new         diterpenoids from Ballota species Journal of  Chemical Society Perkin   Trans I, 1:        322-324.[KY1] 

 

SEZIK, E., EZER, N. (1984). Phytochemical investigations on the plants used as folk

            medicine and herbal tea in Turkey. Acta Pharmaceutica Turcica, 26: 4-9.

 

SILVA, M., MUNDACA, J.M., SAMMES, P.G. (1971). Flavonoid and triterpene            constituents of Baccharis rhomboidalis. Phytochemistry, 10: 1942-1943.

 

TANKER, M., ŞARER, E., ATASÜ, E., YENEN, M., ÖZKAL, N., KURUCU, S.          (1986). Farmakognozi uygulama örnekleri, Ankara.

 

TEZUKA, Y., STAMPOULIS, P., BANSKOTA, A.H., AWALE, s, TRAN, K.Q.     (2000). Constituents of the Vietnamese medicinal plant Orthosiphon stamineus.             Chemical Pharmaceutical Bulletin, 48(11): 1711-1719.

 

TEZCAN, F. (2001). Ballota (L.) cinsinin revizyonu. GAZI Üniversitesi Fen Bilimleri       Enstitüsü, Doktora Tezi, Ankara.

 

TOLON FENERCIOÐLU, E., TUZLACI, E. (1998). Şile (Istanbul) halk hekimliðinde     kullanılan bitkiler. XII. Bitkisel Ilaç Hammaddeleri Toplantısı Hacettepe-      Ankara:            Mayıs 20-22.

 

TSANKOVA, E., OGNYANOV, I. (1985). Chemical constituents of Achillea depressa.             Planta medica, 180.

 

TUZLACI, E., TOLON, E. (2000). Folk medicinal plants of Şile  (Istanbul, Turkey).         Fitoterapia, 71: 673-685.

 

 

ULUBELEN, A., UYGUR, I. (1976). Flavonoidal and other compounds of Salvia            aethiopis. Planta medica, 29: 319-320.

 

VALESI, A., RODRIGUEZ, E., VELDE, G.V., MABRY, T.J. (1972). Methylated          flavonols in Larrea cuneifolia. Phytochemistry, 11: 2821-2826.

 

VIDARI, G., FINZI, P.V., BERNARDI, M. (1971). Flavonols and quinones in stems of   Aframomum giganteum. Phytochemistry, 10: 3335-3339.

 

VOGT, T., PROKSCH, P., GULZ, P.G., WOLLENWEBER, E. (1987). Rare 6- and 8-O-           methylated epicuticular flavonols from two Cistus  species. Phytochemistry, 26(4):        1027-1030.

 

WAGNER, H., BLADT, S., ZGAINSKI, E.M. (1984). Plant Drug Analysis. A Thin         Layer Chromatography Atlas. Springer Verlag New York, Toronto.

 

WANG, Y., HAMBURGER, M., GUEDO, J., HOSTETTMANN, K. (1989).      Antimicrobial Flavonoids from Psiadia trinervia and their methylated and          acetylated derivates. Phytochemistry, 28(9): 2323-2327.

 

WOLLENWEBER, E., MANN, K. (1984).  Flavonoid aglycones in the leaf resin of         some Cistus species. Zeitschrift fur Naturforschung C, 39c:  303-306.

 

WOLLENWEBER, E., SCHOBER, I., CLARK, W.D., YATSKIEVYCH, G. (1985).

            Flavonoid aglycones from leaf resins of two species Heterotheca (Compositae).             Phytochemistry, 24(9): 2129-2131.

 

YANG, Y., KINOSHITA, K., KOYAMA, K., TAKAHASHI, K., TAI, T.,         NUNOURA, Y., WATANABE, K. (1999). Anti-emetic principles of  Pogostemon   cablin (Blanco) Benth. Phytomedicine, 6(2): 89-93.

 

YEŞILADA, E., HONDA, G., SEZIK, E., TABATA, M., FUJITA, T., TANAKA, T.,     TAKEDA, Y., TAKAISHI, Y. (1995). Traditional medicine in Turkey. V. folk    medicine in the inner Taurus Mountains. Journal of Ethnopharmacology, 46:       133-152.

 

YEŞILADA, E., HONDA, G., SEZIK, E., TABATA, M., GOTO, K., IKESHIRO, Y.     (1993). Traditional medicine in Turkey IV. Folk medicine in the Mediterranean   subdivision. Journal of Ethnopharmacology, 39: 31-38.

 

ZAHIR, A., JOSSANG, A., BODO, B., PROVOST, J., COSSON, J-P., SÉVENET,       T.(1996). DNA topoisomerase I Inhibitors: Cytotoxic flavones from Lethedon      tannaensis. Journal of Natural Products, 59: 701-703.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

VII. Ekler

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 [KY1]