T.C
ANKARA
ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL
ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
BAĞCILIKTA
ANAÇ ve KALEM ARASINDAKİ
UYUŞMA
DÜZEYİNİN BİYOKİMYASAL
YÖNTEMLERLE
BELİRLENMESİ
Prof.Dr.Gökhan
SÖYLEMEZOĞLU
Proje No: 98-11-01-09
Başlama
Tarihi: Ocak 1999
Bitiş Tarihi:
Ocak 2002
Rapor Tarihi:
2003
Ankara
Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara 2003
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
Özet i
Abstract ii
Çizelgeler Dizini iii
Şekiller Dizini iv
1. Amaç ve Kapsam 1
2. Materyal ve Yöntem 2
2.1. Materyal 2
2.2. Yöntem 5
3. Bulgular 10
4. Tartışma 24
5. Kaynak Listesi 26
BAĞCILIKTA ANAÇ ve KALEM ARASINDAKİ AŞI UYUŞMA DÜZEYİNİN BİYOKİMYASAL YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ
DETERMINATION of GRAFTING
COMPATIBILITY BETWEEN ROOTSTOCK and SCION IN VITICULTURE with BIOCHEMICAL METHODS
Özet
Bağcılıkta, filoksera veya nematod zararına karşı koyamadığından kendi
kökleri üzerinde yetiştirilemeyen V.vinifera L. türüne ait yerli ve
yabancı kökenli üzüm çeşitlerinin, bu zararlılara değişik düzeylerde dayanım
gösteren Amerikan asma anaçları üzerine aşılanarak yetiştirilmesi, doğal olarak
anaç ve kalem arasındaki uyuşma sorununu da beraberinde getirmiş ve bu sorunu
aşmak için birbirleri ile daha iyi uyuşan aşı kombinasyonlarının belirlenmesine
yönelik çalışmalar giderek önem kazanmıştır.
Özellikle son yıllarda, aşı uyuşmazlığının belirlenmesi amacıyla geliştirilen yöntemlerden en önemlisi, anaç ile kalemin biyokimyasal metodlarla, elektroforez tekniğiyle protein ve izoenzim bant desenlerini çıkararak uyuşma katsayılarının belirlenmesidir. Ayrıca protein ve izoenzim bant desenlerinin densitometrik olarak analiz edilmesi ve uyuşma katsayılarının belirlenmesi de son yıllarda kullanılan yöntemlerden birisidir.
Bu çalışmada; çok zengin bir asma gen potansiyeline sahip olan ülkemizde, çeşit anaç kombinasyonlarında aşı uyuşma durumunun çevre koşullarına bağlı olmaksızın, kesin olarak ve kısa süre içerisinde belirlenmesinde farklı biyokimyasal yöntemlerin etkinliğinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır.
Araştırmada kullanılan 15 üzüm çeşidi (Alphonse Lavallèe, Amasya, Ata
Sarısı, Cardinal, Çavuş, Emir, Gülüzümü, Hafızali, Hamburg Misketi, Italia,
Kalecik Karası, Narince, Pinot noir, Razakı ve Riesling) ile 12 Amerikan asma
anacının ( 99 R, 110 R, 8 B, 5 BB,
Anahtar Kelimeler:
üzüm, çeşit, anaç, aşı, uyuşma, izoenzim, peroksidaz, esteraz, asit
fosfataz, protein
Abstract
Grafting, a process combining Vitis vinifera L. grape cultivars with American rootstocks resistant to phylloxera and nematodes and growing them as a union has brought about a phenomenon “grafting incompatibility” in viticulture. Studies have advanced in this field of research to determine the best compatible scion/ rootstock comninations.
In recent years, especially the most important technique developed to determine grafting incompatibility is to use protein and isoenzyme banding patterns obtained with electrophoresis and to derive constants for compatibility. In addition, densitometrical analysis of protein and soenzyme banding patterns is also used.
This study was carried out to determine the efficacy of different biochemical methods in determination of grafting incompatibility conclusively and in a short time in grapes grown in Turkey, a country with a rich gene potential.
After
evaluation of banding patterns of three different enzyme systems (Peroxidase,
PER; Esterase, EST; Acid phosphatase, AcPH) and total protein in 15 grape cultivars
(Alphonse Lavallèe, Amasya, Ata Sarısı, Cardinal, Çavuş, Emir, Gülüzümü,
Hafızali, Hamburg Misketi, Italia, Kalecik Karası, Narince, Pinot noir, Razakı
and Riesling) and 12 American grapevine
rootstocks ( 99 R, 110 R, 8 B, 5 BB,
Key Words: grape, rootstock, cultivar, compatibility, peroxidase, esterase, acid phosphatase, protein.
Çizelgeler Dizini
Çizelge 1. Aşı uyuşma düzeyleri
belirlenen olan üzüm çeşitlerinin önemli özellikleri
Çizelge 3. Araştırmada kullanılan
ayırım ve yükleme jelleri ile elektrot
tampon çözeltileri ve
İçerikleri
Çizelge 4. SDS-PAGE tekniğinde ayırım ve yükleme jeli
ile elektrot tampon çözeltileri ve
İçerikleri
Çizelge 5. Araştırmada kullanılan çeşit ve Amerikan asma anaçlarına ait enzim sistemleri ile
toplam protein bantlarının Rf değerleri
Çizelge 6. PER enzim sisteminde çeşit ve anaçlara ait Kalem-Anaç uyuşma katsayıları
Çizelge 7. EST enzim sisteminde çeşit ve anaçlara ait Kalem-Anaç uyuşma katsayıları
Çizelge 8. AcPH enzim sisteminde çeşit ve anaçlara ait Kalem-Anaç uyuşma katsayıları
Çizelge 9. Toplam Protein sisteminde çeşit ve anaçlara ait Kalem-Anaç uyuşma katsayıları
Çizelge10. PER enzim sisteminde çeşit ve anaçlara ait Anaç- Kalem uyuşma katsayıları
Çizelge 11. EST enzim sisteminde çeşit ve anaçlara ait Anaç- Kalem uyuşma katsayıları
Çizelge 12. AcPH enzim sisteminde çeşit ve anaçlara ait Anaç- Kalem uyuşma katsayıları
Çizelge 13. Toplam Protein sisteminde çeşit ve anaçlara ait Anaç- Kalem uyuşma katsayıları
Çizelge 14. Üç değişik enzim sistemi ile toplam protein açısından çeşit-anaç ve anaç-çeşit
kombinasyonlarına göre uyuşma durumları
Şekiller Dizini
Şekil 1. Araştırmada kullanılan üzüm çeşitleri
Şekil 2. Araştırmada kullanılan Amerikan asma anaçları
Şekil 3. Peroksidaz enzim sisteminde Amerikan asma anaçlarına ait bant desenleri
Şekil 4. Peroksidaz enzim sisteminde üzüm çeşitlerine ait bant desenleri
Şekil 5. Esteraz enzim sisteminde Amerikan asma anaçlarına ait bant desenleri
Şekil 6. Esteraz enzim sisteminde üzüm çeşitlerine ait bant desenleri
Şekil 7. Asit fosfataz enzim sisteminde Amerikan asma anaçlarına ait bant desenler
Şekil 8. Asit fosfataz enzim sisteminde üzüm çeşitlerine bant desenleri
Şekil 9. Amerikan asma anaçlarına ait Toplam Protein bant desenleri
Şekil 10. Üzüm çeşitlerine ait Toplam Protein bant desenleri
1. Amaç ve
Kapsam
Filoksera veya nematod zararına karşı koyamadığından kendi kökleri üzerinde yetiştirilemeyen V.vinifera L. türüne ait yerli ve yabancı kökenli üzüm çeşitlerinin, bu zararlılara değişik düzeylerde dayanım gösteren Amerikan asma anaçları üzerine aşılanarak yetiştirilmesi, doğal olarak anaç ve kalem arasındaki uyuşma sorununu da beraberinde getirmiş ve bu sorunu aşmak için birbirleri ile daha iyi uyuşan aşı kombinasyonlarının belirlenmesine yönelik çalışmalar giderek önem kazanmıştır.
EUVITIS alt cinsine ait türler arasında mutlak anlamda aşı uyuşmazlığı sözkonusu olmamasına karşın, anatomik yapı farklılıklarının yanısıra, aşı birlikteliğinin ileri dönemlerinde ortaya çıkan biyokimyasal uyumsuzluklar, aşılı asmaların performansını önemli ölçüde olumsuz yönde etkileyebilmektedir.
Bağcılıkta anaç ve kalem arasındaki aşı uyuşmazlığının belirlenmesinde en iyi sonuç veren yöntemlerden birisi, bağda aşılı omcalar üzerinde yapılan değerlendirmelerdir (Hidalgo ve Candela 1979). Pratikte, genellikle aşı noktasının altında ve üstünde anaç ve kalem arasındaki gelişme farklılıkları, uyuşmazlık belirtisi olarak kabul edilmektedir. Ancak aşılı asma, gelişme ve verim yönünden normal bir performans gösteriyorsa, aşı noktasının altında ve üstünde meydana gelmiş olan gelişme farklılıkları, her zaman bir uyuşmazlık göstergesi olmayabilir (Reynier 1982).
Aşı noktasının altında ve üstünde
yani anaç ve kalemde meydana gelen gelişme farklılıklarının
çap cinsinden ölçülerek Branas tarafından geliştirilen uyuşma katsayısı, Perraudine adlı araştırıcı tarafından modifiye
edilmiştir ve bu uyuşma katsayısı formülü halen yaygın olarak kullanılmaktadır (İnal ve Barış
Bağda aşılı bitkiler üzerinde yapılan çalışmalar, kalem ile anaç arasındaki uyuşma hakkında pratik anlamda en iyi fikir veren yöntemlerden biri olmasına rağmen, oldukça önemli dezavantajları da söz konusudur. Bunlardan en önemlisi, elde edilen sonuçların kolaylıkla genelleştirilememesidir. Çünkü uyuşma göstergeleri, göz önünde bulundurulan ürün miktarı, şeker üretimi, şıradaki şeker miktarı, budama odunu ağırlığı gibi kriterler büyük ölçüde çevre koşullarına bağlıdır. Bu yöntemin bir diğer dezavantajı ise affinite ya da uyuşma katsayısının, anaç çevresinin kalem çevresine oranı gibi kriterlerin aşılamadan ancak 4-5 yıl sonra geçerlilik kazanmaya başlamasıdır. Çünkü bu ve bu gibi uyuşma durumunu (affinite düzeyini) belirleyebileceğimiz kriterlerin elde edilebilmesi için aşılı asmanın ürüne yatmış olması zorunludur. Bu nedenlerle, son yıllarda araştırıcılar anaç ve kalem arasındaki uyuşma düzeyini, mümkün olan en erken dönemde daha kısa sürede ve daha kesin bir şekilde belirleyebilecek çalışmalara yönelmişlerdir.
Özellikle son yıllarda, aşı uyuşmazlığının belirlenmesi amacıyla geliştirilen yöntemlerden en önemlisi, anaç ile kalemin biyokimyasal metodlarla, elektroforez tekniğiyle protein ve izoenzim bant desenlerini çıkararak uyuşma katsayılarının belirlenmesidir. Ayrıca protein ve izoenzim bant desenlerinin densitometrik olarak analiz edilmesi ve uyuşma katsayılarının belirlenmesi de son yıllarda kullanılan yöntemlerden birisidir.
Farklı moleküler forma ve kinetik özelliklere sahip olan ve aynı reaksiyonu katalize eden enzimlere izoenzim adı verilmektedir. İzoenzimler, tek gen belirleyicilerinden biri (markör) olma özelliğinde olup, genellikle kalıtımda kodominanttır. Günümüzde bitki ıslahı bitki populasyon genetiği, sistematik, somatik hücre genetiği gibi bitki biyolojisinin hemen hemen tüm alanlarında kullanılmaktadır.
Bunun dışında çeşitlerin ayırımında da izoenzimlerden çok geniş ölçüde yararlanılmaktadır (Söylemezoğlu 1996, Arulsekar ve Parfitt 1986).
Bu çalışmada; asmanın ve bağcılık kültürünün ana vatanı olması sebebiyle çok zengin bir asma gen potansiyeline sahip olan ülkemizde, modern bağcılığın gereği olan aşılamanın ortaya çıkardığı çeşit anaç kombinasyonlarında aşı uyuşma durumunun çevre koşullarına bağlı olmaksızın, kesin olarak ve kısa süre içerisinde belirlenmesinde farklı biyokimyasal yöntemlerin etkinliğinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır.
2.
Materyal ve Yöntem
2.1. Materyal
Araştırma Ocak 1999 - Ocak 2002 tarihleri arasında Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümüne ait Hasat Sonrası Fizyolojisi Laboratuvarı Elektroforez Ünitesi ve Soğuk Hava Depolarında yürütülmüştür.
Araştırmada
aşı uyuşma durumları belirlenen çeşitlerinin önemli özellikleri Çizelge 1’de verilmiştir
(Çelik ve ark 1998a, Çelik 2002).
Çizelge 1. Aşı uyuşma düzeyleri belirlenen olan üzüm çeşitlerinin
önemli özellikleri
|
Çeşidin adı |
Rengi |
Değerlendirme şekli |
Tane şekli ve iriliği |
Olgunluk zamanı |
|
Alphonse Lavallèe |
Siyah |
Sofralık |
Basık yuvarlak-İri |
Orta mevsim |
|
Amasya |
Beyaz |
Sofralık |
Yuvarlak-İri |
Orta mevsim |
|
Ata sarısı |
Beyaz |
Sofralık |
Yuvarlak- Çok iri |
Orta geç |
|
Cardinal |
Mor |
Sofralık |
Yuvarlak- İri |
Erken |
|
Çavuş |
Beyaz |
Sofralık |
Yuvarlak- İri |
Orta erken |
|
Emir |
Beyaz |
Şaraplık |
Yuvarlak-Orta |
Orta mevsim |
|
Gülüzümü |
Pembe |
Sofralık |
Oval- Orta |
Orta erken |
|
Hafızali |
Beyaz |
Sofralık |
Elips-İri |
Orta geç |
|
Hamburg Misketi |
Siyah |
Sofralık |
Hafif oval-Orta |
Orta mevsim |
|
Italia |
Beyaz |
Sofralık |
Hafif oval- İri |
Orta mevsim |
|
Kalecik karası |
Siyah |
Şaraplık |
Yuvarlak- Orta |
Orta mevsim |
|
Narince |
Beyaz |
Şaraplık |
Yumurta- Orta |
Orta geç |
|
Pinot noir |
Siyah |
Şaraplık |
Yuvarlak- Küçük |
Orta erken |
|
Razakı |
Beyaz |
Sofralık |
Uzun elips-İri |
Orta |
|
Riesling |
Beyaz |
Şaraplık |
Yuvarlak Küçük |
Orta mevsim |
Araştırmada kullanılan Amerikan asma anaçlarının özellikleri de şöyledir (Çelik 1998):
99R (Vitis berlandieri Las sorres x V. rupestris du Lot): Kuvvetli bir anaç olup üzerine aşılanan çeşidin olgunlaşmasını geciktirme eğilimi olduğundan kuzey bölgelerde kullanılması tavsiye edilmemektedir. Kökleri filokseraya iyi dayanmakla beraber yaprakları filoksera galleri ile kaplanmaktadır. Kirece dayanımı yüksektir ancak tuza dayanımı azdır. Kurak şartlara biraz duyarlıdır. Nematodalara oldukça dayanıklıdır. İyi odunlaşan ve köklenen 1 yaşlı dallara sahiptir. Bağdaki aşılamalara iyi sonuç vermesine karşın masabaşı aşılamasına oldukça duyarlıdır.
110 R (V. berlandieri Rességuier No.2 x V. rupestris Martin): Kuvvetli bir anaçtır ve üzerine aşılanan çeşidi geç olgunlaştırmaya meyillidir. Aktif kirece dayanımı iyi ve kurağa çok dayanıklıdır. Köklenme oranı düşük olmasına rağmen bağdaki aşılamalarda iyi sonuç vermektedir. Masabaşı aşılarda ise başarı orta derecededir. 1 yaşlı dalların odunlaşması zayıftır.
Teleki 8 B (V. berlandieri x V. riparia): Kurağa dayanıklıdır. Aktif kirece ve nematodlara dayanıklıdır. Aşı tutma oranı iyi olmasında rağmen köklenme oranı düşüktür.
Kober 5 BB (V. berlandieri x V. riparia Teleki 8 B): Kuvvetli bir anaçtır. Vegetasyon süresinin nispeten kısa olması nedeniyle kuzey bölgelerde kolayca yetiştirilmektedir. Nemli ve killi topraklara uygun bir anaçtır. %20’yi aşan aktif kirece ve nematodlara iyi dayanır. Köklenmesi iyi olmasına rağmen bağdaki aşılamalarda bazı sorunlar çıkmaktadır.
SO4 (V. berlandieri x V. riparia No.4): Özellikle gelişmenin başlangıcında hızlı bir gelişme gösteren kuvvetli bir anaçtır. Üzerine aşılana çeşitte tane tutumunu arttırma ve olgunluğu hızlandırma eğilimi vardır. Nemli ve killi topraklara uygun bir anaç olup çok kurak koşullardaki topraklara tavsiye edilmez. %17-18 aktif kirece ve nematodlara oldukça iyi dayanmaktadır. Köklenme ve bağdaki aşı tutma oranı oldukça iyidir.
1103 P (V. berlandieri Rességuier No.2 x V. r upestris du Lot): Kuvvetli bir anaç olup alt katmanı nemli ve killi-kireçli topraklara uyum sağlamıştır. Kirece 110 R ve 99 R anaçları kadar dayanıklıdır (%17-18).Bu anaç çok kurak topraklar için önerilmektedir. Köklenme ve aşı tutma oranı oldukça yüksektir.
44-
140 Ru (V. berlandieri Rességuier No.2x V. rupestris du Lot): Çok kuvvetli bir anaçtır. Üzerine aşılanan çeşidin vegetasyon süresini uzatmaktadır. %20 oranında aktif kirece ve filokseraya iyi dayanmakta ancak yapraklarında filoksera galleri oluşmaktadır. Çelikleri zor köklenir, masabaşı aşısında aşı tutma oranı düşüktür. Buna karşılık bağdaki aşılamalarda başarı oranı yüksektir.
41 B (Chasselas x V. berlandieri): Vegetasyon süresinin kısa olması ve topraktaki kirece (% 40) yüksek oranda dayanım göstermesi bu anacın en önemli özelliğidir. Yeterli düzeyde filokseraya dayanıklıdır. Tuza ve mildiyöye karşı dayanıklı değildir. Bu anacın en olumsuz özelliği zor köklenmesidir. Bu nedenle masabaşı aşılamada başarı oranı düşüktür ancak bağdaki aşılamalarda aşı tutma oranı oldukça iyidir.
Teleki
Şekil 1. Araştırmada kullanılan üzüm çeşitleri (Çelik ve ark 1998a,Çelik 2002)
Şekil 2. Araştırmada kullanılan Amerikan asma anaçları
2.2. Yöntem
2.2.1. Bağda (Arazi Koşullarında) Anaç ile Kalem Arasındaki Uyuşma Katsayısının Belirlenmesi
Bağda, anaç, kalem ve aşı yerinin kalınlıklarının ölçülmesinden hareketle, anaç ile kalem arasındaki uyuşma katsayısı Perraudine'nin formülüne göre matematiksel olarak belirlenmiştir (Çizelge 2).
C.. C + A
Uyuşma Katsayısı (UK)= ———— + ————— + 10= 12 (İdeal Uyuşma katsayısı)
A 2B
A =
Aşı noktasının
B = Aşı noktasının çapı (cm)
C =
Aşı noktasının
UK =12 veya buna çok yakın ise ideal bir uyuşmayı ifade eder.
UK > 12 ise kaleme göre anaç daha kalın
UK
< ise anaca göre kalem daha kalın demektir.
Bu
araştırmayla incelenen üzüm çeşitleri ve Amerikan asma anaçları arasındaki
uyuşma düzeylerini belirleyebilmek amacıyla elde edilen izoenzim ve protein bant
desenlerinden; her üç enzim sistemi (AcpH, EST, PER) ve proteinler için Safonov
ve Veidenberg (1969)'in geliştirilmiş oldukları formüle göre kalem-anaç (Çizelge 6, 7,
8 ve 9) ve anaç-kalem uyuşma katsayıları (Çizelge 10, 11, 12 ve 13)
belirlenmiştir.
Ortak İzoenzim/Protein Bant Sayısı
UK K-A
= ——— ————————————————————————— x 100 >70 ise
benzer
Aşı Kalemi Toplam
İzoenzim/Protein Bant Sayısı
UKK-A= Uyuşma katsayısı Kalem-Anaç
Ortak İzoenzim/Protein Bant Sayısı
UK A-K= ——————————————————————————— x 100 > 65 ise uyuşma iyi
Anaçlarda Toplam İzoenzim/Protein Bant Sayısı
UKA-K= Uyuşma katsayısı Anaç-Kalem
2.2.2. Biyokimyasal Analizler
Bu çalışmada enzim ve protein kaynağı olarak bir yaşlı dala ait odun dokusu kullanılmıştır. Enzim ve proteinlerin bantlara ayrılması dikey elektroforez aletinde ve taşıyıcı ortam olarak poliakrilamid kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Araştırmada, Peroksidaz (PER), Asit Fosfataz (AcpH), Esteraz (EST) enzimlerinin üzüm çeşitleri ve Amerikan asma anaçlarının l yaşlı dallarından ekstraksiyonu, Arulsekar ve Parfitt (1986)'ya göre, toplam proteinlerin ekstraksiyonu ise Kozma ve ark. (1990)'na göre gerçekleştirilmiştir.
2.2.2.1. Enzimlerin Ekstraksiyonu
Kabuğu soyulmuş
2.2.2.2. Elektroforez İşlemi
Peroksidaz
(PER) enzimi için % 12’lik ayırım ve % 4'lük yükleme jeli, Asit fosfataz (AcpH)
ve Esteraz (EST) enzimleri için %9.45'lik ayırım ve %4'lük yükleme jeli
kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan farklı konsantrasyonlardaki ayırım, yükleme jeli ve elektrot tampon çözeltilerinin
içerikleri Çizelge 3'de verilmiştir.
Çizelge
3. Araştırmada kullanılan ayırım ve
yükleme jelleri ile elektrot tampon çözeltileri ve içerikleri
|
|
Ayırım Jeli (%12) |
Ayırım Jeli (%9.45) |
%12’lik için yükleme jeli (%4) |
%9.45’lik için yükleme jeli (%4) |
Elektrot tampon çözeltisi |
|
Akrilamid/bis
(30:1.5) Akrilamid/bis (%30 T:%2.6
C) Amonyum
persulfat Triton
X-100 (%10) TEMED Saf
su |
- 40 ml - - 25 ml (%10) 500 µl 50 µl 33.5 ml |
24 ml - 16 ml - - (%1.5) 4.4 ml 0.24 ml 40µl 80 ml’ye tamamlanır |
- 1.3 ml 2.5 ml - - (%10) 50µl - 10 µl 6.1 ml |
3.37 ml - - -1.25 ml - (%1.5) 1.37 ml - 12.5 µl 25 ml’ye tamamlanır |
%9.45’lik jel için %12’lik jel için (1X) 25mM Tris, |
Öncelikle enzimlerin
elektroforez sırasında ilerleyeceği ayırım jeli hazırlanarak, dikey elektroforez
aletinin
Elektroforez
işlemi +
2.2.2.3. Enzim Bantlarının Boyanması
Enzim bantlarının boyanmasında Arulsekar ve Parfitt (1986)’dan yararlanılmıştır.
Esteraz
(EST): 100 mg Fast Blue RR Tuzu ( 40 ml distile su içinde çözündürülmüş)
50 ml Fosfat (NaH2PO4)
solusyonu-A (sodyum fosfat-monobazik)
10 ml Fosfat (NaH2PO4)
solusyonu-B (sodyum fosfat-dibazik)
2 ml % 0.1 α-naftil asetat
Asit Fosfataz
(AcpH): 100 mg Fast Garnet GBC Tuzu
100 ml Sodyum asetat (pH 5.0)
5 ml
2 ml %1 α-naftil asit fosfat
Peroksidaz (PER): 50 mg 3 - amino - 9- ethyl carbazole (5 ml dimetil formamid içindeçözündürülmüştür)
2 ml 0.1MCaCl2
0.2 ml %30 Hidrojen Peroksit
95 ml
35°C5deki etüvde l saat
tutularak gerçekleştirilmiştir.
2.2.2.4. Proteinlerin Eksraksiyonu
Protein bantlarının elde edilmesi amacıyla Kozma ve ark.
(1990) tarafından önerilen
tampon
çözeltisi kullanılmıştır. Bu amaçla
(v/v)
Sodyum Dodesil Sulfat (SDS) ve % 5 (v/v) 2-mercaptoetanol
karışımından oluşan ekstraksiyon
tampon
çözeltisi hazırlanmıştır. Kabuğu soyulmuş
ile porselen havan
içerisinde havaneli ile iyice öğütülmüş ve üzerine l g PVPP ile 10 ml
ekstraksiyon tampon çözeltisi ilave
edilerek karışım sağlandıktan sonra homojenizatörde
parçalanmıştır. Daha sonra tülbentten süzülen çözelti
banyosunda tutulmuş ve bunu takiben
14000 rpm'de 10 dakika süreyle santrifüj edilerek üstteki
çözelti protein kaynağı olarak
kullanılmıştır. ,
2.2.2.5. Elektroforez İşlemi
Proteinlerin
analizinde Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE)
tekniği kullanılmıştır. Enzimlerdeki gibi hazırlanan jel çözeltilerine ve
elektrot tamponuna ayrıca SDS ilave edilmiştir (Çizelge 4).
Çizelge 4. SDS-PAGE Tekniğinde Ayırım Ve Yükleme Jeli
İle Elektrot Tampon Çözeltileri ve İçerikleri
|
|
Ayırım
Jeli (%12) |
Yükleme
Jeli (%4) |
Elektrode Tampon Çözeltisi |
|
Akrilamid:Bis akrilamid
(%30 T: %2.67 C) |
40
ml |
1.3
ml |
%0.1
SDS pH
8.3 |
|
Saf
Su |
33.5
ml |
6.1
ml |
|
|
|
25
ml |
- |
|
|
|
- |
2.5
ml |
|
|
%10
SDS (w/v) |
1
ml |
100
μl |
|
|
%10
Amonyum persulfat (taze) |
500
μl |
50
μl |
|
|
TEMED |
50
μl |
10
μl |
|
|
Toplam
Monomer |
100
ml |
10
ml |
Elektroforez,
yükleme jeli için 25 mA, ayırma jeli için 15 mA sabit akım şiddetinde gerçekleştirilmiştir.
Markör boya (Bromofenol mavisi) orijinden yaklaşık
2.2.2.6. Protein Bantlarının Boyanması:
Elektroforez işlemini takiben protein bantlarının görünür hale getirilebilmesi için gümüşlü boyama (Silver Staining) metodu kullanılarak aşağıdaki şekilde gerçekleştirilmiştir.
____Ayıraçlar_____ ______Hacim______ ______Süre_____
1. Durağanlama 300 ml x 3 20 dk x 3
2. Deiyonize su ile yıkama 300 ml x 3 10 dk x 3
3. Gümüşlü çözelti 300 ml 30 dk
4. Deiyonize su ile yıkama 300 ml 10-20 sn
5. Geliştirme çözeltisi 150 ml x 2 5-8 dk x 2
6. Durdurma çözeltisi 300 ml 5 dk
7. Deiyonize su ile yıkama 300 ml x 3 10dkx3
8. İndirgen çözelti 300 ml 10-30 sn
9. Çeşme suyu ile yıkama Akan su l dk
10. Deiyonize su ile yıkama 300 ml x 3 10 dk x 3
11.Tekrarlama Bantlar iyi çıkmadığında 10. kademeye kadar işlem tekrarlanmıştır.
Gümüşlü Boyama Ayıraçları:
Durağanlama (Fiksatif) çözeltisi: Etil alkol (%30) + Glasial asetik asit (%10): 90 ml Glasial asetik asit ve 270 ml Etil alkol karıştırılıp saf su ile 900 ml'ye tamamlanarak hazırlanmıştır.
Gümüş çözeltisi: 1.5 ml gümüş konsantre çözeltisinden (Gümüş nitrat) alınarak, 300 ml saf su ile kanştınlmıştır.
Geliştirme
(Developer) çözeltisi:
Durdurma (stop) çözeltisi (% l Glasial Asetik Asit): 3 ml glasial asetik asit 297 ml saf su ile karıştırılarak hazırlanmıştır.
İndirgen (Reducer) çözeltisi: 2 ml indirgen A (potasyum ferrisiyanid) konsantresi, 40 ml indirgen B (Sodyum tiyosulfat) konsantresi ve 0.7 ml indirgen C (Sodyum karbonat) çözeltisinden oluşan karışım 300 ml'ye saf su ile tamamlanarak hazırlanmıştır.
3. Bulgular
Bağda anaç, kalem ve aşı yeri kalınlıklarının ölçülmesinden hareketle, anaç ile kalem arasındaki uyuşma düzeyi Perraudine’in formülüne göre belirlenmiştir. (Çizelge 2). Buna göre, en düşük uyuşma katsayısı 10.97 ile Riesling/ SO4 kombinasyonundan elde edilmiştir. Sadece
Riesling/
|
Anaçlar Çeşitler |
41 B |
SO4 |
16- |
1103 P |
5 BB |
110 R |
99 R |
140 Ru |
8 B |
|
44-53 |
|
Alphonse L. |
11,93 |
- |
- |
11,81 |
11,74 |
11,72 |
11,94 |
11,92 |
11,67 |
11,66 |
11,90 |
|
Amasya |
11,72 |
- |
- |
11,51 |
11,34 |
11,60 |
11,75 |
11,56 |
11,23 |
11,25 |
11,43 |
|
Çavuş |
11,64 |
- |
- |
11,71 |
11,59 |
11,84 |
11,66 |
11,64 |
11,52 |
11,43 |
11,64 |
|
Emir |
11,61 |
11,40 |
11,91 |
11,85 |
11,63 |
11,71 |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Gülüzümü |
11,83 |
- |
- |
11,71 |
11,47 |
11,57 |
11,85 |
11,75 |
11,43 |
11,57 |
11,85 |
|
Hafızali |
11,90 |
- |
- |
11,84 |
11,59 |
11,67 |
11,89 |
11,50 |
11,48 |
11,45 |
11,69 |
|
Narince |
11,47 |
11,38 |
11,79 |
11,66 |
11,68 |
11,58 |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Pinot noir |
11,57 |
11,56 |
11,99 |
11,75 |
11,55 |
11,73 |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Riesling |
12,03 |
10,97 |
12,00 |
11,98 |
11,84 |
11,76 |
- |
- |
- |
- |
- |
Öncelikle, gerek enzimler gerekse proteinler için boyama işlemi tamamlanan ve bantların açıkça görüldüğü jeller, boya çözeltisi içerisinden çıkartılarak, alttan aydınlatmalı beyaz fleksiglas üzerine konulup, fotoğrafları çekilmiş ve bundan sonra her bir bant için Relative Frekans (RF) değerleri belirlenmiştir (Çizelge 5).
Bandın orijinden uzaklığı
R f= ———————————————————————
Markör boyanın orijinden uzaklığı
Şekil 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10’da bu çalışmaya dahil edilmiş olan çeşit ve anaçlara ait PER, EST, AcPH ve toplam protein bant desenleri görülmektedir.
Şekil 3. Peroksidaz enzim sisteminde Amerikan asma anaçlarına ait bant desenleri
Şekil 4. Peroksidaz enzim sisteminde üzüm çeşitlerine ait bant desenleri
Şekil 5. Esteraz enzim sisteminde Amerikan asma anaçlarına ait bant desenleri
Şekil 6. Esteraz enzim sisteminde üzüm çeşitlerine ait bant desenleri
Şekil 7. Asit fosfataz enzim sisteminde Amerikan asma anaçlarına ait bant desenler
Şekil 8 . Asit fosfataz enzim sisteminde üzüm çeşitlerine bant desenleri
Şekil 9. Amerikan asma anaçlarına ait Toplam Protein bant desenleri
Şekil 10. Üzüm çeşitlerine ait Toplam Protein bant desenleri
Araştırmada, üzerinde çalışılan 15 üzüm çeşidi ve 12 Amerikan asma anacının odun dokularından ekstrakte edilen peroksidaz (PER) enzim sisteminde elde edilen bant sayısı çeşitlerde 4-6 arasında değişirken, anaçlarda 5-7 adet olarak belirlenmiştir. Asit fosfataz (AcPH) enzim sisteminde ise, çeşitlerde 4-5, anaçlarda ise 5 bant elde edilmiş olup, esteraz (EST) enzim sisteminde çeşit ve anaçlarda bant sayısı 5-10 arasında değişmiştir. Toplam protein analizinde çeşitlerde 5-8 arasında bant gözlenirken anaçlarda bu sayı 6-7 arasında değişmiştir (Çizelge 5 ).
Çalışmada incelenen 15 üzüm çeşidi ve 12 Amerikan asma anacı arasındaki aşı kombinasyonlarında Çeşit-anaç (KK-A) ve anaç- çeşit (KA-K) uyuşma katsayıları Safonov ve Veidenberg (1969)’a göre hesaplanmıştır (Çizelge 6,7,8,9,10,11,12 ve 13). Uyuşma katsayılarına göre araştırmada kullanılan çeşit ve anaçların uyuşma durumları Çizelge 14’de toplu olarak gösterilmiştir.
Çizelge 5. Araştırmada
kullanılan çeşit ve Amerikan asma anaçlarına ait enzim sistemleri ile toplam
protein bantlarının Rf değerleri (1-15: Çeşitler; Alphonse L., Amasya, Ata
Sarısı, Cardinal, Çavuş, Emir, Gülüzümü, Hafızali, Hamburg M., Italia, Kalecik
K., Narince, Pinot noir, Razakı, Riesling; 16-27 Anaçlar; 44-53, 41 B,
|
|
Rf |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
19 |
20 |
21 |
22 |
23 |
24 |
25 |
26 |
27 |
|
Peroksidaz |
0,222 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
|
0,230 |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
0,233 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,241 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
0,244 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,253 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
0,267 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,345 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
0,356 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,368 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
0,389 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,422 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
|
|
5 |
6 |
5 |
5 |
5 |
4 |
5 |
5 |
4 |
4 |
6 |
4 |
5 |
5 |
5 |
6 |
5 |
5 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
7 |
5 |
6 |
6 |
||
|
Esteraz |
0,126 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
+ |
|
+ |
|
+ |
+ |
|
|
|
0,133 |
+ |
|
|
+ |
|
|
|
|
+ |
|
+ |
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,138 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
|
|
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
|
|
0,144 |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
+ |
|
+ |
|
|
+ |
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,149 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
0,156 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,161 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,172 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
0,178 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,184 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
|
+ |
+ |
|
+ |
|
+ |
+ |
+ |
|
|
0,189 |
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,195 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,200 |
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
|
+ |
|
|
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,207 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
0,218 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,230 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
0,233 |
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,241 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
0,253 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
|
|
+ |
|
|
|
|
|
+ |
|
|
0,256 |
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
|
|
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,267 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,276 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
+ |
|
|
+ |
|
|
|
|
|
0,299 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
+ |
+ |
|
|
+ |
|
|
0,300 |
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,310 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
|
|
+ |
|
|
|
|
0,311 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,322 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
|
|
0,333 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,344 |
+ |
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,345 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,356 |
|
|
|
+ |
+ |
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,367 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,368 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
+ |
|
|
|
|
Bant Sayısı |
9 |
6 |
7 |
8 |
6 |
8 |
5 |
4 |
10 |
6 |
7 |
8 |
8 |
7 |
6 |
5 |
6 |
7 |
6 |
8 |
7 |
10 |
9 |
10 |
7 |
6 |
7 |
|
|
Asit Fosfataz |
0,035 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
0,038 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,059 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,063 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,129 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,138 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,141 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,150 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,176 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,188 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,200 |
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
+ |
|
+ |
+ |
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Bant Sayısı |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
6 |
5 |
4 |
5 |
4 |
5 |
5 |
5 |
4 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
|
Toplam Protein |
0,442 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
0,458 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,483 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,500 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,525 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,608 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,625 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,642 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
+ |
+ |
|
+ |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
0,650 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Bant Sayısı |
8 |
8 |
8 |
8 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
5 |
7 |
7 |
8 |
8 |
8 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
6 |
|