GİRİŞ VE  AMAÇ

 

Protetik amaçlı kullanılan alaşımlarının bileşiminde bulunan bazı elementlerin salınımları, biyouyumluluk problemini ortaya çıkarmaktadır. Biyouyumluluk, canlı dokularla temasta olan herhangi bir malzemenin sistemik ve lokal toksisite, allerjik, mutajenik ve karsinojenik etki yapmayan inert özellikleri ile vücudun yumuşak ya da sert dokularında “doku reaksiyonu” oluşturmaması olarak ifade edilir 4,32, 64. Diğer bir deyişle kullanılan materyalin uygun konakçı cevabı oluşturmasıdır  55, 85.

 

Ağız epiteli, bağ dokusu, diş sert dokuları ve kemik ile temasta kalan restorasyonlarda kullanılan metalik materyallere karşı biyolojik cevap, salınan elemente, miktarına ve dokularla temasta kalam süresine bağlıdır 64, 85.

 

Metalik materyalin vücuttaki dokularla etkileşimi iki faktöre bağlıdır. İlk faktör olarak korozyon oranı ve mekanizması göz önüne alınırken, ikincisi iyon formunda erimeyen bileşiklerin, korozyon ürünlerinin, biyolojik aktivitelerinin değerlendirilmesidir 85.

 

Biyouyumluluğun değerlendirilmesi biyolojik fonksiyonlar üzerine materyallerin zarar verme ya da toksik etkilerinin derecelerini içerir. Bu terimin aralığı geniştir ve tam uyumluluk çok nadir olduğu için göreli hassasiyette kullanılır. Potansiyel tehlikeler ve bildirilen ya da gerçek yan etkiler arasındaki ayırım önemlidir 43. Biyomateryal ve organizma arasındaki etkileşimlerin tümü biyouyumluluğun sınırları içerisinde düşünülmelidir 85. Çünkü in vivo koşullarda materyal ile dokular ve vücut sıvıları arasında oluşan etkileşimin taklit edilmesi oldukça güçtür 84. Klinik kullanım temel alındığında, kısa dönemde dental alaşımlardan salınan elementlerin düşük seviyeleri için in vivo olarak belirgin bir tolerans olduğu bilinmektedir. Bu düşük element seviyelerine uzun dönem reaksiyonlarının soruları cevapsız kalmaktadır. Element salınımından kaynaklanan bazı kronik irritasyonların riski, kullanılan bu malzemelerin bilinen faydaları karşısında dikkatlice değerlendirilmelidir. Bu alanda çalışan pek çok araştırmacı son zamanlarda diş hekimliğinde kullanılan pek çok alaşımın faydalarının risklerine göre daha ağır geldiği konusunda hem fikirdir 64.

 

 Elementin ve alaşımın özelliklerinden ve hazırlanma şeklinden başka, ağız içi faktörlere de bağlı olan element salınımı, alaşımın soy metal içeriği azaldıkça, artmaktadır. Salınan elementlerin canlı dokularda zararlı etki yapabilmesi için, belli konsantrasyonlara ulaşması gerekmektedir. Ağız içi dokuları ile uzun süre temasta kalan alaşımlardan element salınımı, özellikle lokal toksisite açısından önem taşımaktadır. Dental alaşımlardan salınan elementlerin sistemik toksisiteye yol açtığı bildirilmezken, biyouyumluluğun diğer faktörleri olan allerji, mutajenite ve karsinojenite üzerindeki çalışmalar devam etmektedir. Dental alaşımların biyouyumluluğu, salınan elementlerin lokal etkilerini değerlendirebilmek amacı ile, çoğunlukla alaşımlarla hücre dizilerinin direkt temasta olduğu hücre kültürü ortamlarında yürütülen, in vitro sitotoksisite incelemeleri ile araştırılmaktadır. Bu konudaki çalışmalarda, hücrelerde canlılık tespiti, morfoloji, membran geçirgenliği ve bütünlüğü, mitoz insidansı, total protein miktarı,  lizozomal aktivite, oksijen tüketimi, hemolizis gibi konuların yanı sıra, mitokondriyal enzim olan süksinik dehidrogenazın (SDH) aktivitesi ve hücre içi ATP (Adenozin Tri Fosfat) seviyesinde azalma üzerinde durulmaktadır  Hücresel yapıların fonksiyonunun devamlılığı için belli hücre içi enerji seviyelerine ihtiyaç olduğu bilindiğinden, azalmanın hücre içi diğer yapılarda meydana getireceği etkiyi inceleme ihtiyacı ortaya çıkmıştır.

 

Çalışmamızda, temel metal (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımları ile in vitro hücre kültürü ortamında temasta kalan insan embriyonel fibroblastlarının, hücre iskeletini oluşturan ve hücre şeklinin korunması, hücre içi olayların koordinasyonu ve hücre içi madde taşınması gibi görevlere sahip olan mikrofilaman (aktin), ara filaman (vimentin) ve mikrotübülüs yapılarında meydana gelen değişiklikleri ve mitotik aktivite oranını değerlendirmek için, histoloji’nin yeni gelişen dalı olan immünositokimyasal yöntemler kullanılarak, sonuçların bilgisayarlı görüntü analizi sistemini kullanan konfokal mikroskop ile incelenmesi ve hücresel değerlendirmelerle salınımın bağıntısının irdelenmesi amaçlanmıştır.

 

 

 

 

 

 

 

 

GENEL BİLGİLER

 

     1. ALAŞIMLAR

 

     Diş hekimliği biyoloji ve mekanik arasında bir bölgede geliştiğinden restoratif metalik materyaller hem biyolojik hem de mekanik açıdan değerlendirilir. Protetik restorasyonlarda, konservatif olarak, cerrahide ve ortodontik uygulamalarda pek çok metal alaşımı kullanılmaktadır. Bu alaşımlar, genellikle erimiş halde birbirleri içinde çözünen en az dört sıklıkla altı veya daha fazla metalin birleşmesiyle meydana gelir. Alaşımlardaki ana elementlerin yanı sıra minör elementler daha  çeşitlidir. Periyodik tablodaki elementlerin yirmibeşinden daha fazlası dental alaşım yapımında    kullanılabilmektedir (Tablo 1). Alaşım reaksiyonları saf metalin davranışından pek farklı değildir. Ancak, saf bir metale başka bir metalin katılması bazı özellikler açısından karmaşık durum ortaya çıkarabilir 18, 33, 38, 40, 50, 51, 52, 64, 87.

 

      Diş hekimliğinde protetik amaçla  kullanılan alaşımlar Mc Lean (1979) tarafından aşağıdaki gibi sınıflandırılmıştır.

 

                                       Soy Metal Alaşım Sistemleri

       Yüksek Altın Alaşımları    -    Altın-Platin-Palladyum Alaşımları

                                                  -    Altın-Platin-Tantal Alaşımları

       Düşük Altın Alaşımları     -    Altın-Palladyum-Gümüş Alaşımları

       Altınsız Alaşımlar             -    Palladyum-Gümüş Alaşımları

                                        Temel Metal Alaşım Sistemleri

                                                       -    Nikel-Krom Alaşımları                                                                                                                                          

-          Kobalt-Krom Alaşımları

 

      Dental alaşımlar yaygın olarak alaşımdaki her elementin ağırlık yüzdesi (wt % - weight percentage) ve atom sayısının yüzdesi (at % - atomic percentage) şeklinde ifade edilen bileşimleri ile tanımlanırlar. Ağırlık yüzdesi alaşımın bileşimini tarif etmenin en çok kullanılan yoludur, üreticiler ve standart organizasyonlar tarafından kullanılır. Alaşımın ağırlık yüzdesi ve atomik yüzdesi birbirinden farklı olabilir. Alaşımın atomik yüzdesinin bilinmesi ile biyolojik özellikleri daha iyi anlaşılır. Atomik yüzde açığa çıkan ve vücudu etkileyen atom sayısını daha iyi haber verir 64. 


 Tablo 1. Dental alaşımların yapısına katılan elementlerin korozyon direnci üzerine etkileri ve havadaki toksik miktarları (mg / m3) 31, 62, 87.

 

 

Element

Korozyon ve lekelenme direnci

Havadaki toksik miktarı (mg/ m3)

Altın            

(Au)

 

Platin           

(Pt)

 

Palladyum   

(Pd)

 

Tantalyum   

(Ta)

 

 

Gümüş         

(Ag)

 

Bakır            

(Cu)

 

Nikel            

(Ni)

 

0,015

Krom           

(Cr)

            1

Kobalt         

(Co)

 

            0,05

İridyum        

(Ir)

 

Aluminyum 

(Al)

 

          10

Berilyum     

(Be)

 

0,002

Demir          

(Fe)

 

          10

İndiyum      

(In)

 

            0,1

Kalay          

(Sn)

 

            0,1

Manganez  

(Mn)

            5

Titanyum    

(Ti)

 

 

Silisyum     

(Si)

 

           10

Boron         

(Bo)

 

Molibden   

(Mo)

             5

Tungsten   

(W)

 

Karbon

(C)

 

 

Çinko

(Zn)

 

 

 

 

      Alaşımın biyolojik güvenilirliğini ortaya koyan özelliği korozyondur 64. Vücut sıvıları ile karşı karşıya kalan pek çok biyomateryalin korozyona uğradığı bilinmektedir 4. Alaşımın aktif ya da soy element içeriği, tek fazlı ya da çok fazlı olabilen mikro yapısı, homojen ya da inhomojen durumu, pasivasyon özelliği gibi yapısal özellikleri, döküm şartları ve bitirme işlemleri, farklı metal ve alaşımlar ile karşılıklı etkileşimleri korozyon direnci üzerinde etkilidir.

 

      Ağız ortamından kaynaklanan çeşitli faktörler de korozyon oranı üzerinde etkilidir. Tamponlayıcı sistemi ve organik yapısı sayesinde metalik restorasyonları inaktif duruma getirme yeteneği ile inhibitör ya da  yetersiz sekresyon ve zayıflamış tamponlama kapasitesi ile stimulatör faaliyet gösteren tükürük,  ağız içi ısısı, pH ve oksijen değişimleri, yiyecek ve içeceklerin fiziksel ve kimyasal özellikleri, dental plak, gastrik asitin geri kaçışı, proteinlerin varlığı, ilaç alımı, ısırma kuvvetlerinin miktar ve dağılımındaki değişiklikler, gerilim, basınç, makaslama kuvvetleri ile bağıntılı biyomekanik koşullar ve ağız içerisinde bulunan diğer metalik restorasyonlarla etkileşim korozyon hızını ve oranını belirler. Ayrıca alaşımlara yapışan dental plak, pH’ı düşürücü etkisi ile asidik ortam yaratır 14, 16, 17, 22, 29, 44, 48, 49, 64, 71, 72, 82, 87 .

 

      Alaşımdan, korosif ortamda başlangıçta fazla ancak daha sonra pasivasyon nedeni ile azalarak sabit bir oranda devam eden element salınımı olmaktadır. Alaşımdan element salınımı tamamen durmamaktadır 23, 66, 78, 79, 80. Başlangıçtaki fazla salınımın azalması alaşım yüzeyinde pasif tabakanın oluşmasına bağlıdır. Bunun sonucu alaşımın yüzeyinde korozyona dirençli bölgeler meydana gelir. Bu bölgeler herhangi bir etkenle bozulana kadar korozyon oranı çok düşük seyreder 23. Alaşıma korozyon direncini artırmak için katılan diğer elementlerin etkilerinin yanısıra Ni-Cr ve Co-Cr alaşımlarına % 16-30 oranları arasında katılan Cr, kromik oksit adı verilen pasivasyon tabakasını meydana getirmektedir. Hızlı ve kararlı pasivasyon gösteren alaşımda uygun korozyon davranışı ile oldukça düşük iyon salınımı meydana gelmektedir 5, 6, 18, 23, 87. Ağız ortamında meydana gelen pasivasyon tükürükteki koruyucu pelikıl tabakası nedeni ile özellikle dikkat çekicidir 35.

 

      Soy metal içeriği alaşımdaki bileşenlerin nispeten azalmış salınımına yol açar 5, 6, 18, 23, 87. Ancak çok fazlı alaşımlardan genellikle fazla element salınımı olmaktadır ve soy metal içeriğinin fazla olması bu alaşımdan olan salınımı azaltmada etkili değildir 48, 72. Alaşımdan korozyon nedeni ile bileşimdeki oranlara göre element salınımı olmak zorunda değildir. Ayrıca bazı elementlerin tabiatında,  yüksek bir salınım eğilimi vardır. Bu durum, elementin kararsızlığı ya da seçici salınma fenomeni olarak da ifade edilebilir. Bu fenomen soy element içeriğine ve elementin alaşım yüzeyindeki çokluğuna bağlıdır. Salınması için elementin yüzeyde olması gerekli fakat yeterli değildir 64, 66, 67, 72. Bir elementin salınımı alaşımdaki diğer elementlerden de etkilenebilir  8, 14, 15, 17, 22, 66, 71.

 

      Biyolojik sıvılara maruz kaldığında alaşım yüzeyinde meydana gelen değişiklikler ve bunun element salınımı ile ilgisi, alaşımın yüzey bileşiminin, hacim bileşiminden daha önemli olduğunu düşündürmektedir. Alaşımın yüzeyden itibaren etkilenme derinliği önemlidir. Bunun nedeni yüzeyden itibaren 5 Ao alttaki bileşim incelendiğinde yüzeydekinden farklı bulunmasıdır. Buna göre 5 Ao’ luk kalınlık, element salınımına engel olan veya izin veren tabakadır. Dental döküm alaşımlarındaki her bir geçiş element atomunun metalik çapı yaklaşık 3 Ao olduğuna göre söz konusu 5 Ao’ luk yüzey tabakası 1 ya da 2 atom kalınlığındadır 67 .

 

      Alaşımlardan salınan elementler ağız mukozasından membran diffüzyonu ya da dentin tübülleri içinden pulpaya migrasyonu ile alınabilir. Lenfatik sistem ve damarlarla yayılabilirler. Kan damarları ve lenfatiklerle taşınan  makrofaj gibi hücreler metal partiküllerini (0,5 - 10 μm) içlerine alabilirler. Tükürüğün yutulmasını takiben gastrointestinal yollardan emilirler  5, 64. Vücut genelde bu metalleri idrar, feces ve akciğerler yolu ile atabilir. Elementin atılımı, vücuda giriş yoluna bağlı olacaktır. Metalin oksidasyon durumu ve kimyasal formu, absorpsiyonu, yayılımı, tutulumu, yarı ömrü ve atılımına önemli ölçüde etki eder 64.

 

       Dişeti ve ağız içi sert dokularına, dental restorasyonlardan metal alınımının varlığı gösterilmiştir. Ayrıca implante edilmiş test materyali yüzeyinden lokal depozisyon sonucu karaciğer, böbrek, beyin gibi dokular içerisine metal iyonlarının taşınabildiği tespit edilmiştir 60.

 

2. SİSTEMİK TOKSİSİTE

 

Sistemik toksisite toksik maddenin organizmaya giriş yollarındaki biyolojik membranları geçip, kan dolaşımına girmesini takiben etki bölgesine ulaştıktan sonra oluşur. Bu etki için belli bir dozda ve belli bir konsantrasyonda yeterli süre toksik maddeye maruz kalınması gerekmektedir  62.

 

       Toksisite ölçüsü LD50 (latent doz) ile belirlenir. LD50  değeri  deney  hayvanlarının % 50’sini öldüren dozdur ve birimi mg / kg’ dır. Toksisite derecesi LD50 değerine göre değişik derecelerde ortaya çıkabilmektedir (Tablo 2).

 

 

                           Tablo 2. LD50 değerine göre toksisite dereceleri 34.

 

     Toksisite derecesi

  LD50 (mg / kg)

     etkisiz

                  > 15.000

     az

5.000  - 10.000

     orta derecede

           500  -  5.000

     çok

             50  -   500

     şiddetli derecede

               5  -   10

     süper

                   < 5

 

Diş hekimliğinde kullanılan alaşımlardan salınan elementlerin vücutta sistemik etki yaptığına dair çok az kanıt vardır. Birçok durumda dental alaşımı oluşturan elementlerin günlük diyetle alımları ile karşılaştırıldığında dental alaşımdan salınan elementlerin miktarının diyetle alınan miktardan çok daha az olması nedeni ile sistemik toksisite oluşmaması sürpriz değildir (Tablo 3).

 

                  Tablo 3. Bazı elementlerin diyetle günlük alınım dozları 64.

 

Element

Doz (μg)

Altın                  

   <7

Civa                                                

        20

Gümüş                         

        25

Krom             

      240

Kobalt             

      250

Molibden

      400

Nikel         

      300-600

Titanyum

      750

Bakır           

    3110

Çinko           

  14250

Demir              

  23250

Aluminyum                     

    9000-36000

   

      Eğer bir alaşım diyetle alınan miktara yakın miktarlarda salınım yapıyorsa, sistemik biyolojik toksisiteye sahip bir alaşım olarak düşünülemez. Ayrıca, dental döküm alaşımları ile ilgili hiçbir çalışmada dental kron kullanımıyla, sistemik metal düzeyinin arttığı gösterilememiştir. Salınan metallerin vücuda çeşitli yollardan giriş yaptığı, geniş bir alana dağılabildiği bildirilmesine rağmen bu metallerin varlığının sistemik toksisite oluşturduğu gösterilmemiştir 64.

 

3. BİYOUYUMLULUĞUN ORTAYA KONULMASI

 

Biyolojik dokularda kullanılacak materyalin zararlı etkilerinin araştırılmasında kullanılan yöntemlerin prensibi, materyal ile biyolojik sistemin teması sonucunda canlı hücredeki fonksiyonel ve yapısal değişmenin niteliğini ve ölçüsünü belirlemektir. Bir başka deyişle bu etkinin, biyolojik sistemin yapısında belirgin bir değişiklik şeklinde olup olmadığını ve etkinin reversibl olup olmadığını ortaya çıkarmaktır. Her maddenin biyolojik sistemde etki göstermediği minimum bir konsantrasyon vardır. Yine her maddenin bu miktarın üstünde belli bir etki gösterdiği konsantrasyon vardır. Canlı sistemin maddeye verdiği cevap kantitatif olarak değerlendirilebilir. Biyolojik etkilerin incelenmesinde “aynı fonksiyonu ve aynı biyokimyasal metabolik yolları olan hücreler belirli bir kimyasal maddeye karşı aynı etkiyi gösterir” prensibi büyük önem taşır. Bu prensip farklı türlerde hücreler içinde tersi şeklinde geçerlidir. Materyal biyolojik aktivite açısından incelenirken kullanım amacı da göz önünde bulundurulmalıdır 62. 

 

      Dental materyallerin biyolojik olarak incelenmesinde çok sayıda teknik sunulmuştur. Biyouyumluluğun araştırılmasında standart, basit ve kısa sürede sonuç veren bir test yönteminin kullanımı tercih edilmelidir. Dental materyallerin incelenmesi: 

 

-         İn vitro deneyler (birincil ya da eleme testleri),

-         İn vivo hayvan deneyleri (ikincil testler),

-         İnsanlarda klinik çalışmalar

      olmak üzere üç basamakta yürütülmektedir.

 

      Sonuçlarının in vivo koşulların sonuçları ile bağıntısının kurulması güç olsa bile, kontrollü olması ve tekrarlanabilirliği ile in vitro hücre kültürü deneyleri, potansiyel biyolojik zararların analizine dayanmaktadır.

 

      İn vivo hayvan deneyleri, materyalin subkutan, kas ya da kemik içerisine yerleştirdikten sonra doku cevabının incelenmesine dayanır. İn vitro hücre kültürü deneyleri, hayvan deneyleri ile yer değiştiremez ancak ön eleme yaparak kullanımını (hayvan deneylerine olan ihtiyacı) azaltabilir.

 

      İnsanlarda yürütülen klinik çalışmalar ise birinci ve ikinci basamak testlerde güvenilir bulunan materyalin klinik kullanım ve reaksiyonlar açısından değerlendirilmesidir. Zaman, ekonomi ve etik problemler yeni materyallerin tümünün bu basamakların hepsinden geçirilerek test edilmesini zorlaştırmaktadır. Materyalin biyolojik aktivite mekanizmasının in vitro deneylerle öğrenilmesi özelliklerinin geliştirilmesini sağlar 7, 10, 16, 27, 28, 46, 54, 55, 56, 63, 66, 83.  

 

      İn vitro hücre kültürü deneylerinde hücrelerin yaşatılması için Açık Sistem ya da Kapalı Sistem inkübatörü kullanılmaktadır.

 

      Açık sistemde kültür ortamı ile inkübatör içindeki hava ilişkidedir. Bu tür inkübatörlerde ortama bağlı olan bir tüpten CO2 gelir, hücre ve dokuların yaşatılması için genellikle 37 oC, % 5 CO2 li ve % 95 nemli ortam sağlanmış olur. Uzun süreli kültürlerde mutlaka açık sistem kullanılmalı ve birkaç gün ara ile kültür vasatı yenilenmelidir. Bu, metabolizma artıklarının uzaklaştırılıp yeni gelişim ve besleyici faktörlerin sağlanması için yapılmaktadır.

 

      Kapalı Sistemde kültür kaplarının ağızları hava almayacak şekilde kapatılır bu yüzden ortamın CO2 gazlanmasına ihtiyaç yoktur ve kısa süreli kültürlerde kullanılır 11.

 

      Kültür ortamında hücrelerin yaşaması, beslenmesi ve çoğalması için bazı şartların yerine getirilmesi gerekmektedir.

 

       Kültür ortamında, fibroblastların, tüm hücreler gibi mikrotübülüsler, mikrofilamanlar ve ara filamanlardan oluşan iskelet yapıları üzerinde çalışmalar yürütülmektedir 19, 30.

    

4. BİYOLOJİK SONUÇ  

 

Hücrenin incelenmesi hücrelerde canlılık tespitinin yanı sıra morfoloji, membran geçirgenliği, hücresel enzim aktiviteleri, çoğalma oranı, mitoz insidansı, hücre erimesi, total protein miktarı gibi pek çok bakımdan değerlendirilebilir 7, 27, 28, 55. 

 

 

    

Bu değerlendirilmenin iyi bir şekilde yapılabilmesi 

 

-         Hazırlama tekniği

-         Mikroskopi’ye bağlıdır 20.

 

     Hücrenin belirli yapısal özelliklerini vurgulamak için ayrı ayrı  teknik kullanılmaktadır 19.

HAZIRLAMA TEKNİĞİ

 

      Çoğunlukla protein yapılarından meydana gelen, hücrelere özgü molekülleri işaretlemeyi hedefleyen immünflüoresan boyama işlemi, karışık hücrelerden oluşan bir kültürde hücreleri birbirinden ayırt etmede de çok yardımcıdır. Flüoresan görüntülemenin diğer yöntemlere en üstün tarafı, sadece flüorokroma bağlı olan molekülün görünür kılınması, diğer yapıların karanlıkta kalmasıdır 12. Ancak, flüoresan yayılımın gücü sınırlıdır, belli bir hızda solma (bleaching) özelliği vardır ve derin sahalardaki moleküllerden kaynaklanan flüoresan görüntülerin süperpoze olması gerçek üç boyutlu moleküler düzenin saptanmasını güçleştirir 13.

 

      İmmünflüoresan yöntemde direkt, indirekt ve çoklu boyama prensipleri kullanılmaktadır (Şekil 1). Direkt yöntemde hücre ve dokudaki bir antijen, flüorokromla konjuge edilmiş tek bir antikorla işaretlenir. İndirekt yöntemde önce primer antikor ile belirleme yapılır, sonra sekonder antikor ile boyama yapılır. Çoklu immünflüoresan boyamada, hücre veya dokudaki birden fazla kimyasal molekülün görünür hale getirilmesinde temel prensip önce küçük moleküllerin sonra daha büyüklerin işaretlenmesidir. İlk işaretlenecek molekül için primer ve flüorokrom ile konjuge edilmiş sekonder antikor uygulanır. İkinci molekül için aynı işlemler tekrarlanır. Önemli olan nokta ilk ve diğer moleküller için kullanılacak primer antikorların aynı hayvanda üretilmemiş olmasıdır. Aksi halde sekonder antikorlar rahatlıkla çapraz reaksiyona girip karşılıklı primer antikorlarla yapışabilirler 12 .

Şekil 1. İmmünflüoresan boyama yöntemleri 13.

 

      1990 yılında yapılan bir çalışmada Naji ve Harmand, Co-Cr dental alaşımının farklı yüzey durumuna göre sitokompatibilitesini değerlendirmek için gingival fibroblast ve osteoblast hücrelerinin çoğalma oranı, total protein miktarı ve hücre iskeleti incelenmiştir. Hücre iskeleti elemanlarından mikrotübülüsler indirekt immünflüoresan boyama yöntemi kullanılmıştır. Mikrotübülüsler anti α-tübülin primer antikoru ile işaretlenip, fluorescien ile konjuge edilmiş koyun anti fare IgG sekonder antikoru ile boyandıktan sonra epiflüoresan ışık mikroskobu ile incelenmiştir. Pürüzlü yüzeyli ve Radyofrekans ile kaplanmış yüzeyli örneklere tabi tutulan hücrelerde depolimerize mikrotübülüsler gözlenmiştir  45.

 

      MİKROSKOPİ

   

      Hücre iskeleti elemanlarını ve mitotik aktiviteyi incelemek üzere son zamanlarda Flüoresan Mikroskopiye dayalı, gelişmiş ve en iyi teknik donatıları ile desteklenmiş olan Konfokal Mikroskop kullanılmaktadır 13.

 

      Konfokal Mikroskop bir optik mikroskop sistemi olup aydınlatma kaynağı olarak pankromatik görünür ışınlar yerine monokromatik lazer ışınlarını kullanır. Nokta ışık, nokta tarama, nokta algılama ile Üçlü Eş Odaklama ortaya koyar. Lazer ışınları, cismi sadece bir düzlemde odaklar (nokta ışık), bu odaktan geri yansıyan flüoresan yayılım, foton olarak çok küçük bir delikten geçirilerek (nokta tarama), detektör   tarafından algılanır (nokta algılama) (Şekil 2). Gelen sinyaller elektrik sinyallerine ve daha sonra da sayısal hale çevrilerek bilgisayarda görüntülenir. Gelişmiş  yazılımlar sayesinde görüntü toplama, işlemlendirme ve depolama sağlanmaktadır. Konfokal Mikroskopta tek boyutlu çizgi tarama, iki boyutlu alan tarama, üç boyutlu uzaysal tarama ve dört boyutlu zaman içinde tarama yapılmaktadır. Mikroskobun en önemli özelliği odak-dışı görüntülerin ortadan kaldırarak belli bir kalınlığı olan net görüntüler ortaya koymasıdır. Optik kesit olarak bilinen bir incelikte görüntü ve farklı derinliklerdeki düzlemlerden flüoresan görüntülerin seri kesitleri bilgisayar tarafından kaydedilir ve bunların kombine edilmesi ile üçboyutlu görüntü elde edilebilir. Zaman değişimlerini kaydeder ve kesintisiz izleme yapılabilir 13, 19 .

 

 

 

 

 

 

Şekil 2. Konfokal Mikroskobun çalışma prensibi.

 

      Bu mikroskop tipinde apokromatik ve plan objektifler kullanılarak mercek kusurları ortadan kaldırılmıştır. Maksimum Sayısal Açıklık (1.2-1.4) ve yüksek çözünürlük göstermektedir. Kullanılan lazer kaynağı sayesinde preparat üzerinde yapılan hızlı tarama, flüoresanın daha geç solmasını sağlamakta ve daha uzun inceleme süresi vermektedir. Ayrıca optik kesit halinde görüntü elde edilerek, odak düzleminin altındaki ve üstündeki moleküllerden kaynaklanan flüoresan görüntülerin süperpoze olması engellenmektedir 13.

 

 

         ATOMİK ABSORBSİYON SPEKTROMETRESİ

 

 Korozyon etkisi ile metal ve alaşımlardan salınan elementler ayrı ayrı tespit edilebilmektedir. Bu tespit ortamda serbest kalmış elementlerin ayrıştırılması ve miktarlarının ölçümü şeklinde yapılabilmektedir. Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi (AAS) bu amaçla sıklıkla kullanılan hassas bir analiz yöntemidir. Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi, bir elementin önce nötral sonra buhar hale gelmesi daha sonrada bir kaynaktan gelen ışın demeti ile karşılaşması prensibine göre çalışmaktadır 26. Bu yöntemin esası, metal tuzunun ısı ile buhar haline geldiği sırada içerisinden geçen elektromanyetik ışığı absorbe etmesine dayanmaktadır 3, 26, 61.

 

 

 

 

 

 

Şekil 3. Şematik Atomik Absorpsiyon Spektrofotometresi.

 

      Işık kaynağı olarak en çok, her element için ayrı ayrı yapılmış olan hallow (oyuk) katot lambaları kullanılmaktadır. Katot Lambası düşük basınçla doldurulmuş Azot, Argon veya Helyum gibi inert bir gaz içerir. Lambaya 600 volttan daha yüksek bir gerilim uygulandığında anot ve katot arasında bir sarj oluşur ve içerideki gaz iyonlaşır. Bu iyonlar katottaki metal atomlarına çarparak onları bir üst enerji seviyesine çıkarır. Atomlar tekrar normal enerji seviyelerine inerken ışıma meydana getirir.

 

      Atomlaştırıcı Kısım, çözelti halindeki elementin buhar haline getirilip  atomizasyonun sağlandığı bölümdür. Bu bölümde yapılan ısı işlemi sırasında elementi bileşik halinde ihtiva eden çözelti;

 

-         Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrometrisinde sis halinde yüksek sıcaklıktaki bir alev içine püskürtülerek atomize edilir.

-         Grafit Fırınlı Atomik Absorpsiyon Spektrometrisinde ise karbon numune kabına konarak elektrik arkıyla yüksek sıcaklıkta atomize edilir.

 

Atomizasyon sırasında çözeltideki ölçülecek element atomlarının maksimum absorbsiyon gösterdiği spesifik dalga boyundaki ışık gönderilir 3, 26.

 

      Optik sistem, ısıtma işlemi sonucunda alevden çıkan ışınları bir mercek vasıtası ile monokromatöre göndermektedir.   

 

      Monokromatörlerin düz ve küresel aynaları, metal için karakteristik olan, istenen dalga boyundaki ışığı diğer ışıklardan ayırarak dedektöre gönderir. 

 

      Dedektörler, ışık şeklindeki bir sinyali elektriksel sinyale dönüştürürler. Bu amaçla genellikle fotomultiplier tüpler kullanılmaktadır. Daha sonra bu elektriksel sinyal amplifiye edilerek bir ölçüm veya kaydedici bölüme gönderilerek sonuçlar galvanometre, ampermetre veya dijital bir yazıcı sistemi ile kaydedilmektedir 3, 26, 37, 61 .

 

GEREÇ VE YÖNTEM

 

Döküm alaşımlarının, hücre düzeyinde, hücre iskeletini oluşturan yapılar üzerinde potansiyel zararlı etkilerini in vitro hücre kültürü ortamında değerlendirmeyi amaçlayan çalışmamız, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji - Embriyoloji Anabilim Dalı, Hücre Kültürü ve İmmünositokimya laboratuarında yürütüldü. Alaşımlardan element salınımı sonuçları Gülhane Askeri Tıp Akademisi Eczacılık Bilimleri Başkanlığı Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalında değerlendirildi.

 

 

 

 

 İN VİTRO HÜCRE KÜLTÜRÜ İNCELENMESİ

 

 Metal Örneklerin Hazırlanması

 

Çalışmamızda, Tablo 4’de içerisindeki elementlerin ağırlık yüzdeleri belirtilen dental döküm alaşımları incelendi. Temel metal alaşımlarından (Ni-Cr ve Co-Cr) farklı miktarlarda element içeriği olan üçer adet Ni-Cr ve Co-Cr temel metal alaşımı ve iki adet soy metal alaşımı seçildi.  Örnekler, ISO (International Standardization Organization) (ISO 10993-5) standartları bilgilerinden yararlanılarak, sitotoksisite deneyleri için uygun olan test örneği modeline göre hazırlandı. 5 mm çapında 2mm yüksekliğinde pirinç disk şeklindeki örneğin ortasında, çalışmayı kolaylaştırmak için 1 mm çapında ve 7 mm yüksekliğinde tutucu kısım bulunmaktadır (Resim  1).

Bu pirinç modelin öncelikle silikon esaslı katılma tip elastomerik ölçü malzemesi (Panasil Contact Plus-PC-Kettenbach, Eschenburg, Almanya) ile hazırlanan kalıplarından, mum örneği hazırlandı. Mum eritme tekniği kullanılarak, temel metal alaşımları için Unicast (VOP Co., Botevgrad, Bulgaristan) indüksiyonlu döküm makinesinde, soy metal alaşımları için ise Heraues (Kulzer, Almanya) basınçlı, vakumlu döküm makinesinde, her metal için üretici firma tarafından önerilen eritme ve döküm ısıları kullanılarak, standart dental döküm alaşımlarının metal örnekleri elde edildi. Örnekleri birbirinden ayırt etmek için, tesviye sırasında her alaşım tipinin tutucu kısımların uçlarına farklı geometrik şekiller yapıldı. Her bir metal alaşımı için hazırlanan on örnekten beş adedine bilinen tesviye ve parlatma işlemleri yapıldı. Diğer beş adedi tesviye yapıldıktan sonra, protetik restorasyonların doku yüzeylerine yapılan kumlama işlemine uygun olarak, temel metal alaşımlarından hazırlanan örnekler 250 μm, soy metal alaşımlarından hazırlanan örnekler 50 μm’luk  Al 3 O 2 ile kumlandı. Örneklerin yüzeyinden, parlatma patının bıraktığı kalıntılar, % 99’luk etanol içerisinde 15 dakika ultrasonik temizleme ile kaldırıldıktan   sonra, distile   edilmiş,  deiyonize  su  ile  alkolü  uzaklaştırmak  için çalkalandı. Cam petri kaplarında  125 °C’de 30 dakika 1500 mmHg’de otoklavda (OT 012 Nüve, Türkiye) steril edilip, 48 saat 60 °C’de kuru hava fırınında bekletilerek kurutma işlemi uygulandı (Resim 2).

 

 

 

Resim 2 Metal örnekler.

 

 

 Hücre Kültürü Hazırlanması

 

Sitotoksisite deneyleri, direkt temasta, açık sistem inkübatöründe yürütüldü. Öncelikle, kültür vasatını değiştirme ve hücrelerin günlük gelişiminin takibinde yapılacak mikroskobik incelemeler için, kültür kaplarının inkübatörden çıkarılması sırasında metal örneklerin hareket ederek hücrelere mekanik zarar vermesini önlemek üzere, parlatılmış ve kumlanmış aynı alaşımın beş örneği ayrı ayrı lamellere parafin ile sabitlendi. Bu örneklerin aynı alaşıma ait olanları 24 kuyucuklu 6 x 4 polistiren kültür kabının aynı sırasında yer alacak şekilde, kuyucuklara yerleştirildi. Kontrol grubu kuyucuğuna metal örnek konulmadı.

 

      Sitotoksisite deneylerinde,  canlı hücre olarak gelişimi hızlı olan tek katlı kültür hücreleri halindeki insan embriyonel fibroblastları (Human Embriyonal Fibroblasts-HEF / Alp CAN) kullanıldı. Hücreler, pipet yardımı ile kuyucuklardaki lamel ve metal örnek üzerine ekildikten sonra, yüzeyle adezyonunun sağlanması amacı ile kültür kapları bir saat inkübatör içinde bekletildi. İnkübatör, hücrelerin yaşayabileceği 37 o C ’ de  % 5  CO2 ’ li  % 97 nemli ortam sağlamaktadır. Daha sonra, inkübatör içindeki kültür kuyucuklarına, hazırlanan kültür vasatı eklendi. Kültür vasatı (Tablo 5), besleyici madde  (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – DME  F-12 Ham / Sigma D 0547) üzerine belirtilen maddelerin ilavesi ile oluşturulan karışımın çift distile su ile (dd H2O) 1000 ml ’ye tamamlanması   ile   hazırlanarak   pH ’sı  7,4 ’ e  ayarlandı.  Total  kültür  vasatının  50 ml ’sine % 20 fetal calf serumu ilavesinden sonra, her kültür kuyucuğu için 0,5 ml vasat kullanıldı. 

       

           Tablo 5. Kültür vasatı (DME F-12 Ham).

 

             DME-F12 HAM                                                       12,1       g / L  .

             Penisilin                                                                  125,0    IU / ml

             Streptomisin                                                           125,0    mg / ml

             Amphoterricin B                                                        2,5    mg / ml

             Bikarbonat                                                                  1,2      g / ­­­L­    .

             Çift distile su (dd H2O)                                         1000,0        ml

  

 Hazırlanan bu in vitro şartlar altında, 120 saat (5 gün) sonunda, biyolojik değerlendirmeler yapıldı. Hücrelerin gelişimi, 24 saatte bir faz kontrast mikroskobu  ile incelendi. 72 saat sonra, metabolizma artıklarını uzaklaştırmak ve besleyici faktörler sağlamak üzere kültür vasatı yenilendi (Resim 3).

 

 

 

 

 

 

 

Resim 3. İn vitro hücre kültürü.

 

MİKROSKOBİK İNCELEME

 

Hücresel zarar, hücre iskeletini oluşturan mikrofilaman (aktin), ara filaman (vimentin) ve mikrotübülüs yapıları ve ayrıca mitotik aktivite bakımından incelendi. Bu amaçla, hücrede bu bölümlerin görüntü analizlerini yapabilmek için, bir seri işlem yürütüldü.

 

 Fiksasyon ve Boyama

Fiksasyon işlemi için süre bitiminde inkübatörden çıkarılan kültür kabının her bir  kuyucuğundan vasatın çekilmesinden sonra lamel üzerindeki metal test örnekleri pensetle çıkarıldı. Lamel üzerindeki hücreler fiksasyon solusyonu ile (Microtubule Stabilization Buffer Extraction Fix / MTSB-FX) oda ısısında 30 dakika fikse edildi (Tablo 6).

              Tablo 6. Fiksasyon solüsyonu (MTSB-FX).

 

             MTSB                                                                     10         ml   .

             Stabilizasyon tamponu(SB-5x stok)                                     2         ml

             Aprotinin  (Sigma / A 1153)                                      0.001  ml

             DTT (Di thio threitol) (Sigma / 9779)                                  0.010  ml

             D2O (Deuterium Oxide-Ağır Su) (Sigma / 4501)         5         ml

             Taxol                                                                         0.10    ml

          MTSB-FX______________________________________________   

           Triton* (%10 stok)                                                  0.100  ml

             Formaldehit                                                              0.540  ml

 

    *Triton her fiksatifin içinde bulunmayabilir. Hücre iskeleti incelemelerinde boyama ajanının hücre içerisine kolay girebilmesi için hücre zarı penetrasyonunu artırmak üzere ilave edilir.

       Fiksasyon sonunda, MTSB-FX solüsyonu kuyucuklardan alındı. Boyama işlemlerine kadar hücrelerin kurumaması için fosfat tamponlu tuzlu su (Phosphate Bufferred Saline / PBS) (Tablo 7) ilavesini takiben buharlaşmayı önlemek üzere, kültür  kapları  sıkıca  bantlandı.  Boyama  işlemlerine  kadar  + 4 °C’ de buzdolabında bekletildi.

 

 

 

 

      Tablo 7. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (0.01 M, pH 7.2)

 

               Na 2 HPO 4      sodyum fosfat dibazik, susuz          1.48 g

               KH 2 PO 4        potasyum fosfat monobazik            0.43 g

               NaCl                 sodyum klorür                                7.20 g_____________

               Distile suda                                                                   1 L

 

      Boyama işlemi için, hücre iskeleti elemanları olan aktin ve vimentini incelemek ve mitotik hücre sayısını belirlemek üzere, kültür kuyucuklarından alınan bir lamel üzerinde çoklu indirekt immünflüoresan boyama işlemi yürütüldü:

 

1.      Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.

2.      Vimentinin belirlenmesi için, fareden elde edilmiş primer antikor anti-vimentin [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

3.      PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

4.      Vimentinin boyanması için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein Isothiocyanate-Goat Anti Mouse (FITC-GAM) [ 1:100 PBS (Jackson) / yeşil] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

5.      PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

6.      Aktin filamanın boyanması için, otoflüoresan zehirli bir mantar türü Rhodamine Phalloidin  [ 1:10  Wash ( Molecular Probess)  /  kırmızı ]  uygulanıp,  45  dakika,       37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

7.      PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

8.      Lamel, içine hücre çekirdeklerini boyayan Hoechst maddesi ilave edilmiş kapatma sıvısı (Tablo 8) damlatılan lam üzerine hücreler arada kalacak şekilde kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam sabitlendi.

9.      Mikroskobik değerlendirmeye kadar – 20 °C’ da buzlukta saklanarak preparatların bozulması ve ışıktan etkilenmesi önlendi. 

Kontrol grubu lamellerine de aynı işlemler yapıldı.

 

  Tablo 8. Kapatma sıvısı.

                                                                   __ 5,0       ml__

Gliserol                                                2,5       ml

PBS                                                    2,5       ml

Azide                                               125,0       mg__

Hoechst 33258 (1mg / ml stok)             0,005   ml

 

      Mikrotübülüsleri incelemek ve sadece mitotik hücrelerin sayısını belirlemek için, kültür kuyucuklarından alınan diğer lamel üzerinde, aşağıdaki çoklu indirekt immünflüoresan boyama işlemleri yapıldı:

 

1.      Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.

2.      Mikrotübülüslerin belirlenmesi için, fareden elde edilmiş primer antikor anti-a tübülin  [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

3.      PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

4.      Mikrotübülüslerin boyanması için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein Isothiocyanate-Goat Anti Mouse FITC-GAM [ 1:100 PBS (Jackson) / yeşil] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

5.      PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

6.      Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini belirlemek için, tavşandan elde edilmiş primer  antikor  anti-H3  (histone3)  [ 1: 100  PBS  (Upstate)] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C ’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

7.      PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

8.      Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini boyamak için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-tavşan antikoru Indocarbocyanine-Goat Anti Rabbit  (Cy 3 GA  Rb)  [ 1:100 PBS  (Jackson)  /  kırmızı]  uygulanıp, 90 dakika, 37 o C’  lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

10.   PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

11.  Lamel, kapatma sıvısı damlatılan lam üzerine hücreler arada kalacak şekilde    kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam sabitlendi.

12.  Mikroskobik değerlendirmeye kadar -20 °C’ da buzlukta saklanarak    preparatların  bozulmaması ve ışıktan etkilenmesi önlendi. 

Kontrol grubu lamellerine de aynı işlemler yapıldı. 

 

   BİYOLOJİK DEĞERLENDİRME

 

Biyolojik değerlendirmede, temel (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımların  parlatılmış ve kumlanmış örneklerinin, hücre iskeleti elemanları ve mitotik aktivitede meydana getirdiği etkiler, boyanan preparatlarda öncelikle tüm metaller için değerlendirildi. Şüphe uyandıran bir sonuçta, diğer lameller yeniden boyanarak değerlendirme tekrarlandı. Hücre iskeleti elemanları, çıkarılan metal örneğe yakın veya uzakta olan bölgelerdeki tüm hücrelerde incelendi. Normale göre alaşımlardan etkilenme bulguları, inceleme bölgeleri için kırılma, eğilme ve kesintiye uğrama şeklinde kalitatif olarak değerlendirildi. Her bölgedeki hücrelerin aynı bulguları gösterdiği gözlendi. Mikroskobik değerlendirme sonunda daha net görüntü veren bölgeler, 488 nm Argon iyon, 543 nm yeşil He - Ne, 633 nm kırmızı He - Ne lazerleri ve 63 x Zeiss Plan-Apo objektifi ile donatılmış Zeiss LSM - 510 Konfokal Mikroskobu (Almanya) ile bilgisayar ekranında kaydedildi. 

 

      Hücrelerdeki mitotik aktivite ise Hoechst ile boyanan hücre çekirdeklerinden mitotik olanların sayılarını, toplam hücre sayısına oranlayarak ve ayrıca sadece mitoz aşamasındaki hücrelerin çekirdeklerini boyayan anti-H3 antikoru boyanması ile  tespit edilen mitotik hücrelerin sayılarını, toplam hücre sayısına oranlayarak kantitatif olarak ortaya konuldu. Toplam hücre sayısı olarak, her preparattan yaklaşık 1000’er hücrelik bölgede sayım yapıldı.

 

 

 

 

 

Resim 3. İn vitro hücre kültürü.

 

MİKROSKOBİK İNCELEME

 

Hücresel zarar, hücre iskeletini oluşturan mikrofilaman (aktin), ara filaman (vimentin) ve mikrotübülüs yapıları ve ayrıca mitotik aktivite bakımından incelendi. Bu amaçla, hücrede bu bölümlerin görüntü analizlerini yapabilmek için, bir seri işlem yürütüldü.

 

 Fiksasyon ve Boyama

Fiksasyon işlemi için süre bitiminde inkübatörden çıkarılan kültür kabının her bir  kuyucuğundan vasatın çekilmesinden sonra lamel üzerindeki metal test örnekleri pensetle çıkarıldı. Lamel üzerindeki hücreler fiksasyon solusyonu ile (Microtubule Stabilization Buffer Extraction Fix / MTSB-FX) oda ısısında 30 dakika fikse edildi (Tablo 6).

              Tablo 6. Fiksasyon solüsyonu (MTSB-FX).

 

             MTSB                                                                     10         ml   .

             Stabilizasyon tamponu(SB-5x stok)                                     2         ml

             Aprotinin  (Sigma / A 1153)                                      0.001  ml

             DTT (Di thio threitol) (Sigma / 9779)                                  0.010  ml

             D2O (Deuterium Oxide-Ağır Su) (Sigma / 4501)         5         ml

             Taxol                                                                         0.10    ml

          MTSB-FX______________________________________________   

           Triton* (%10 stok)                                                  0.100  ml

             Formaldehit                                                              0.540  ml

 

    *Triton her fiksatifin içinde bulunmayabilir. Hücre iskeleti incelemelerinde boyama ajanının hücre içerisine kolay girebilmesi için hücre zarı penetrasyonunu artırmak üzere ilave edilir.

       Fiksasyon sonunda, MTSB-FX solüsyonu kuyucuklardan alındı. Boyama işlemlerine kadar hücrelerin kurumaması için fosfat tamponlu tuzlu su (Phosphate Bufferred Saline / PBS) (Tablo 7) ilavesini takiben buharlaşmayı önlemek üzere, kültür  kapları  sıkıca  bantlandı.  Boyama  işlemlerine  kadar  + 4 °C’ de buzdolabında bekletildi.

 

      Tablo 7. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (0.01 M, pH 7.2)

 

               Na 2 HPO 4      sodyum fosfat dibazik, susuz          1.48 g

               KH 2 PO 4        potasyum fosfat monobazik            0.43 g

               NaCl                 sodyum klorür                                7.20 g_____________

               Distile suda                                                                   1 L

 

      Boyama işlemi için, hücre iskeleti elemanları olan aktin ve vimentini incelemek ve mitotik hücre sayısını belirlemek üzere, kültür kuyucuklarından alınan bir lamel üzerinde çoklu indirekt immünflüoresan boyama işlemi yürütüldü:

 

13.  Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.

14.  Vimentinin belirlenmesi için, fareden elde edilmiş primer antikor anti-vimentin [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

15.  PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

16.  Vimentinin boyanması için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein Isothiocyanate-Goat Anti Mouse (FITC-GAM) [ 1:100 PBS (Jackson) / yeşil] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

17.  PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

18.  Aktin filamanın boyanması için, otoflüoresan zehirli bir mantar türü Rhodamine Phalloidin  [ 1:10  Wash ( Molecular Probess)  /  kırmızı ]  uygulanıp,  45  dakika,       37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

19.  PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

20.  Lamel, içine hücre çekirdeklerini boyayan Hoechst maddesi ilave edilmiş kapatma sıvısı (Tablo 8) damlatılan lam üzerine hücreler arada kalacak şekilde kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam sabitlendi.

21.  Mikroskobik değerlendirmeye kadar – 20 °C’ da buzlukta saklanarak preparatların bozulması ve ışıktan etkilenmesi önlendi. 

Kontrol grubu lamellerine de aynı işlemler yapıldı.

 

  Tablo 8. Kapatma sıvısı.

                                                                   __ 5,0       ml__

Gliserol                                                2,5       ml

PBS                                                    2,5       ml

Azide                                               125,0       mg__

Hoechst 33258 (1mg / ml stok)             0,005   ml

 

      Mikrotübülüsleri incelemek ve sadece mitotik hücrelerin sayısını belirlemek için, kültür kuyucuklarından alınan diğer lamel üzerinde, aşağıdaki çoklu indirekt immünflüoresan boyama işlemleri yapıldı:

 

9.      Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.

10.  Mikrotübülüslerin belirlenmesi için, fareden elde edilmiş primer antikor anti-a tübülin  [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

11.  PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

12.  Mikrotübülüslerin boyanması için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein Isothiocyanate-Goat Anti Mouse FITC-GAM [ 1:100 PBS (Jackson) / yeşil] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

13.  PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

14.  Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini belirlemek için, tavşandan elde edilmiş primer  antikor  anti-H3  (histone3)  [ 1: 100  PBS  (Upstate)] uygulanıp, 90 dakika, 37 °C ’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

15.  PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

16.  Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini boyamak için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-tavşan antikoru Indocarbocyanine-Goat Anti Rabbit  (Cy 3 GA  Rb)  [ 1:100 PBS  (Jackson)  /  kırmızı]  uygulanıp, 90 dakika, 37 o C’  lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.

22.   PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.

23.  Lamel, kapatma sıvısı damlatılan lam üzerine hücreler arada kalacak şekilde    kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam sabitlendi.

24.  Mikroskobik değerlendirmeye kadar -20 °C’ da buzlukta saklanarak    preparatların  bozulmaması ve ışıktan etkilenmesi önlendi. 

Kontrol grubu lamellerine de aynı işlemler yapıldı. 

 

   BİYOLOJİK DEĞERLENDİRME

 

Biyolojik değerlendirmede, temel (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımların  parlatılmış ve kumlanmış örneklerinin, hücre iskeleti elemanları ve mitotik aktivitede meydana getirdiği etkiler, boyanan preparatlarda öncelikle tüm metaller için değerlendirildi. Şüphe uyandıran bir sonuçta, diğer lameller yeniden boyanarak değerlendirme tekrarlandı. Hücre iskeleti elemanları, çıkarılan metal örneğe yakın veya uzakta olan bölgelerdeki tüm hücrelerde incelendi. Normale göre alaşımlardan etkilenme bulguları, inceleme bölgeleri için kırılma, eğilme ve kesintiye uğrama şeklinde kalitatif olarak değerlendirildi. Her bölgedeki hücrelerin aynı bulguları gösterdiği gözlendi. Mikroskobik değerlendirme sonunda daha net görüntü veren bölgeler, 488 nm Argon iyon, 543 nm yeşil He - Ne, 633 nm kırmızı He - Ne lazerleri ve 63 x Zeiss Plan-Apo objektifi ile donatılmış Zeiss LSM - 510 Konfokal Mikroskobu (Almanya) ile bilgisayar ekranında kaydedildi. 

 

      Hücrelerdeki mitotik aktivite ise Hoechst ile boyanan hücre çekirdeklerinden mitotik olanların sayılarını, toplam hücre sayısına oranlayarak ve ayrıca sadece mitoz aşamasındaki hücrelerin çekirdeklerini boyayan anti-H3 antikoru boyanması ile  tespit edilen mitotik hücrelerin sayılarını, toplam hücre sayısına oranlayarak kantitatif olarak ortaya konuldu. Toplam hücre sayısı olarak, her preparattan yaklaşık 1000’er hücrelik bölgede sayım yapıldı.

 

 

 

 

 

 

Resim 4. Konfokal mikroskop ve bilgisayarlı görüntü analizi sistemi.

 

  ELEMENT SALINIMI İNCELENMESİ

 

Döküm alaşımlarından element salınımını tespit etmek için, parlatılmış ve kumlanmış beşer adet metal örneği, 24 kuyucuklu 6 x 4 polistiren kültür kaplarına yerleştirildi. Daha sonra fetal calf serum ilave edilmeden, hazırladığımız kültür vasatından (pH 7,4), kontrol grubu da dahil olmak üzere tüm kuyucuklara 0,5 ml  konuldu. Açık sistem inkübatörü şartlarında otuz gün beklenildi. Süre bitiminde, kültür kapları kuyucuklarından metal örneklerin çıkarılmasını takiben, kültür vasatını taşıyan kaplar, değerlendirme yapılana kadar sıvı kaybını önlemek amacı ile kapakları kapatılıp, kenarları bantlanmış şekilde – 20 o C’ de buzlukta saklandı.

 

      Element salınımının incelemesinde sadece Fe elementi için alevli atomik absorbsiyon spektroskopisi kullanılırken, diğer elementler için grafit fırınlı atomik absorbsiyon spektroskopisi (AAS) (Varian, 30 / 40 Model, GTA 96, Avustralya)   kullanıldı. AAS cihazının, her element için belirli bir ölçüm aralığı vardır. Bu nedenle  ticari olarak 1000 μg / ml  konsantrasyonunda  stok halinde mevcut olan  her elemente ait solüsyonlardan (Sigma), elemente ait ölçüm aralığındaki konsantrasyonlarda standart solüsyonlar hazırlanıp cihaza okutularak, cihaz kalibre edildi ve her element için değişik konsantrasyonlardaki kalibrasyon grafiği çizdirildi. Deneme ölçümleri sonucu, analizi yapılan vasattaki element konsantrasyonlarının ölçüm aralığının dışında olduğu anlaşıldığında % 1’ lik nitrik asitle, uygun dilüsyon yapılarak vasat ölçüme hazır duruma getirildi. Element için spesifik olan maksimum dalga boyundaki ışık, uygun lamba akımı ile gönderilmek suretiyle vasatlardaki element konsantrasyonu ölçüldü. Cihazdan alınan sonuç, kullanılan dilüsyon faktörü ile çarpılarak vasattaki gerçek element  konsantrasyonu ng / ml cinsinden tespit edilmiş oldu. Her element için uygun dalga boyu, lamba akımı ve standart element solüsyon konsantrasyonları Tablo 9’da gösterilmektedir.

 

      Parlatılmış ve kumlanmış temel metal alaşımlarının (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımlarından hücre kültürü ortamına Tablo 10’daki elementlerinin salınım miktarları tespit edildi. Alaşımların diğer elementleri, eser miktarlarda oldukları için değerlendirilmedi. Kontrol grubu olarak kullanılan hücre kültürü vasatında da çeşitli elementler bulunduğundan, salınım miktarlarını incelediğimiz her element için kontrol grubu vasatında da AAS analizi yapıldı.

 

    Temel metal (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımlarının parlatılmış ve kumlanmış örneklerinden, hücre kültürü vasatına salınan element miktarları ve normal vasatta bulunanların miktarları tespit edildikten sonra, ortalamaları (X) ve standart sapmaları (s) hesaplandı. Her alaşımın parlatılmış ve kumlanmış örnekleri arasındaki farklar (D) ve standart sapmaları (s) hesaplanıp, farkları eş yapma testi ile irdelendi. Ni-Cr alaşımları arasında ve Co-Cr alaşımları arasında parlatılmış ve kumlanmış örneklerin farklarının farkları ise varyans analizi ile irdelenip farklı gruplar Duncan testi ile saptandı.

 

Tablo 9. Elementler için atomik absorpsiyon parametreleri ve kalibrasyonda kullanılan standart element solüsyonlarının konsantrasyonları.

 

Element

Dalga Boyu

 

(nm)

Lamba Akımı

 

(mA)

Standart element solüsyon      konsantrasyonları

( ng / ml )

Nikel         (Ni)           

       232

4

20

40

60

Krom       (Cr)           

357,9

7

 5

10

15

Molibden  (Mo)

313,9

7

10

20

30

Kobalt       (Co)

240,7

7

10

20

30

Manganez  (Mn)

279,5

5

      1,25

    2,5

 5

Altın          (Au)

242,8

4

10

20

30

Palladyum  (Pd)

244,8

5

30

60

90

Kalay         (Sn)

235,5

7

50

    100

    150

İndiyum      (In)           

303,9

5

50

    100

    150

 

    Tablo 10. AAS analizi yapılan elementler.

 

 Kontrol

Ni

Cr

Co

Mo

Mn

Fe

Au

Pd

Pt

In

Sn

 Wiron 99            

Ni

Cr

 

Mo

 

Fe

 

 

 

 

 

 Wirocer                

Ni

Cr

 

Mo

 

Fe

 

 

 

 

 

 Duceranium U

Ni

Cr

 

Mo

 

Fe

 

 

 

 

 

 Wironit

 

Cr

Co

Mo

Mn

 

 

 

 

 

 

 Wirocast

 

Cr

Co

Mo

Mn

Fe

 

 

 

 

 

 Cr-Co Degussa

Ni

Cr

Co

Mo

Mn

 

 

 

 

 

 

 BegoPal

 

 

 

 

 

 

Au

Pd

 

In

Sn

 PontoStar

 

 

 

 

 

 

Au

Pd

Pt

In