|
T.C. BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ GEBE KOYUNLAR VE FÖTUSLARINDA PESTİVİRUS ENFEKSİYONU
Proje Yürütücüsü: PROF.DR. İBRAHİM BURGU Proje Numarası: 2001-08-10-029 Başlama Tarihi: 3.05.2001 Bitiş Tarihi: 3.05.2002 Rapor Tarihi:
15.12.2003
|
||||||||||||||||||||||||||
|
I.
Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Türkçe Adı: Gebe Koyunlar ve Fötuslarında Pestivirus Enfeksiyonu Özet: Pestivirus genusu daha önceleri, köken aldığı hayvan türüne göre 3 ayrı virus türüne ayrılmaktaydı: Sığırların BVD virusu, Koyunların Border Disease virusu ve Domuzların Klasik Domuz Vebası (CSF) virusu. Bununla birlikte, bugün, genetik analiz ve virusa özgü monoklonal antikorlar yardımıyla bu virusların birbirinden ayrımı mümkün olabilmektedir. Sığır ya da koyun pestivirusları ile deneysel veya doğal enfeksiyonlar göstermektedir ki pestivirus enfeksiyonlarının gebe koyunlardaki patogenezi ve sonuçları (abortlar, kongenital malformasyonlar, persiste enfeksiyonlar vb.) bu türlerdeki gebe hayvanlarda benzerdir. Çalışmanın amacı doğal yollarla enfekte olmuş gebe koyunlarda, pestivirus enfeksiyonunun patogenezine ışık tutmak ve bu alandaki verileri güncelleştirmektir. Bu çalışmada Ankara bölgesindeki farklı mezbahalara getirilen 100 gebe koyuna ait 108 fötus kullanıldı. Bu gebe koyunlara ait 75 serum örneğinin 31'i (% 41,3) pestiviruslara karşı seropozitivite gösterirken, fötuslardan alınan 65 serumun tamamı seronegatif olarak tespit edildi. Virus izolasyonu amacıyla toplam 584 farklı fötal organ ve kan örneği kullanıldı. Fötal kuzu böbrek hücre kültüründeki 3 kör pasajı takiben her bir materyal direkt immunplak teste tabi tutuldu. Sonuç olarak 69 günlük gebelik yaşında olan bir fötusun çeşitli organları (karaciğer, beyin, böbrek, barsak ve akciğerler) ve lökosit örneğinde, annesinin kotiledon ve amniyon örneklerinde ncp pestivirus tespit edildi. Bu sonuçlara göre, orta-erken gebelik döneminde virusun anneden fötusa plasenta yoluyla geçtiği ve bu enfeksiyon sırasında fötal immun sistemin tam olarak gelişmemiş olması sebebiyle fötusta persiste bir enfeksiyonun oluştuğu düşünülmüştür. Anahtar Sözcükler: Koyun, Antikor, Pestivirus enfeksiyonu, Organ Lokalizasyonu, Virus izolasyonu İngilizce Adı: Pestivirus infections of pregnant sheep and their
fetuses. Summary: The pestivirus genus had been formerly divided into three virus species according to the animal from which the viruses had been isolated: BVDV from cattle, Border disease from sheep, and CSFV from swine. Howewer differentiation between these viruses can currently be possible independent of the species by the use of virus specific monoclonal antibodies and by genetic analysis. Either experimental or natural infections of sheep with bovine or ovine pestiviruses showed that pathogenesis and the outcome of pestivirus infections in pregnant animals are the same in these species (abortions, congenital malformations, persistent infections etc.). The aim of the study to enligthen the pathogenesis of the pestivirus infection in naturally infected pregnant ewes and to update the data about this topic. In this study, 108 foetuses from 100 pregnant ewes were collected from different slaughterhouses in the Ankara vicinity. 31 of 75 sera (41.3%) belonging to the dams showed seropositivity against pestiviruses, while all the 65 sera of foetuses were detected as seronegative by serum neutralisation test. A total of 584 different foetal organ and blood samples were used for the virus isolation. After three blind passages in foetal lamb kidney cells, the culture supernatants were tested with DIPT in order to detect the presence of pestiviruses. As a result, a ncp pestivirus was detected in various organs (liver, kidney, brain, guts and lungs) and buffy coat sample of a 69 day old foetus and her dam's amniotic fluid and cotyledon samples as well. According to these results, it is considered that, in the early-mid gestation, the virus had passed from dam to foetus via placenta. Because the foetal immune system had not fully developed at the time of infection, it was thought that the foetal infection led to a viral persistence in this foetus. Key Words: Organ distribution, Pestivirus infection, Sheep, Antibody, Virus isolation, II. Amaç ve Kapsam Ruminant pestiviruslarının literatüre girmesi ilk defa 1946 yılında New York'ta sığırlarda görülen yeni bir hastalığın klinik olarak tanımlanması ile olmuştur. 1950'lerin ortalarına doğru "Mucosal Disease" olarak adlandırılan bir başka klinik olgu tanımlanmaya başlanmıştır (Dubovi, 1999). "Border Disease" tanımının kullanımı 1940'ların sonunda başlamıştır. Fakat hastalığın ciddi klinik bulgularının seyrek görülmesi sebebiyle bu adlandırma gecikmeye uğramıştır. Başlangıçta hastalığın kaynağı Galler ve İngiltere arasındaki sınır boyunca olduğundan, hastalık "Border Disease" olarak adlandırılmıştır. 1970'lerin başında ise hastalığın viral etiyolojisi etkilenmiş hayvanların hücresiz ekstraktlarının aktarım çalışmalarında kullanılmasıyla ortaya çıkmıştır. Yine aynı zamanlarda BVDV ile ilişkisi ortaya çıkmaya başlamıştır (Dubovi, 1999). Enfeksiyon öncelikli olarak direkt kontakt ile bulaşmakta ve yakın temasta olan hayvanlar önce enfekte olmaktadırlar. Virusun persiste hayvanlar vasıtasıyla hayat boyu saçılmasının epidemiyolojik önemi vardır. Persiste enfekte koyunlar, sürülerde, hem horizontal (virus saçılımı) hem de vertikal olarak (persiste enfekte bir anne her zaman Border Disease'li bir kuzu oluşturacaktır) enfeksiyon saçan kaynak konumunda olurlar. Border Disease salgınının kongenital kökenli olanı düşük hastalık insidensi ile diğerinden ayrılır. Buna karşın persiste enfekte yeni bir hayvanın sürüye sokulmasından kaynaklanan olgularda ise yüksek düzeyde etkilenmiş kuzu doğumu dikkati çeker (Sawyer ve ark., 1991). Türkiye yaklaşık 30 256 000 koyun nüfusu ile önemli koyun yetiştiricisi ülkelerden birisidir. Ancak koyun yetiştiriciliğinin ülkemizdeki ekstansif karakteri nedeniyle verimler düşük ve kültür ırkı genotipler ancak %3 civarındadır. Özellikle et, süt ve yapağı veriminin düşük olması, dölverimini etkileyen hastalıkların önemini arttırmaktadır (Pekel, 2002; Öztürk, 2000). Daha önce Türkiye'de yapılan çalışmalarda (Burgu ve ark., 1994 ve 2001; Şimşek ve ark., 1998) pestivirus enfeksiyonunun koyunlarda oldukça yaygın olduğu ve abort olaylarında rol oynadığı ortaya konulmuştur. Bu çalışmada amaç; Türkiye'de koyunlarda doğal yollarla gelişen pestivirus enfeksiyonunun gebe koyunlar ve fötuslarındaki oranını, transplasental geçişini, ayrıca enfekte fötuslarda etkenin organ dağılımını belirlemektir. Böylelikle enfeksiyonun patogenezine katkıda bulunulması ve Türkiye'de enfeksiyona ait verilerin güncelleştirilmesi amaçlanmıştır. III.Materyal ve Yöntem Kullanılan Hayvanlar: Mezbahaya kesime getirilen gebe koyunlar ile bunlardan sağlanan fötuslar yanında halk elinde bulunan koyunlar ve bunlara ait abort materyallerinden ve anomalili kuzulardan yararlanılmıştır. Hücre Kültürü: Araştırmada Virus izolasyonu, Direkt Peroksidaz Bağlı Antikor (PLA) testi ve Serum Nötralizasyon testleri için Direkt Peroksidaz Bağlı Antikor (PLA) testi sonucunda pestivirus yönünden negatif olduğu tespit edilmiş Fötal Dana Böbrek (FDB) hücre kültürü ve MDBK devamlı hücre kültürü kullanılmıştır. Viruslar: Serolojik kontrollerde BVDV referenz suşu olan NADL, PLA testinde kontrol olarak sitopatojen olmayan BVD Virus 0712/Hannover suşu kullanılmıştır. Konjugat: PLA testinde konjugat olarak BVD virusa spesifik peroksidaz enzimi ile işaretli domuz anti-BVD virus immunglobulinleri kullanılmıştır. Fötusun eldesi: Kesimden sonra uterus ile birlikte alınan fötusların laboratuvarda steril şartlarda plasentaları açılarak, bu esnada amniyon sıvısı ve cotyledonlar steril tüplere alındı. Karın boşluğu ve kafatası boşluğu açılarak karaciğer, akciğer, dalak, barsak, böbrek ve beyinleri steril tüplere konarak –20º C’lik derin donduruculara kaldırıldı. Fötusun karın boşluğundan alınan kan EDTA’lı ve Kaolinli tüplere alınacak ve annelerin kanlarına uygulanan yöntemlerle işlendi. Serum Numuneleri: Mezbahada kesilen
gebe annelerin, fötusların kan örnekleri serum toplama tüplerine alındı ve
serumların ayrılması için birkaç saat oda derecesinde bekletildikten sonra
3000 devirde 10 dakika santrifüj edilip üst kısım steril tüplere alındı ve 30
dakika Virus İzolasyon Materyalleri: Virus izolasyonu amacıyla gebe koyunların lökositleri yanında fötuslara ait organlar ve amniyon sıvıları, kotiledonlar ve lökositler kullanıldı. Ankara ve çevresindeki Kazan, Kızılcahamam, Sincan (Mısırdalı kombinası) ve Kırıkkale mezbahalarına kesime getirilen 100 gebe koyundan elde edilen toplam 108 fötus araştırıldı. Bu koyunların 91'inden EDTA'lı ve 80'inden Kaolinli tüplere kan alındı ve koyunlar numaralandı. Kesimden sonra gebe olduğu anlaşılan koyunların fötusları toplandı. Sözkonusu koyunlardan 8 adedinin ikiz ve 92 adedinin tek fötus taşıdığı belirlendi (Çizelge-1) (Bakınız Ekler). Lökositlerin İşlenmesi: EDTA’lı tüplere alınan kan 1500 devirde 10 dakika santrifüj edilerek ortaya çıkan lökosit tabakası bir pastör pipeti yardımıyla toplandı ve PBS’li tüplere aktarılarak, tekrar aynı devirde aynı süre santrifüj edilerek lökosit tabakası toplandı. Bu işlem 3 defa tekrar edildikten sonra hücre kültürü vasatı ve buna eşit miktarda serum içinde %10 Dimetilsülfoksit (DMSO) ilavesinden sonra –80º C’lik derin donduruculara kaldırıldı. Organ numunelerinin işlenmesi: Küçük parçalar halinde kesilen organ numuneleri 1/10 oranında PBS içerisinde homojenizatörde homojenize edildikten sonra 3000 rpm’de santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant ayrı steril bir tüpe alınarak, antibiyotik ilavesi ve sterilite kontrolünden sonra virus izolasyonu amacıyla kullanılmak üzere –80º C’lik dondurucularda saklandı. Serum Nötralizasyon Testi: Bu test kan serumunda BVDV spesifik antikorların tespiti amacıyla Frey ve Liess (1971) tarafından bildirilen yönteme göre yapıldı. Buna göre kısaca; mikropleytlerde test edilecek serumların 1/5 sulandırması üzerine, eşit miktarda ve titresi oranında sulandırılmış (100DKID50) BVDV’un NADL suşundan konulup, 37º C’de 1 saat bekletildikten sonra 300000 hücre/ml olacak şekilde sulandırılmış MDBK hücre süspansiyonu eklenip CO2 ’li etüve kaldırıldı. Virus ve hücre kontrollere göre sitopatolojik etki yönünden (CPE) değerlendirilip antikor taşıyan ve taşımayan serum numuneleri belirlendi. Direkt Peroksidaz Testi: Virus
izolasyon materyallerinde pestivirus spesifik antijen tespiti amacıyla Holm
Jensen (1981) tarafından bildirilen yönteme göre Direkt Peroksidaz Testi ile
yapıldı. Bu yönteme göre; hücre kültürü tüplerine Fötal Kuzu Böbrek Hücre
Kültürü Süspansiyonundan 200000 hücre/ml olacak şekilde 1’er ml konuldu. 24
saat sonunda bu kültür tüplerine lökosit, organ numuneleri ve amniyon sıvılarından 100’er ml
inokule edildi. 5 gün 37º C’lik etüvde inkubasyona bırakıldı. Süre sonunda
dondurulan ve çözülen kültür süpernatantından 100’er ml, 24 gözlü hücre
kültürü tabletlerinde üretilmiş olan MDBK hücrelerine inokule edilerek, 3 gün
sonunda kültür vasatı dökülüp ve hücre
yüzeyleri PBS ile yıkandıktan sonra 80º C’lik fikzatörde 4 saat tutulmak
suretiyle fikze edildi. Titresi
oranında PBS-Tween 20 ile sulandırılan konjugattan her tablet gözüne 200 ml
konuldu. 1 saat oda sıcaklığında tutulduktan sonra 3 kez PBS ile yıkanıp
substrat konularak boyanma olup olmadığı doku kültürü mikroskobunda kontrol
edildi. Hücre sitoplazmasındaki kırmızı-kahverengi boyanma pozitif olarak
değerlendirildi. IV.Analiz ve Bulgular Viruslar BVDV Hannover/0712 izolatı inkube edildiği 5 gün boyunca MDBK hücrelerinde hiçbir mikroskobik değişikliğe neden olmazken, BVDV NADL suşu MDBK hücre kültüründe 2. günde odaklar halinde hücre yuvarlaklaşması ve lizis ile karakterize cpe vermeye başladı. Virus inokulasyonu izleyen 5. günde tüm hücrelerin ölümüne neden oldu. Virusların
Titresi Virusların MDBK hücre kültürü kullanılarak yapılan enfeksiyozite güç tayini sonucunda NADL suşunun titresi mikrotitrasyon tekniği ile DKID50 = 105 /0,1 ml ve 0712 Hannover suşunun titresi ise immunperoksidaz testi ile DKID50 = 103.75 /0,1 ml olarak bulundu. Konjugat
Titresi 100 DKID50 / 0,1 ml oranında sulandırılan BVDV 0712/Hannover izolatı ile yapılan direkt PLA testi sonucu konjugat titresi 1/100 olarak hesaplandı. Serum
Nötralizasyon Testi Bulguları Çalışma süresince toplanan 108 fötusun 65'inden elde edilen kan serumlarından hiçbirisinde BVDV'a spesifik antikora rastlanmazken, 75 anneye ait kan serumlarından 31'inde (%41.33) değişik titrelerde seropozitiflik tespit edildi. BVDV/ NADL'a karşı antikor taşıyan annelerin SN50 değerlerinin dağılımı şekil-1'de gösterildi. Pestivirus varlığı tespit edilen olgu 94'e ait fötusun annesinde kan serumunda antikor titresi 1/80 olarak bulundu. Virus İzolasyonu ve DIPT Bulguları Annelere ait
91 adet lökosit ve 73 adet inaktive edilmemiş serum numunesi ile, 106 amniyon
sıvısı ve 62 kotiledonun yanında fötuslara ait 68 lökosit 53 inaktive
edilmemiş serum ve toplam 131 organ
numunesinin FKB hücre kültüründe yapılan 3 kör pasajı sonunda herhangi bir
cpe bulgusuna rastlanılamadı. FKB'de
yapılan ilk pasajı takiben DIPT'ine tabi tutulan örneklerden 1 fötusa ait
lökosit (Fötus No: 94) örneğinde pestivirus tespit edildi. Bu fötusa ilgili
(Fötus No: 94) doku örneklerinin tamamında FKB'de yapılan bir pasaj sonrası
uygulanan DIPT ile pestivirus tespit edildi. Bu fötusun annesine ait amniyon
ve kotiledon örneğinde BVDV bulundu. Annenin lökosit örneğinde ise üç pasaj
neticesinde herhangi bir virus tespit edilemedi. V. Sonuç ve Öneriler Çalışmada kullanılan 75 gebe koyunun 31'inin (%41,33) kan serumunda SNT ile BVDV' a karşı 1/5 ve daha yüksek titrede antikor varlığı saptanmıştır. Bu sonuç daha önceki serolojik verilerle birlikte koyunlarda pestivirus enfeksiyonunun ülkemizde enzootik olarak seyrettiğini göstermektedir. BVDV'a karşı antikor taşıyan koyunlardan SN50 değeri 1/40 veya daha yüksek olanların oranı %70,9 bulunmuştur. Toplanan 108 fötustan 1 adedinde pestivirusa bağlı viremi tespit edilmiştir. Bu fötusa ait diğer organların DIPT ile pestivirus kontrolu sonucunda aynı fötusa ait akciğer, karaciğer, beyin, barsak ve böbrekte pestivirus varlığı saptanmıştır. Aynı fötusun annesine ait amniyon sıvısı ve plasentom örneklerinden pestivirus tespiti yapılırken, lökosit örneği negatif olarak bulunmuştur. İzole edilen pestivirusun yapılan immunplak test ile ncp biyotipte olduğu tespit edilmiştir. Pestivirus izole edilen fötus da dahil olmak üzere çalışmada kullanılan 65 fötal serum BVDV'a karşı antikor yönünden SNT ile negatif olarak bulunmuştur. Pestivirus izole edilen fötusun yaşı 69 gün olarak belirlenmiştir. Bu fötusun annesinin kan serumunda BVDV'a karşı antikor tespiti yapılmış ve SN50 değeri 1/80 olarak bulunmuştur. Bu sonuçlara göre annenin gebeliğin 60. gününden önce enfekte olduğu virusun plasenta yoluyla duyarlı fötusa geçtiği, immun sistemi henüz olgunlaşmamış olan fötusun virusa karşı bir immuntolerans gösterdiği ve bunun sonucu olarak da virusun tüm organlarda rahatça çoğalma olanağı bulduğu ortaya çıkmaktadır. Bu sonuçlar; koyunlarda pestivirus
enfeksiyonunun ülkemizde enzootik olarak seyrettiğini göstermektedir. Bu
çalışmanın devamı niteliğinde olacak bundan sonraki çalışmalarda yapılması
gereken izole edilen virusun genomik ve antijenik özelliklerinin
belirlenmesidir. Virusun ayrıca monoklonal antikorlar yardımıyla epitop
haritasının çıkarılması ve sahadan toplanmış farklı serumlarla nötralizasyon
kinetiğinin değerlendirilmesi önemli
veriler sağlayacaktır. Buna ek olarak virus genomunun VI. Kaynaklar BURGU,
İ., ÖZTÜRK, F., AKÇA, Y. (1984). Tahirova devlet üretme çiftliği koyunlarında
viral enfeksiyonlar üzerinde serolojik araştırmalar. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 31, 2, 167-179. BURGU,
İ., AKÇA, Y., ALKAN, F., ÖZKUL, A. KARAOĞLU, T.M., BİLGE-DAĞALP, S.,
OĞUZOĞLU, T.Ç., YEŞİLBAĞ, K.(2001). Koyunlarda doğum öncesi ve sonrası
dönemlerde bovine viral diarrhea (BVD) virus enfeksiyonunun serolojik
virolojik ve patogenez yönünden araştırılması. Turkish Journal of Veterinary Animal Science 25, 551-557. DUBOVI,
E.J. (1999). Bovine Diarrhea Virus and Border Disease Virus (Flaviviridae). Encyclopedia of Virology, Second
Edition, Edited by Granoff, A., Webster, R.G., Academic Press, A Harcourt
Science and Technology Company. ISBN: 0 12 227030-4. FREY,
H.R., LIESS, B. (1971). Vermehrungskinetik und verwendbarkeit einer stark
zytopathogene VD- MD virus stammes
für diagnostische untersuchungen mit der mikrotiter-methode. Zbl.Vet.Med., 18, 61-71. HOLM
JENSEN, M. (1981). Detection of antibodies against hog cholera virus and
bovine viral diarrhoea virus in porcine serum. A comparative examination using CF, PLA and NPLA assays. Acta Vet Scand. 22, 85-98. ÖZTÜRK,
A. (2000). Pratik Koyunculuk. Erişim:[htttp://www.tagem.gov.tr/yayinlar/pratikkoyunculuk/pratik_koyunculuk.htm] Erişim Tarihi: 06.05.2002. PEKEL, E. (2002). Türkiye hayvancılığında ıslah hedefleri ve stratejileri. Erişim: [http://www.cu.edu.tr/fakulteler/zf/zb/bilgi/trislahhedef.asp]. Erişim Tarihi: 06.05.2002. SAWYER, M.M., SCHORE, C.E., OSBURN, B.I. (1991). Border Disease of sheep- Aspects for diagnostic and epidemiologic consideration. Archives of Virology, Supplementum 3, 97-100. ŞİMŞEK,
A., YAVRU, S., ÖZTÜRK, F. (1998). Konya bölgesi sığır ve koyunlarında Bovine
Viral Diarrhea Virus infeksiyonları üzerine genel bir bakış. Ulusal Sığır ve Koyun Yavru Atma
Sempozyumu, 6-8 Ekim 1998. Bildiri özetleri. VII. Ekler a)
Mali Bilanço ve
Açıklamaları
b) Makine ve Teçhizatın Konumu
ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar Proje kapsamında demirbaş
olarak; makine ve teçhizat alımı olmamıştır. c) Teknik ve Bilimsel
Ayrıntılar Bölüm III’de anlatılan
yöntemler dışında başka bir bilimsel teknik kullanılmamıştır. d) Sunumlar Bu proje; doktora çalışması
olarak A.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü’ne sunulmuştur. e) Yayınlar Proje kapsamında yapılmış bir
yayın bulunmamaktadır. Çizelge-1: Araştırmada kullanılan koyunlar ile fötuslarının mezbahalara göre dağılımı
|