T.C.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ

ARAŞTIRMA FONU PROJESİ
KESİN RAPORU

OTOLOG KONDROSİT TRANSPLANTASYONU İLE OSTEOKONDRAL DEFEKTLERİN SAĞALTIM OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI: KÖPEK DİZ EKLEMİNDE KLİNİK ÇALIŞMA

Proje yürütücüsü: Doç.Dr.Hasan BİLGİLİ

Proje no: 2000.08.10.002

Başlama tarihi: 28.02.2000

Bitiş tarihi: 01.08.2001

Rapor tarihi: 06.09.2001

Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu Müdürlüğü
Ankara - 2001

I. OTOLOG KONDROSİT TRANSPLANTASYONU İLE OSTEOKONDRAL DEFEKTLERİN SAĞALTIM OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI: KÖPEK DİZ EKLEMİNDE KLİNİK ÇALIŞMA

ÖZET: Bu proje Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Ortopedi ve Travmatoloji Bilim Dalı Kliniği’ne getirilen değişik ırk, yaş ve cinsiyette 9 köpek üzerinde gerçekleştirildi. Bu çalışmada, in vitro koşullar altında köpeklerde kondrosit hücre kültürü yapılması, monolayer kültürde üreyen köpek kondrositlerinin fenotipik özelliklerinin araştırılması, yapay kıkırdak doku kültürleri için yeni tekniklerin araştırılması, osteokondral defektlerin kültüre kondrositler ile tamiri, in vitro koşullarda hücrelerin davranışlarının incelenmesi, osteokondral defektlerin onarımında kullanım olanaklarının araştırılması amaçlandı.

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Ortopedi ve Travmatoloji Bilim Dalı Kliniği’ne diz eklemi topallık şikayeti ile getirilen köpekler detaylı bir şekilde klinik, radyolojik muayeneye tabi tutuldular. Kronik çapraz bağ kopuğu olan olgular osteokondral defekt olasılığı yönünden tekrar incelenerek, femoral kondiluslarında defekt bulunan 9 olgu, hayvan sahiplerinin izni ile çalışmaya alındılar.

Olguların anestezileri 0.1 ml/kg Xylazin hydrochlorid enjeksiyonu ile premedikasyon sağlandıktan sonra 10 mg/kg Ketamin hidroklorür’ün intramüsküler olarak yapılmasıyla ile sağlandı. Olguların sağ omuz eklemlerine lateral triangular artroskopik teknikle girilerek, bir biopsi pensi ile ekleme aktif olarak katılmayan ve yük taşımayan bölgesinden 2-3 yerden kıkırdak doku örnekleri alındı. Bölge dikiş uygulanarak kapatıldı ve pansuman uygulandı. kıkırdak örnekleri transport mediumu içine steril şekilde nakledilerek, Gülhane Askeri Tıp Akademisi Tıbbi Genetik Bilim Dalı labarotuvarına götürüldü. Kıkırdak örnekleri 1 mg/ml tip II kollagenaz ile enzimatik digesyona tabi tutuldular. Elde edilen kondrosit hücrelerinin viabiliteleri ve canlı hücre sayıları saptandı. Tripsinizasyon işlemi ile subkültürler elde edilerek transplante edilecek kondrositler elde edildi. Postoperatif 15. günde enjektabl hale gelen jel formundaki otolog kültüre kondrosit hücre greftleri, aynı olgunun diz eklemindeki osteokondral defekte transplante edildi. Tibia proksimalinden veya femur lateral kondilusundan alınan periosteal greft ile bölge korundu. Olguların kopuk ön çapraz bağları modifiye Utrecht Üniversitesi Tekniği ile onarıldı. Operasyon bölgesi uygun şekilde kapatılarak, bölgeye küçük bir pansuman uygulandı, bandaj ile immobilizasyon yapılmadı. Olgulara postopeartif 5 gün süreyle antibiyotik uygulandı. Olgular postoperative 1., 3,, 5., ve 7. haftalarda klinik ve radyolojik muayenelere, 8. hafta sonunda da artroskopik muayeneye tabi tutuldular. Klinik kontrollerde olguların ekstremitelerini 1. ve 3. haftada kulanırken ağrı duydukları, fakat 5. ve 7. haftalarda giderek daha rahat kullandıkları ve ağrı duymadıkları belirlendi. Radyolojik kontrollerde osteokondral defektin 1. ve 3. haftalarda deprese görünümde olduğu, 5. haftada ise tamamen dolduğu izlendi. İki olguda ise 7. haftada tam dolum izlendi.

Sekizinci haftada yapılan artroskopik muayenede defektin tamamen iyileştiği, dolduğu, kenarındaki sınırının bile belli olmadığı, defekti dolduran dokunun çevresiyle aynı renkte ve şeffaf olduğu, dayanıma karşı güç verdiği izlendi.

Sonuç olarak; bu proje ile Türkiye’de ilk kez köpeklerin omuz ekleminden alınan ufak miktardaki kıkırdak doku örneklerinden hücreler ayrıştırıldı, sağlıklı otolog kondrositler izole edildi ve steril koşullar altında, in vitro ortamda monolayer kültür sistemi ile hücre sayısı arttırıldı ve olguların diz eklemlerindeki osteokondral defektlere eklem şekil ve fonksiyonunu restore etmek için transplante edildi ve başarılı sonuçlar alındı.

Anahtar sözcükler: Kondrosit, transplantasyon, greft, osteokondral defect, diz eklemi, kopek, klinik çalışma.

RESEARCH OF REPAIR OF OSTEOCHONDRAL DEFECTS WITH AUTOLOGOUS CHONDROCYTE TRANSPLANTATION:

CLINICAL STUDY OF THE STIFLE JOINT IN DOG

ABSTRACT: This project was realised on 9 dogs of different breed, age and sex which were brought to University of Ankara, Faculty of Veterinary Medicine Department of Orthopedics and Traumatology. In this study, chondrocyte cell culture production in dogs in vitro research of phenothypical properties of dogs chondrocytes reproduced in monolayer culture, research for new techniques for artificial cartilage tissue cultures, repairment of osteochondral defects by cultured chondrocytes, examination of cell behaviours in vitro and usage opportunities in repairment of osteochondral defects were subjected.

Dogs with stiffle joint lameness history which were brought to University of Ankara, Faculty of Veterinary Medicine Department of Orthopedics and Traumatology were examined clinically and radiographically in detail. Chronical cruciat ligament rupture and osteoarthritis suspected dogs were reexamined for osteochondral defect occurance and 9 cases with defect on femoral condyles were taken into study with permission of their owners.

Premedication was provided by Xylazin hydroclorid in doses of 0.1 mg/kg and general anesthesia was provided by Ketamin hydroclorur administration in doses of 10 mg/kg both intramusculer. The right shoulder joints of cases were aprroached by the lateral trianguler arthroscopical technique and cartilage tissue samples were collected by a biopsi pens from 2-3 different areas which didn’t contribute to the joint structure and weight bearing. Closing stures were applied and the site was bandaged. The samples were transported to Gülhane Military Medical Academy, Department of Genetics Labrotory in a sterile transport medium. The biopsi samples were exposed to enzymatical digestion with 1 mg/ml type II collagenase. The viabilities and numbers of live cells were obtained by tripsinization and were measured. Subculture were obtained by tripsinization and the chondrocytes to be transplanted were produced. The autologous cultured chondrocyte cell grefts which became injectable on the postoperative 15^th day were transplanted on the osteochondral defect in the stiffle joint of the same case. The area was protected with periosteal greft taken from proximal tibia or lateral condyle of the femur. The ruptures of the cranial cruciate ligaments were fixed by the modified Utrecht University Technique. Operation site was properly closed, protected by a small dressing and no bandages were applied for immobilization. Antibiotics were administered for 5 days postoperatively. Cases were clinically and radiographically examined on the 1^st , 2^nd,3^rd,5^th and 7^th weeks and arthroscopy was performed on the 8^th week. It was clinically observed that on the 1^st and 3^rd weeks cases felt pain when using their extremities, but on the 5^th and 7^th week the pain subsided. In radiographical controls, it was observed that the osteochondral defects was completely filled on the 7^th week. In the arthroscopical examination of the 8^th week, it was observed that the defects was completely filled, healed even the borders dissapeared, the colour of the tissue filling the defect was the same colour and as transparent as the surrounding and it was strong to the pressure.

As a result, with this project for the first time in Türkiye, cells were seperated from small cartilage tissue takes from the shoulder joint of dogs, healty autologous chondrocytes were isolated, their amount was in vitro monolayer culture system, they were transplanted on the osteochondral defects in stiffle joints the same cases to restore the shape and function of the joint and successful results were achieved.

Key words: Chondrocyte, autologous, transplantation, graft, osteochondral defect, stifle joint, dog, clinical study.

II. AMAÇ ve KAPSAM:

Eklem kýkýrdaðý, diartrodial eklemlerin elastik yapýda yük taþýyan materyalidir, ekleme sürekli kayma hareketleri için gerekli olan mükemmel friksiyon (sürtünme), lubrikasyon (kayma) ve aþýnma özelliklerini saðlar. Ayný zamanda mekanik þok dalgalarýný absorbe eder ve altýndaki destekleyici kemik yapýlara uygulanan yükü daðýtýr.

Eklem kýkýrdak hasarý son yýllarda köpeklerde yaygýn bir problem olarak karþýmýza çýkmaya baþlamýþtýr. Burada temel sorun çok zayýf rejenerasyon kapasitesine sahip olan eriþkin eklem kýkýrdaðýdýr. Subkondral kemiðe penetre olmayan eklem kýkýrdak yaralanmalarý iyileþemez ve eklem kýkýrdaðýnýn dejenerasyonuna yol açacak þekilde ilerler.

Eklem kýkýrdak hasarý sonucu meydana gelen aðrý ve yetersizlik (fonksiyon kaybý), kýkýrdak tamirini kolaylaþtýracak ve arttýracak yollarýn araþtýrýlmasýný baþlatmýþtýr. Tamir veya rejenere olan kýkýrdaðýn, eklem dokusu olarak tatmin edici bir performans göstermesi için, sinovyal eklemin normal aðrýsýz hareketi yeniden saðlanmalýdýr. Bunun oluþmasý için de tamir dokusunun yapýsý, kompozisyonu, mekanik özellikleri ve saðlamlýlýðý doðal eklem yüzeyine benzer bir þekilde olmalýdýr.

Kýkýrdak defektlerinin tamirini arttýrmak için çok sayýda yöntem araþtýrýlmýþtýr. Hasarlanmýþ kýkýrdaðýn tamirine yönelik cerrahi yöntemler þunlardýr: debritman ve lavaj, subkondral kemiðin drilizasyonu, mikro kýrýk, abrazyon artroplastisi ve yüksek tibial osteotomi. Bu yöntemlerin herbirisi aðrý, kilitlenme ve þiþlik gibi klinik semptomlarýn iyileþmesine yardýmcý olabilir, fakat kesinlikle hiyalin eklem kýkýrdaðýnýn restorasyonunu saðlayamaz. Bu prosedürlerin uyardýðý tamir dokusu fibrokartilajdýr ve normal hiyalin eklem kýkýrdaðýnýn biyokimyasal ve biyomekanik özelliklerine sahip deðildir. Kýkýrdak defektlerinin otolog doku ve mezenþimal hücrelerle tedavisi de araþtýrýlmýþtýr. Kýkýrdak rejenerasyonunu indüklemek için eklem kýkýrdak defektlerinin periosteal veya perikondral greft transplantasyonu ile tedavisi eklem kýkýrdak tamirindeki diðer yaklaþýmlardandýr. Bu greftleme yönteminin avantajý eklem yüzeyindeki büyük defektlerin kaplanabilmesidir.

Kýkýrdak ve subkondral kemiðin ikisini içeren hasarlanmalar osteokondral defekt olarak isimlendirilmektedir. Osteokondral ve kondral defektler sýklýkla travma sonrasý meydana gelir. Defektler genellikle adolosenlarda ve oldukça aktif hayatý olan genç eriþkinlerde görülür. Kondral veya osteokondral defektlerin doðal olarak iyileþmesi hala çok iyi bilinmemesine karþýn tedavi edilmediði zaman lezyonlarýn iyileþmesinde yetersizlik ve eklem yüzeyinin büyük bir kýsmýný içeren defekt tiplerinde eklemde semptom veren dejenerasyona doðru ilerleme görülebilir. Kondral ve osteokondral izole defektlerin tedavisi sayesinde osteoartroz geliþimi önlenebilir veya gecikmesine yardýmcý olunabilir. Çok deðiþik sonuçlar bildirilmesi nedeniyle, oluþan fokal defektlerin tedavisinde en uygun tedavi yönteminin hangisi olduðu tam olarak bilinmemektedir.

Ýskelet çatýyý oluþturan kemik ve kýkýrdak, konnektif dokunun yüksek derecede özelleþmiþ tipidir. Kýkýrdak destekleyici bir dokudur; sinovyal veya diartrodiyal eklemlerde yüzeylerin eklemleþmesini saðlar, menisküsler, tendonlar ve ligamentler ile beraber kemikler arasýndaki yüklerin iletimini ve daðýtýmýný yapar. Bundan dolayý, kýkýrdak bir kemikten diðerine büyük yükleri iletmeyi saðlayacak kadar yeterli derecede saðlam olmalýdýr.

Eklem kýkýrdaðý yüksek oranda diferansiye olmuþ, vasküler kan desteði eksik ve yalnýzca sýnýrlý rejenerasyon kabiliyetine sahip bir dokudur. Kýkýrdak dokusu kondrositler ile proteoglikanlar ve Tip II kollajeni içeren çok miktardaki ekstra selüler matriksten oluþmaktadýr. Epitelyal veya mezenþimal orjinli diðer dokularýn tersine, kýkýrdak yeni hücreler ve sentezlenmiþ ekstrasellüler matriks ile hasarlanmýþ dokularý replase etme yeteneðine sahip deðildir. Böylece normal fonksiyonun yeniden saðlanmasýnda yetersiz kalmaktadýr. Bu yüzden kýkýrdak doku zedelenmelerinde geliþtirilmiþ tedavi yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadýr.

Diz eklemindeki kýkýrdak yaralanmalarý hem kýkýrdak dokusu ile sýnýrlý lezyonlara (kondral) hem de kýkýrdak ve subkondral kemiðin (osteokondral) ikisini birden içeren osteoartrite yol açarlar. Tekrarlayan mikrotravmalar da dizdeki büyük yaralanmalar kadar osteoartrite sebep olmaktadýr.

Eklem yüzeyi yenileme teknikleri (subkondral drilizasyon, abrazyon ve spongiolizasyon) kýkýrdak tamirine yardým etmek için kullanýlmaktadýr. Bu reperatif teknikler sonucu oluþan dokular TipI kollajen fibrilleri içeren disorganize fibrokartilajdan oluþmaktadýrlar ve bu nedenden dolayý normal eklem kýkýrdaðýnýn biyomekanik özelliklerini restore etmekte yetersizdirler.

Otolog kýkýrdaðýn kullanýlmasý en ideal yöntemdir. Fakat donör bölgelerin yetersiz olmasý baþlýca dezavantajýdýr. Ayrýca kýkýrdak fragmanlar genellikle fibröz doku formasyonuna yol açan dejenerasyona neden olmaktadýr. Ayný zamanda fragmanlarýn implantasyon bölgesine uyumu zordur ve fibrin gibi deðiþik yapýþkan benzeri materyaller kullanýlmasýna raðmen sýklýkla yerinden çýkmaktadýrlar.

Transplante heterolog ve otolog kondrositler, periosteum ve perikodrium fokal artiküler kýkýrdak defektleri için potansiyel tedavi yöntemleridir.

Son on yýlda kýkýrdak rejenerasyonunu arttýrmak için deðiþik giriþimlerde bulunulmuþtur. Ýzole edilmiþ kondrositlerden elde edilen greftler fibrin zamk veya kollajen içine gömülmüþler ve sonuçlarýn baþarýlý olduðu bildirilmiþtir.

Doku mühendisliði, organ yetersizliði ve doku kayýplarýnýn tedavisinde önerilen yöntemler arasýna girmiþtir. Mühendislik ürünü dokularýn en önemli ilgi alanlarýndan birisi de yük taþýyan ve mekanik olarak fonksiyon gören kýkýrdak, tendon, ligament ve kemik gibi dokulardýr. Hücre ve doku kültür tekniklerindeki ilerlemeler in vitro olarak otolog hayvan kýkýrdaðýnýn sentezine olanak saðlamýþtýr.

Bu çalýþmanýn amaçlarýný þu þekilde sýralayabiliriz:

1. Ýn vitro koþullarda köpeklerde kondrosit kültürü üretiminin yapýlmasý.

2. Monolayer kültürde üreyen köpek kondrositlerin fenotipik özelliklerinin araþtýrýlmasý.

3. Yapay kýkýrdak doku kültürleri için yeni tekniklerin araþtýrýlmasý.

4. Osteokondral defektlerin kültüre kondrositler ile tamiri.

III. MATERYAL ve YÖNTEM:

Bu proje Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Ortopedi ve Travmatoloji Bilim Dalý Kliniði’ne getirilen deðiþik ýrk, yaþ ve cinsiyette 9 köpek üzerinde gerçekleþtirildi.

a. Kýkýrdak Doku Örneðinin Alýnmasý:

Olgularýn anestezisi 0.1 ml/kg Xylazin hydrochlorid enjeksiyonu ile premedikasyon saðlandýktan sonra 10 mg/kg Ketamin hidroklorür’ün intramüsküler olarak yapýlmasýyla ile saðlandý.

Anestezi sonrasý olgularýn sað omuz eklem bölgelerinin traþ ve dezenfeksiyonu saðlanýp, olgular operasyon masasýna sað omuzlarý üst tarafta kalacak þekilde baðlanarak operasyon bölgeleri steril olarak örtüldü. Lateral triangular artroskopik teknik ile sað omuzlara girildi, bir biopsi pensi ile ekleme aktif olarak katýlmayan ve yük taþýmayan 2-3 bölgeden kýkýrdak doku örnekleri alýndý. Bölge dikiþ uygulanarak kapatýldý ve pansuman uygulandý.

b. Doku Örneðinin Laboratuvara Nakli:

Biopsi materyali donör alandan steril koþullar altýnda alýndýktan sonra 10 cc. taþýma solüsyonu içeren steril tüp içinde laboratuvara götürüldü. Örnekler PBS veya serum fizyolojik ile üç kere yýkanarak, yeni bir tübe aktarýldý. Daha sonra 37°C’deki inkübatörde bekletildi.

c. Mekanik Parçalama Ýþlemi:

Alýnan kýkýrdak doku örnekleri steril ortamda ve þartlarda önce steril 35 mm’lik petri kaplarýna aktarýldý. Daha sonra 15 numaralý bistüri kullanarak mümkün olduðunca nazik bir þekilde 0.5 mm’den küçük parçalara ayrýldýlar.

d. Enzimatik Digesyon Ýþlemi ile Kondrositlerin Ayrýþtýrýlmasý:

35 mm’lik petri kaplarýnýn içine son konsantrasyonu 1 mg/ml olacak þekilde tip II kollajenaz, hyaluronidaz ve doku kültür mediumu eklendi ve 37°C’de %5 CO_² ve %90 nemi olan inkübatörde 12 saat süreyle bekletildiler. Sonra invert ýþýk mikroskobuyla hücreler kontrol edilerek, hücrelerin ayrýþtýðý gözlendikten sonra naylon süzgeçten geçirilerek, üzerine 10 ml kültür mediumu eklenerek 1000 rpm’de 10 dk süreyle santrifüje edildiler. Süpernatant atýldýktan sonra tüp dibinde kalan pellet kýsým üzerine 10 ml kültür mediumu eklenerek, nazik bir þekilde cam pipet yardýmýyla homojenize edildikten sonra vorteks içinde bir dakika karýþtýrýldý.

e. Kondrositlerin Viabilitesinin Saptanmasý ve Canlý Hücre Sayýsýnýn Hesaplanmasý:

I. 1 ml’lik pipet kullanarak 0.8 ml mediumdan 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüpü içerisine konuldu,

II. Steril sarý pipet ucu kullanýlarak yukarýdaki 10 ml’lik hücre süspansiyonundan 100 mikrolitre alýnarak ve mikrosantrifüj tüpüne konuldu,

III. 100 µl tripan mavisi tüpe eklenerek, 30 saniye vortekste karýþtýrýldý,

IV. Hemositometreye hücrelerin konularak, hücre sayýmý yapýldý. Düþük büyütmede (x10) fokus yapýlýp, dört büyük karedeki hücreler (dairesel, net konturlu hücreler “canlý”, patlamýþ ve maviye boyanmýþ hücreler ise “ölü” olarak) sayýldý.

V. Hücre sayýsýnýn hesaplanmasý için her iki taraftaki dört karedeki canlý hücrelerin toplam sayýsý dörde bölünerek ortalama bulundu. Bu 1 ml’deki hücre sayýsýdýr. Sonra bu sayý mikrosantrifüj tüpü 10 kez dilüe edildiði için 10 ile ve ilk baþtaki tüpteki dilüsyon miktarý 10 olduðu için yine 10 ile çarpýldý. Sonuçta, toplam canlý hücre sayýsý hesaplanmýþ oldu.

f. Hücrelerin Ýnkübasyonu:

Toplam canlý hücre miktarý hesaplandýktan sonra eðer 2 milyondan az hücre varsa 25 cm²’lik doku kültürü flasklarýna, eðer 2 milyondan fazla hücre varsa 75 cm²’lik doku kültür flasklarýna konuldular. Daha sonra 37°C’de, %5 CO₂ ve %90 nem olan inkübatör içine kapaðý aralýk olacak þekilde yerleþtirildiler.

g. Tripsinizasyon Ýþlemi ile Subkültür Elde Edilmesi:

Bu iþlemin amacý ölü hücrelerin ayrýþtýrýlmasý ve üretilen canlý hücrelerin daha büyük flasklara nakledilmesini saðlamaktý. Önce steril PBS veya RPMI 1640 ile mataryel 7 kez yýkandý. Bu iþlemler hýzlý bir þekilde yapýldý, daha sonra flask tabanýný örtecek kadar 3 mililitre Tripsin / EDTA (0.25/0.02) solüsyonu materyal üzerine eklenerek, 37°C’de %5 CO₂ inkübatörde bir dakika inkube edildiler. Daha sonra üzerine 5 ml kültür mediumu eklenerek, 1000 rpm’de 10 dakika santrifüje edildiler. Tüp üzerindeki sývý atýlacak ve 5 ml kültür mediumu eklenerek cam pipetle homojenize edildiler. Resüspansiyon iþlemi canlý hücreleri öldürmemek için dikkatli ve nazik bir þekilde yapýldý. Bu iþlem 10 kez tekrar edilecek ve süspansiyon flaskýn içine konuldu. Mikroskopik incelemede yüzen yuvarlak hücreler görüldükten sonra 37°C’deki %5 CO₂’lik inkübatöre konuldu.

h. Transplante Edilecek Enjektabl Kondrositlerin Elde Edilmesi:

Monolayer sistemde 15. günden sonra kondrositler tamamen yüzeyi kapladýklarýndan cell scraper ile flask tabanýna yapýþmýþ olan kondrositler kazýnarak jöle kývamýnda olacak þekilde toplandýlar ve aspire edilerek flaskýn içinden uzaklaþtýrýlarak, 5 ml’lik enjektör içinde toplandýlar.

ý. Osteokondral Defektlere Otolog Kondrositlerin Transplantasyonu:

Olgularýn osteokondral defekt bulunan diz eklemine ayný anestezi protokolü ile ve lateral parapatellar yaklaþým yolu ile ulaþýldý. Deri ensizyonunu takiben, deri altý bað dokusu geçilerek, retinakulum küt olarak diseke edilirken, fasiz lata kesilerek, lig. patellare’ye 0,5 cm. Lateralden yapýlan bir ensizyonla diz eklemi içine ulaþýldý. Lig. collaterale laterale korunurken, m. quadriceps femoris’in vastus lateralis’i ile m. biceps femoris’i diseke ederek arasýndan patella mediale deviye edilerek, eklem tamamiyle açýða çýkarýldý. Osteokondral defekt enjektabl hale getirilmiþ olan kondrosit greftle dolduruldu. Tibia proksimalinden veya femur lateral kondilusundan alýnan 15x15 mm. boyutlarýndaki periosteal greft, kambium tabakasý defekte bakacak þekilde polyglactin 910, 4/0 sütür materyali ile tutturuldu. Defektin pozisyonunun düzgün olduðunun kontrol edilmesinden sonra olgularýn kopuk ön çapraz baðlarý Modifiye Utrecht Üniversitesi Tekniði ile onarýlarak, diz eklemi serum fizyolojik ve rifosin karýþýmý ile yýkandý. Daha sonra bölge uygun tekniklerle kapatýldý. Operasyon bölgesi pansuman ile korunurken, ekstremiteye bandaj uygulanmadý. Postoperatif 5 gün süreyle olgulara antibiotik uygulandý ve 1., 3., 5., ve 7. haftalarda klinik ve radyolojik, 8. haftada da artroskopik muayenelere tabi tutuldular. Klinik kontrollerde ekstremitenin kullanýmý, aðrý durumu, radyolojik kontrollerde osteokondral defektin onarýmýnýn takibi, artroskopik kontrolde ise osteokondral defektin görünümü deðerlendirildi. Klinik ve radyolojik deðerlendirmeler Modifiye O’Driscoll Skorlama Sistemine, artroskopik deðerlendirmeler ise Modifiye Lukoschesk Skorlama Sistemine göre yapýldý.

IV. ANALÝZ ve BULGULAR

Kültür iþlemi boyunca kondrositler invert ýþýk mikroskobunda takip edildiler. Hücrelerin büyüklükleri birbirlerinden biraz farklýlýk göstermekte ve multiple ince granüller içeren ufak sitoplazmalarý mevcuttu. Köpek kondrositleri monolayer kültürlerde 3-5. günlerden sonra poligonal veya romboidal þekil aldýklarý izlendi. 18. gün sonra ise, hücrelerin artýk belirgin bir þekilde geniþledikleri gözlendi. Proliferasyon hýzýnýn 7-11. günler arasýnda en yüksek düzeyde olduðu ve 15. günlerde ise durduðu saptandý.

Klinik kontrollerde olgularýn ekstremitelerini 1. ve 3. haftada kulanýrken aðrý duyduklarý, fakat 5. ve 7. haftalarda giderek daha rahat kullandýklarý ve aðrý duymadýklarý belirlendi. Radyolojik kontrollerde osteokondral defektin 1. ve 3. haftalarda deprese görünümde olduðu, 5. haftada ise tamamen dolduðu izlendi. Ýki olguda ise 7. haftada tam dolum izlendi.

Rejenere dokunun eklem yüzeyini düz olarak kapatmasý, eklem kýkýrdaðý ile ayný seviyede olmasý, defekti dolduran dokunun çevresiyle ayný renkte ve þeffaf olmasý, dayanýma karþý güç vermesi O’Driscoll ve ark’nýn kriterlerine uyum gösterdi ve yapýlan kondrosit transplantasyonun baþarýlý olduðuna karar verildi.

Sekizinci haftada yapýlan artroskopik muayenede sinoyal inflamasyon Modifiye Lukoschesk Skorlama sistemine göre; (0) Normal, (1) Çok az inflasyon, (3) Orta inflamasyon, (4) Ciddi inflamasyon olarak deðerlendirildi ve çalýþma serisinde 2 olguda (0), 4 olguda (1), 2 olguda da (3) derece inflamasyon izlendi.

Sonuç olarak 2 olguda orta, 7 olguda iyi sonuç elde edildi.

V. SONUÇ:

Sonuç olarak; bu proje ile Türkiye’de ilk kez köpeklerin omuz ekleminden alýnan ufak miktardaki kýkýrdak doku örneklerinden kondrosit hücreleri ayrýþtýrýldý, saðlýklý otolog kondrositler izole edildi ve steril koþullar altýnda, in vitro ortamda monolayer kültür sistemi ile hücre sayýsý arttýrýldý ve olgularýn diz eklemlerindeki osteokondral defektlere eklem þekil ve fonksiyonunu restore etmek için transplante edildi ve baþarýlý sonuçlar alýndý.

ÖNERÝLER:

Bu çalýþmadan alýnan olumlu sonuçlarýn ve literatür bilgilerin ýþýðý altýnda üç boyutlu biyoabsorbabl hücre taþýyýcýlarýnda yeni bir proje ile organotipik hücre kültürü kullanarak doku mühendisliði ürünü olan novo kýkýrdak generasyonlarý oluþturularak, osteokondral defektlerde eklemin þekil ve fonksiyonunu restore etmek için resipient alana implante edilmeye çalýþýlacaktýr.

VI. KAYNAKLAR

1. Aydolette, M. B., Schumacher, B. L., Kuettner, K. E.: Heterogeneity of Articular Chondrocytes. Articular Cartilage and Osteoarthritis, (Ed) K. E. Kuettner, R. Schleyerbach, J. G. Peyron, and V. C. Hascall, Raven Press New York, 1992, 237-249.

2. Beaver, R. J., Mahomed, M., Backstein, D., Davis, A., Zukor, D. J., and Gross, A. E.: Fresh Osteochondral Allografts for Post-traumatic Defects in the Knee. A Survivorship Analysis, J. Bone and Joint Surg., 74-B(1):105-110, 1992.

3. Bentley, G., Smith, A. U., Mukerjhee, R.: Isolated Epiphyseal Chondrocyte Allografts into Joint Surfaces (an experimental study in rabbits), Ann. Rheum. Dis., 37: 449-458, 1978.

4. Brittberg, M., Lindahl, A., Nilsson, A., Ohlsson, C., Isaksson, O., and Peterson, L.: Treatment of Deep Cartilage Defects in the Knee with Autologous Chondrocyte Transplantation, New Eng. J. Med., 331:889-895, 1994.

5. Brittberg, M., Lindahl, A., Nilsson, A., Ohlsson, C., Isaksson, O., and Peterson, L.:Rabbit Articular Cartilage Defects Treated With Autologous Cultured Chondrocytes. Clin. Orthop.,326:270-283, 1996.

6. Buckwalter, J. A., and Lohmander, S.:Current Concepts Review. Operative Treatment of Osteoarthritis. Current Practice and Future Development, J. Bone and Joint Surg., 76-A:1405-1418, 1994.

7. Buckwalter, J. A., and Mow, V. C.:Cartilage Repair in Osteoarthritis. Osteoarthritis, Diagnosis, and Medical/Surgical Management, ikinci baský., R. W. Moskowitz, D. S. Howell, V. M. Goldberg, and H. J. Mankin (ed), W. B. Saunders, Philadelphia, 1992, 71-107.

8. Buckwalter, J. A.: Regenerating Articular Cartilage. Why the Sudden Interest? Orthop. Today, 16:4-5, 1996.

9. Buckwalter, J. A.: Should Bone, Soft-tissue, and Joint Injuries Be Treated with Rest or Activity? J. Orthop. Res., 13:155-156, 1995.

10. Bujia, J,: In Vitro Engineering of Autologous Cartilage Tissue for Reconstructive Surgery: Possibilities and Limitations, LRO, 74:205-210, 1995.

11.Cao, Y., Ibarra,C., Vacanti, CA.: Tissue Engineering Cartilage and Bone. Synthetic Biodegradable Polymer scaffolds. Brikhauser, Boston, 1997,200-214.

12. Convery, F. R., Meyers, M. H., and Akeson, W. H.: Fresh Osteochondral Allografting of the Femoral Condyle, Clin. Orthop., 273:139-145, 1991.

13. Crane, G. M., Ishaug, S. L. and Miros, A. G.: Bone Tissue Engineering, Nat. Med., 1 (12): 1322-1324, 1995.

14. Czitrom, A. A., Keating, S., and Gross, A. E.: The Viability of Articular Cartilage in Fresh Osteochondral Allografts after Clinical Transplantation, J. Bone and Joint Surg., 72-A:574-581, 1990.

15.Furukawa, T., Eyre, D. R., Seýýchi, K., Glimcher, M. J.: Biochemical Studies on Repair Cartilage Resurfacing Experimental Defects in the Rabbit Knee, J. Bone anfd Joint Surg., 62-A(1):79-89, 1980.

16.Girdler, N. M.: Repair of Articular Defects With Autologous Mandibular Condylar Cartilage, J. Bone and Joint Surg., 75-B:710-714, 1993.

17.Green, W. T.: Articular Cartilage Repair Behavior of Rabbit Chondrocytes During Tissue Culture and Subsequent Allografting, Clin. Orthop., 124: 237-250, 1977.

18.Hagiwara, H., Schroter-Kermani, C., and Merker, H. J.: Localization of Collagen Type VI in Articular Cartilage of Young and Adult Mice, Cell and Tissue Res., 272:155-160, 1993.

19. Hansen, A. L., Foster, B. K., Gibson, G. J., Binns, G. F., Wiebkin, O. W., and Hopwood, J.: Growth-Plate Chondrocyte Cultures for Reimplentation Into Growth-Plate Defects in Sheep. Clin. Orthop., 256:286-290, 1990.

20.Iyoda, K., Mýura, T., Nogami, H.: Repair of Bone Defect With Cultured Chondrocytes Bound to Hydroxyapatite, Clin. Orthop., 288:287-293, 1993.

21.Kim, W., Mooney, D., Vacanti, JP Upton, J., Ibarra,C., Vacanti, CA: Functional viability of chondrocytes stored at 4°C. Tissue engineering. 2:75-81, 1996.

22. Kon, M.: Cartilage, Formation from Perichondrium in a Weight-Bearing Joint. An Experimental Study, Eur. Surg. Res., 13:387-396, 1981.

23.Kuettner, K. E., Schleyerbach, R., Peyron, J. G., and Hascall, V. C. (editors): Articular Cartilage and Osteoarthritis. New York, Raven Press, 1992,71-107.

24. Kurioka, H., Matsusaki, M., Ochi, M., Uchio, Y.: Effect of Basic Fibroblast Growth Factor On Chondrocyte Embedded in Collagen Gel. ISAKOS Congress Book: 214, 1997

25. Lane, J. M., Brighton, C. T., Ottens, H. R., Lipton, M.: Joint Resurfacing in the Rabbit Using an Autologous Osteochondral Graft, J. Bone and Joint Surg., 218-222, 1974.

26.Langer, R., Vacanti, J.P.: Tissue Engineering. Science, 260: 920-926, 1993.

27. Linn, F. C., and Sokoloff, L.: Movement and Composition of Interstitial Fluid of Cartilage, Arthrit. and Rheumat., 8:481-494, 1965.

28.Mankin, H. J.: The Reaction of Articular Cartialge to Injury and Osteoarthritis (first of two parts), New Eng. J. Med., 291:1285-1292, 1974.

29. Mankin, H. J.: The Reaction of Articular Cartilage to Injury and Osteoarthritis (second of two parts), New Eng. J. Med., 291:1335-1340, 1974.

30.Mitchell, N., and Shepard, N.: The Resurfacing of Adult Rabbit Articular Cartilage by Multiple Perforations Through the Subchondral Bone, J. Bone and Joint Surg., 58-A:220-233, 1976.

31. Moran, M. E., Kim, H. K., and Salter, R. B.: Biological Resurfacing of Full-Thickness Defects in Patellar Articular Cartilage of the Rabbit. Investigation of Autogenous Periosteal Grafts Subjected to Continuous Passive Motion, J. Bone and Joint Surg., 74-B(5): 659-667, 1992.

32. Morris, E.: The use of Bone Morphojenic Proteins to Articular Cartilage Defects. Orhopaedic Tissue Engineering Congress, August 1997.

33. Moskowitz, R. W., Howell, D. S., Goldberg, V. M., Mankin, H. J.: Osteoarthritis Diagnosis and Medical/Surgical Management, second edition, W. B. Saunders Company, USA, 1992.

34. Mosmann, T.: Rapid Colorimeric Assay of Cellular Growth and Survival:Application to Proliferation and Cytotoxity Assays, J. Immunol. Methods, 65:55-63, 1983.

35. Muckle, D. S., Minns, R. J.: Biological Response to Woven Carbon Fibre Pads in The Knee, J. Bone and Joint Surg., 71-B:60-62, 1989.

36. Nerem, R. M., and Sambanis, A..: Tissue Engineering: From Biology to Biological Substitutes, Tissue Eng., 1 (1): 3-13, 1995.

37. Niedermenn, B., Boe, S., Lauritzen, J., nad Rubak, J. M.: Glued Periosteal Grafts in the Knee, Acta Orthop. Scandinavica, 56:457-460, 1985.

38. Noguchi, T., Oka, M., Fujino, M., Neo, M., and Yamamuro, T.: Repair of Osteochondral Defects with Grafts or Cultured Chondrocytes. Comparison of Allografts and Isografts, Clin. Orthop., 302: 251-258, 1994.

39. Noguchi, T., Oka, M., Fujino, M., Neo, M., and Yamamuro,T.: Repair of Osteochondral Defects with Grafts or Cultured Chondrocytes. Comparison of Allografts and Isografts, Advances in Orthopeadic Surgery, 19 (1): 52-54, 1995.

40. O’Driscoll, S. W., Keeley, F. W., and Salter, R. B.: Durability of Regenerated Articular Cartilage Produced by Free Autogenous Periosteal Grafts in Major Full-Thickness Defects in Joint Surfaces Under the Influence of Continuous Passive Motion. A Followup Report at One Year, J. Bone and Joint Surg., 70-A:595-606, 1988.

41. O’Driscoll, S. W., Keeley, F. W., and Salter, R. B.: The Chondrogenic Potential of Free Autogenous Periosteal Grafts for Biological Resurfacing of Major Full-Thickness Defects in Joint Surfaces under the Influence of Continuous Passive Motion, J. Bone and Joint Surg., 68-A (7): 1017-1034, 1986.

42. Ohlendorf, C., Tomford, W. W., and Mankin, H. J.: Chondrocyte Survival in Cryopreserved Osteochondral Articular Cartilage, J. Orthop. Res., 14:413-416, 1996.

43. Paige, K. T., Cima, L. G., Yaremchuk, M. J., Vacanti, J. P., and Vacanti, C. A.: Injectable Cartilage, Plast. and Reconstr. Surg., 96 (6):1390-1400, 1995.

44.Paletta, G. A., Arnoczky, S. P., Warren, R. F.: The Repair of Osteochondral Defects Using an Exogenous Fibrin Clot (an experimental study in dogs), Am. J. Sport Med., 20 (6): 725-731, 1992.

45. Park, J. S., Ahn, J. I, Oh, D. I.: Chondrocyte Allograft Transplantation for Damaged Growth Plate, Yonsei-Med-J., 35 (4): 378-387, 1994.

46. Puelacher, W. C., Kim, S. W., Vacanti, J. P., Schloo, B., Mooney, D., Vacanti, C. A.: Tissue-Engineered Growth of Cartilage: The Effect of Varying the Concentration of Chondrocytes Seeded onto Synthetic Polymer Matrices. Int. J. Maxillafac., Surg., 23: 49-53, 1994.

47. Puelacher, W. C., Wisser, J., Vacanti, C. A., Ferraro, N. F., Jaramillo, D., Vacanti, J. P.: Temporomandibular Joint Disc Replacement Made by Tissue-Engineered Growth of Cartilage. J. Oral Maxillofac. Surg., 52: 1172-1177, 1994.

48.Sah, R. L.-Y., Kim Y.-J., Doong J.-Y., Grodzinsky, A. J., Plaas. A. H. K., and Sandy, J. D.: Biosynthetic Response of Cartilage Explants to Dynamic Compression, J. Orthopaed. Res., 7:619-636, 1989.

49. Salter, R. B., Simmonds, D. F., Malcolm, B. W., Rumble, E. J., Macmichael, D., Clements, N. D.: The Biological Effects of Continuous Passive Motion on the Healing of Full-Thickness Defects in Articular Cartilage (an experimental investigation in the rabbit). J. Bone and Joint Surg., 62-A (8): 1232-1251, 1980.

50.Schuman, L., Buma, P., Versleyen, D., de Man, B., van-der-Kraan, P. M., van-de Berg, W. B., Homminga, G. N.: Chondrocyte Behavior within Different Types of Collagen Gel in Vitro. Biomaterials, 16 (10): 809-14, 1995.

51. Shapiro, F., Koide, S. and Glimcher, M. J.: Cell Origin and Differantiation in the Repair of Full-Thickness Defects of Articular Cartilage, J. Bone and Joint Surg., 75-A:532-553, 1993.

52. Shortkroff, S., Barone, L. Hsu, H. P., Wrenn, C., Gagne, T., Chi, T., Breinan, H., Minas, T., Sledge, C. B., Tubo, R., and Spector, M.: Healing of Chondral and Osteochondral Defects in a Canine Model. The Role of Cultured Chondrocytes in Regeneration of Articular Cartilage, Biomaterials, 17:147-154, 1996.

53. Sittinger, M., Lukanoff, B., Burmester, G. R., Dautzenberg, H.: Encapsulation of artificial tissues in polyelectrolyte complexes: preliminary studies. Biomaterials, 17 (10): 1049-1051, 1996.

54. Sittinger, M., Reitzel, D., Dauner, M. H., Hammer, C., Kastenbauer, E., Planck, H., Burmester, G. R., Bujia, J.: Resorbable Polyesters in Cartilage Engineering: Affinity and Biocompatibility of Polymer Fiber Structures to Chondrocytes. J. Biomat. Res., 33: 57-53, 1996.

55.Stockwell, R. A.: Chondrocytes. J. Clin. Pathol., 12:7-13, 1978.

56. Susante, J. L. C., Buma, P., Osch, G. J. V. M., Versleyen, D., Kraan, P. M., Berg, W. B. and Homminga, G. N.: Culture of Chondrocytes in Alginate and Collagen Carrier Gells, Acta Orthop Scand., 66 (6):549-556, 1995.

57. Trippel, S. B.:Growth Factor Actions on Articular Cartilage. J. Rheumatol., 43:129-132, 1995.

58.Vacanti, CA, Paige, KT.: Engineering New Tissue: Formation of Neo-cartilage. Tissue Engineering, 2: 9106, 1995.

59. Vacanti, CA, Vacanti, JP: Bone and Cartilage Reconstruction. Principles of Tissue Engineering. Landes Company, Austin-Texas, 1996, 619-631.

60. Vacanti, CA, Vacanti, JP: The Challange of Tissue Engineering. Principles of Tissue Engineering. Landes Company, Austin-Texas, 1996, 1-5.

61. Vacanti, CA., Langer, R., Schloo, B.: Synthetic Polymers Seeded with Chondrocytes Provide a Template for New Cartilage Formation. Plast Reconstr Surg 87:753-59, 1991.

62. Vacanti, CA., Upton, J.: Tissue Engineered Morphogenesis of Cartilage and Bone by Means of Cell Transplantation Using Synthetic Biodegradable Polymer Matrices. Clinics Plastic Surg 21:445-62, 1994.

63. Wakitani, S., Goto, T., Mansour, J. M., Goldberg, V. M., and Caplan, A. L.: Mesenchymal Stem Cell-Based Repair of a Large Articular Cartilage and Bone Defect, Trans. Orthop. Res. Soc., 19:481, 1994.

64. Wakitani, S., Goto, T., Pineda, S. J., Young, R. G., Mansour, J. M., Caplan, A. L., and Goldberg, V. M.: Mesenchymal Cell-Based Repair of Large, Full-Thickness Defects of Articular Cartilage, J. Bone and Joint Surg., 76-A:579-592, 1994.

65. Wakitani, S., Kimura, T., Hýrooka, A., Ochl, T., Yoneda, M., Yasuý, N., Owaki, H., Ono, K.: Repair of Rabbit Articular Surfaces With Allograft Chondrocytes Embedded in Collage Gel, J. Bone and Joint Surg., 71-B:74-80, 1989.

66. Yamashita, F., Sakakida, K., Suzu, F., and Takai, S.: The Transplantation of an Autogeneic Osteochondral Fragment for Osteochondritis Dissecans of the Knee, Clin. Orthop., 201:43-50, 1985.

VII. EKLER:

a) Mali Bilanço ve Açýklamalar:

14.12.2000 67.280.000.-TL. (Sarf Malzemesi)

22.2.2001 867.670.000.-TL. (Sarf Malzemesi)

20.6.2001 29.500.000.-TL. (Kýrtasiye Malzemesi)

TOPLAM HARCANAN 964.450.000.-TL.

PROJE BÜTÇESÝ 962.000.000.-TL.

1. RPMI 1640, DMEM, L-GLUTAMÝN SOLÜSYONU, PENICILLIN-STREPTOMYCINE SOLÜSYONU ve FETAL CALF SERUM’u kültüre kondrositlerin beslenmesi için kültür mediumunun içeriðini oluþturmada kullanýldý.

2. KOLLEGENAZ (Type II) ve HYALURONIDAZ Enzimleri: Kýkýrdak örneklerinden kondrosit hücrelerinin separe hale getirilmesinde kullanýldý.

3. TRYPAN BLUE: Kondrosit hücrelerine canlýlýk testi yapýlmasýnda kullanýldý.

4. TRYPSIN/EDTA: Kültüre kondrositlerden subkültürlerin elde edilmesinde kullanýldý.

Þekil 1. Olgu no: 6’nýn klinik görünümü.

Þekil 2. Olgu no: 6’da omuz ekleminin kýkýrdak dokusu alýnmasý için hazýrlanmasý.

Þekil 3. Kýkýrdak örneklerinin taþýma mediumu içindeki görünümleri.

Þekil 4. Omuz eklemine koruyucu bandaj uygulamasý.

Þekil 5. Köpek kondrosit hücrelerinin monolayer kültürdeki 3. gündeki görünümleri.

Þekil 6. Köpek kondrosit hücrelerinin monolayer kültürdeki 7. gündeki görünümleri.

Þekil 7. Köpek kondrosit hücrelerinin monolayer kültürdeki 10. gündeki görünümleri.

Þekil 8. Köpek kondrosit hücrelerinin monolayer kültürdeki 15. gündeki görünümleri.

Þekil 9. Kondrosit hücrelerinin canlýlýk testi görünümleri.

Þekil 10. Olgu no: 6’nýn sað diz eklemine yaklaþým.

Þekil 11. Olgu no: 6’nýn sað diz eklemindeki osteokondral defektin görünümü.

Þekil 12. Kondrosit hücrelerinin üretildiði flasklar.

Þekil 13. Flasklardan kondrosit hücrelerinin kazýnmasý.

Þekil 14. Kondosit hücrelerinin enjektöre toplanmasý.

Þekil 15. Otolog konrosit hücrelerinin osteokondral defekte nakli.

Þekil 16. Olgu No: 6’nýn diz ekleminin kapatýlmasý.

Þekil 17, 18 ve 19. Çalýþmada kullanýlan artroskopi cihazý, Olgu no: 6’nýn diz ekleminin artroskopik muayenesi ve osteokondral defektin 8. hafta sonundaki artroskopik görünümü.

TEÞEKKÜR

Bu proje’ye emeði geçen ve Bilim Dalýmýzdan emekli olan Prof. Dr. Doðan Aslanbey’e, projeye destek olan GATA Ortopedi ve Travmatoloji Anabilim Dalý Baþkaný Prof. Dr. Ethem Gür’e ve personeline, GATA Týbbi Genetik Bilim Dalý Öðretim Üyesi Doç.Dr. Muhterem Bahçe’ye ve personeline ve Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Ortopedi ve Travmatoloji Bilim Dalý personeline ve bu projeye maddi destek veren Ankara Üniversitesi Araþtýrma Fon Müdürlüðü’ne ve Rektör Yardýmcýsý Prof. Dr. Ömer L. GEBÝZLÝOÐLU’na teþekkürlerimi sunarým.