LACTOCOCCUS LACTİS SUBSP. LACTİS MA83 SUŞUNDA FAJ ADSORBSİYON İNHİBİSYON MEKANİZMASININ HÜCRE YÜZEY KARAKTERİSTİKLERİ İLE  İLİŞKİSİ

 

 

 

 

 

 

 

 

ANKARA ÜNİVERSİTESİ ARAŞTIRMA FONU

 

PROJE NO: 20010711042

 

 

 

 

Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK (Proje Yürütücüsü)

Arş. Gör. Çağla TÜKEL

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2001, ANKARA

 

 

 

 

 

İÇİNDEKİLER

 

ÖZET                                                                                                                        i          

ABSTRACT                                                                                                             ii

TEŞEKKÜR                                                                                                             iii

ŞEKİLLER DİZİNİ                                                                                                   iv

ÇİZELGELER DİZİNİ                                                                                              v

1.      GİRİŞ                                                                                                                1

2.      KAYNAK ÖZETLERİ                                                                                      3

2.1.        Lactococcus Genus’ u ve Bu Genus’ a Ait Türlerin Özellikleri                        3

2.2.        L. lactis  Suşlarında Faj-Konakçı İnteraksiyonları                                          4

2.3.        L. lactis  Suşlarında Doğal Faj Dirençlilik Sistemleri                           5

2.3.1.       Restriksiyon/modifikasyon sistemleri                                                  7

2.3.2.       Faj DNA enjeksiyonunun engellenmesi                                                          8

2.3.3.       Abortif enfeksiyon                                                                                         8

2.3.4.       Faj adsorbsiyonunun engellenmesi                                                                 9

3.      MATERYAL ve YÖNTEM                                                                             17

3.1.       Materyal                                                                                                       17

3.1.1.    Bakteriler ve fajlar                                                                                         17

3.2.       Yöntem                                                                                                        18

3.2.1.    L. lactis subsp. lactis hücrelerine kimyasal uygulaması                                   18

3.2.2.    Faj adsorbsiyon oranının saptanması                                                  19

3.2.3.    Tek aşama faj çoğalma testi                                                                           19

3.2.4.    Faj titresinin belirlenmesi                                                                                20

3.2.5.    Doğal suşlardan plazmidlerin giderilmesi ve plazmidleri giderilmiş

             mutantların seçimi                                                                                          21

3.2.6.    L. lactis subsp. lactis’ de plazmid içeriklerinin tanımlanması               22

3.2.6.1. Plazmid izolasyonu                                                                                        22

3.2.6.2. Plazmidlerin saflaştırılması                                                                              25

3.2.6.3. Agaroz jel elektroforezi                                                                                 26

 

 

3.2.7.        L. lactis subsp. lactis’ de hücre duvarı izolasyonu ve hücre duvarı

             proteinlerinin sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi

 (SDS-PAGE) yöntemi ile tanımlanması                                                          27

3.2.7.1.  Hücre duvarı izolasyonu                                                                                27

3.2.7.2.  Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)    28

3.2.8.        Hücre duvarı karbonhidrat analizi                                                                   30

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA                                                 32

KAYNAKLAR                                                                                                        48

 

 

 

 

 

 


 

 

 

 

 

ÖZET

 

 

LACTOCOCCUS LACTİS SUBSP. LACTİS MA83 SUŞUNDA FAJ ADSORBSİYON İNHİBİSYON MEKANİZMASININ HÜCRE YÜZEY KARAKTERİSTİKLERİ İLE  İLİŞKİSİ

 

 

  

Lactococcus lactis subsp. lactis MA83 suşunda; fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarına karşı, 32.7 kb’lık laktoz plazmidi tarafından kodlanan, faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemi saptandı. Faj dirençlilik, 32.7 kb plazmid varlığında üretilen ekzopolisakkarit materyalin faj almaç bölgeleri maskelemesi sureti ile meydana geldi.  Lactococcus lactis subsp. lactis MA83 suşunun hücre duvarı ekstraktlarına, terminal N-asetilglukozamin, b-D-galaktozil, glukozil ve mannozil kalıntılarına spesifik lektinlerin uygulanması ve yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) analizleri sonucu, fajların almaç bölgesini maskeleyen materyalin galaktozdan oluştuğu saptandı.  Sodyum dodesil sülfat-oliakrialamid jel elektroforez (PAGE) analiz sonuçları, Lactococcus lactis subsp. lactis MA83 suşunda fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarına ait almaç bölgenin hücre duvarı üzerinde bulunduğunu ve protein yapıda bir materyal tarafından oluştuğunu gösterdi.

 

 

 

ANAHTAR KELİMELER: Lactococcus lactis subsp. lactis, ekzopolisakkarit, faj  adsorbsiyonunun engellenmesi, faj almaç bölge

 

 

 

 

 

 

 

ABSTRACT

 

 

 

RELATIONSHIP BETWEEN PHAGE ADSORPTION INHIBITION MECHANISM AND  CELL SURFACE CHARACTERISTICS IN LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS MA83

 

 

Adsorption inhibition type resistance, encoded by the 32.7 kb lactose plasmid, in Lactococcus lactis subsp. lactis MA83 for phages fla2, fld5, flc7 ve f857, was determined. Phage resistance was occured by masking phage receptor sites by exopolysaccharide material which produced in the precence of 32.7 kb plasmid.  This exopolysaccharide material was found to be formed by galactose by the end of terminal b-D-galactosyl, N-acetylglucoseamine, glucosyl and mannosyl residues spesific lectins treatments and high performance liquid chromatography (HPLC) analysis of cell wall extracts of Lactococcus lactis subsp. lactis strain MA83. Sodyum dodesil sulphate-polyacrilamide gel electrophoresis analyses showed that the receptor site for  fla2, fld5, flc7 ve f857 phages was on cell wall and formed by a proteinaceous material in Lactococcus lactis subsp. lactis MA83.

 

 

 

 

KEY WORDS: Lactococcus lactis subsp. lactis, exopolysaccharide inhibition of   phage adsorption,  phage receptor site

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TEŞEKKÜR

 

 

 

 

Bu araştırma Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Katkılarından dolayı tüm fon yönetimine ve proje değerlendirme grubu personeline, araştırma biyomateryallerinin sağlanmasında yardımlarından dolayı  da Dr. A. Budde Niekiel’e (Whisby/Germany) sonsuz teşekkürlerimizi sunarız.

 

 

 

 

Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK

Arş. Gör. Çağla TÜKEL

 

Ankara 2001


1.      GİRİŞ

 

Süt endüstrisinde, başta peynir olmak üzere bir çok fermente süt ürününün üretiminde starter kültür olarak kullanılan laktokok suşlarının faj enfeksiyonu sonucu inaktive edilmesi, halen bütün dünyada önemini koruyan ticari bir sorundur. Faj enfeksiyonu ile laktik asit üretimi yavaşlamakta, ürün miktarı ve kalitesi düşmektedir. Süt fermentasyonları; hammaddenin steril olmaması, sıvı doğasından dolayı fajların tüm ortama dağılmasına olanak tanıması ve aynı saf kültürlerin sürekli kullanımı gibi ana nedenlerle faj kontaminasyonuna oldukça duyarlıdır.

 

Laktik asit bakterileri içerisinde faj kontaminasyonlarından en yüksek düzeyde etkilenen starter suşlar, Lactococcus genus’u üyeleridir. Bu nedenle, faj dirençlilik sistemlerinin tanımlanması ve geliştirilmesi araştırmaları laktokok türleri üzerinde yoğunlaşmıştır. Moleküler biyoloji tekniklerinin gelişimine paralel olarak, bu bakterilerde yeni dirençlilik sistemlerinin tanımlanması ve daha önce tanımlanan sistemlerin detaylı analizlerle moleküler doğasının anlaşılması olanaklı hale gelmiştir. Faj dirençlilik sistemlerinin genetik determinantlarının ve biyokimyasal etki mekanizmasının analizi, faj dirençli suşların endüstriyel kullanımında güvenilirlik sağlamaktadır. Sadece genetik verileri esas alan endüstriyel starter suş geliştirme çalışmalarının önemli sakıncalar taşıdığı bilinmektedir. Zira etki mekanizması ve bu mekanizmanın faj ya da konakçı bakteriye bağlı değişimleri kimyasal yönden bilinmeyen dirençlilik sistemleri, farklı ürünlerde ve üretim koşullarında aynı etkinliği gösterememektedir. Biyokimyasal araştırmalar, faj dirençlilik sistemlerinin etkinliğinin; faj almaç bölgelerin, faj adsorbsiyon karakteristiklerinin, faj DNA restriksiyon/modifikasyon potansiyellerinin ve faj replikasyon karakteristiklerinin değişimine bağlı olarak sınırlandırıldığına işaret etmektedir.

 

L. lactis suşlarında tanımlanan faj dirençlilik sistemleri içerisinde, endüstriyel suşlarda kullanım açısından en büyük potansiyele sahip olan, faj adsorbsiyonunun engellenmesidir. Çünkü bu dirençlilik sisteminde fajın konakçı suş ile ilişkisine ilk aşamada olanak tanınmamakta ve böylece, diğer dirençlilik sistemleri için laktokok suşlarında tanımlanan faj modifikasyonuna bağlı duyarlılık, faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemi içeren suşlarda meydana gelmemektedir. Endüstriyel starter suşlarda sağladığı bu emsalsiz avantajlara rağmen, söz konusu faj dirençlilik sisteminin genetik ve biyokimyasal doğası oldukça karmaşıktır ve faj tipine bağlı etkinlik değişimi, diğer sistemlerden çok daha yüksek oranda gerçekleşmektedir.

 

Bu araştırmada; daha önce  laktokok fajlarına karşı faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik özelliği içerdiği belirlenmiş olan Lactococcus lactis subsp. lactis MA83 suşunda, faj almaç bölgenin plazmid varlığında aktivite değişiminin belirlenmesi ve söz konusu bölgenin maskelenmesinde rol oynayan materyalin biyokimyasal tanısının yapılması, amaçlanmıştır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. KAYNAK ÖZETLERİ

 

2.1.  Lactococcus  Genus’ u ve Bu Genus’ a Ait Türlerin Özellikleri

 

Laktik asit bakterilerinin 15 cinsinden biri olan Lactococcus genus’ u; L. lactis, L. gavriae, L. plantarum, L. piscium ve L. raffinolactis türlerini içermektedir. Gram pozitif kemoorganotrofik, spor ve kapsül oluşturmayan bu bakteriler, hem bağımlı katalaz sistemi içermemektedir. Flavoprotein peroksidaz enzimlerinin sınırlı oksijen redüksiyonundan dolayı, moleküler oksijeni tolere etme yeteneğindedirler. Homofermentatif özelliktedirler ve karbonhidrat katabolizması sonucu ana ürün olarak L(+) laktik asit oluştururlar. Hareketsizdirler ve hemolitik reaksiyon göstermemektedirler. Yalnız bazı L. lactis subsp. lactis suşları zayıf a hemoliz yeteneğinde bulunmuştur. N grup antisera ile aglutine olmayan nadir suşlar hariç, tümü N grup antijen içermektedir. 10 0C inkübasyon sıcaklığında gelişme gösterirken, 45 0C de gelişememe özellikleri, bu genus’ u hem streptokoklardan hem de enterokoklardan ayırmaktadır. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 0C’ dir. Siferik hücreler ortalama 0.5-1.2 x 0.5-1.5 mm boyutlarındadır ve hücre çiftlerinin temas yönünde uzaması, bu bakterilerin morfolojik tanıda laktobasillerle karıştırılmasına yol açmaktadır (Schleifer 1987, Holt  1994, Boumerdassi  1997).

 

Laktokoklar içerisinde süt endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan suşlar, L. lactis alt türleridir. L. lactis türü, iki alt tür ve bir biyovaryete içermektedir. Bunlar; L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris ve L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis’ dir. L. lactis subsp. lactis suşları, arjinin hidrolizi sonucu amonyak oluşturma ve 40 0C inkübasyon sıcaklığında gelişme özellikleri ile, L. lactis subsp. cremoris’ den belirgin bir şekilde ayrılmaktadır. L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis’ in sitrat fermentasyonu sonucu diasetil ve asetoin oluşturma yeteneği, L. lactis subsp. lactis’ den yegane farklılığı olarak tanımlanmıştır. Endüstriyel önemleri nedeniyle biyokimyasal ve genetik araştırmaların odağı haline gelen L. lactis suşları da, diğer laktokok türleri gibi evrimsel pozisyonları ile patojenik genus’ lardan ayrılmaktadır. Tüm laktokok türleri insan ve hayvan tüketimine güvenilir (GRAS) mikroorganizmalar olarak tanımlanmıştır. Kronik ya da enfeksiyöz tipte hastalık etmeni üyeleri bulunmamaktadır (Teuber 1990, Holt et al. 1994, Erlandson and Batt 1997).

 

2.2. L. lactis Suşlarında Faj-Konakçı İnteraksiyonları

 

L. lactis suşları ile fajları arasında; litik, lizogenik ve pseudolizogenik yaşam döngüleri olarak tanımlanan,  3 ana interaksiyon tipi saptanmıştır. Litik döngü genel hatları ile, fajın hücre yüzeyinde yer alan özel almaç bölgelere geri dönüşsüz bir şekilde adsorbsiyonu, faj DNA’ inin hücre yüzey proteinleri ve kasılabilir kuyruk kılıfı ile faj lisinleri gibi faj elemanlarının yardımı sonucu hücre içine enjeksiyonu, konakçı hücre replikasyonunun durdurulması ve bu sistemin faj replikasyonu için yönlendirilmesi, faj RNA ve proteinlerinin sentezi, baş, kuyruk, ve kuyruk fibrilleri gibi yapıların montesi ile olgun faj partiküllerinin oluşturulması ve salınma aşamalarını içermektedir (Sanders 1988). Dinamik denge halindeki faj-bakteri süspansiyonlarında adsorbsiyon, 12 dk içerisinde tamamlanmaktadır. Faj DNA enjeksiyonu ise, adsorbsiyonun tamamlanmasından hemen sonra gerçekleşmektedir. Faj DNA enjeksiyonundan, çoğalan faj partiküllerinin konakçıdan salınmasına kadar geçen süre olarak tanımlanan latent dönem 20-60 dk, populasyonda bulunan bazı bireylerde faj salınmasının gecikmesi ile karakterize edilen artış dönemi ise 10-30 dk, arasında değişmektedir. Konakçı suşlarda litik bir döngünün tamamlanması için ortalama süre, 50-70 dk arasındadır (Klaenhammer 1984, Sanders 1988, Hill 1993, Dinsmore and Klaenhammer 1995, Garvey et al. 1996). Olgun faj partiküllerinin bakteriyi parçalayarak ortama salınması, bakteri içerisinde üretilen faj partiküllerinin oluşturduğu osmotik basınç ve faj lisinlerinin etkisi ile sağlanmaktadır. Bir fajın enfeksiyonu sonucu bir bakteride üretilen ve bakterinin parçalanması ile ortama salınan enfeksiyöz virüs partikülü sayısını ifade eden faj patlama büyüklüğü ise; 9–105 adet arasında değişebilmektedir (Shaerman et al. 1989, Klaenhammer  and Dinsmore 1997).

 

Lizogeni, adsorbsiyon ve faj DNA enjeksiyonundan sonraki faj enfeksiyon aşamalarının kesintiye uğratılarak, hücre içine giren faj DNA’ inin konakçı genomuna bağlanması ile karakterize edilmektedir. L. lactis suşlarında faj-konakçı dinamik dengesi ile doğrudan ilişkili olan bu durumun hangi fizyolojik ve biyokimyasal süreçlerde gerçekleştiği bilinmemektedir. Bakteri genomunda profaj halinde bulunan faj DNA’ i, kromozomal DNA ile birlikte replike edilerek yeni kuşaklarda da sürekliliğini korumaktadır. Temperent fajlar, kendiliğinden ya da mitomisin C veya ultraviyole ışınları uygulaması gibi deneysel koşullarda litik döngüye geçebilmektedir (McKay and Baldwin 1973, Reyrolle et al. 1982, Dinsmore and Klaenhammer 1995).

 

Pseudolizogeni; hücre içine enjekte edilen faj DNA’ inin replikasyonunun bloke edilmesi, ancak konakçı genomuna entegrasyonunun gerçekleşememesinden dolayı, faj DNA’ inin stoplazmada plazmid davranışı göstermesi sonucu oluşmaktadır. Laktokoklarda, pseudolizogen suşların yeni faj enfeksiyonlarına karşı dirençli hale geldikleri saptanmıştır. Gram negatif bakterilerde faj almaç bölgelerin kromozomal mutasyonlarla indirgenmesinin, faj almaç bölgelerin bozulmasının ve temperent fajların litik mutantlarının bu direnç oluşumunda rol aldığı bilinmekte, ancak L. lactis suşlarında söz konusu mekanizmanın etkinliğine ait bir çalışma bulunmamaktadır (de Vos 1989).

 
2.3. L. lactis Suşlarında Doğal Faj Dirençlilik Sistemleri

 

L. lactis’ de faj dirençlilik sistemlerinin fenotipik, genetik ve biyokimyasal karakterizasyonu, bu bakterilerin daha detaylı bir şekilde anlaşılmasına ve süt fermentasyonları için starter kültür özelliklerinin geliştirilmesine olanak tanımıştır. Faj dirençli endüstriyel suş seçimi çalışmalarında temel yaklaşım, fermentasyon ortamlarında fajlar ile sürekli temas halinde olan L. lactis suşlarındaki doğal dirençlilik mekanizmalarının tanımlanması ve kullanım alanlarının araştırılmasıdır. Halen tartışma konusu olan bir diğer yaklaşım ise, modern genetik tekniklerin kullanımı ile bu sistemlerin genetik determinantlarının duyarlı starter suşlara aktarımı ve ifadesi çalışmalarını esas almaktadır (de Vos et al. 1984, Klaenhammer 1984, Teuber 1990).

 

L. lactis suşlarında bugüne kadar saptanan doğal faj dirençlilik sistemleri, etki tipine göre dört ana  grupta toplanmıştır. Bunlar; faj  adsorbsiyonunun  engellenmesi, faj DNA

 

 

Faj enfeksiyon                                                                      Faj Dirençlilik Sistemi

Aşamaları

 

 


                                                        Adsorbsiyonun engellenmesi

 

 


           

Adsorbsiyon               

 

 


                                                                       Faj DNA enjeksiyonunun engellenmesi

 

 

 


            Faj DNA enjeksiyonu             

 

 


                                                                       Restriksiyon ve modifikasyon

 

 


            Faj DNA replikasyonu

 

 

 

 


            Faj RNA ve protein

Sentezi

 

                                                                       Abortif Enfeksiyon

                                                          

 


Faj montesi

 

 

 

 

 


Salınma

 

 

Şekil 2.1. L. lactis suşlarında doğal faj dirençlilik sistemleri ve bunların faj enfeksiyon

                 sürecindeki etki basamakları (Dinsmore and Klaenhammer 1995).

Enjeksiyonunun engellenmesi, restriksiyon/modifikasyon sistemleri ve abortif faj enfeksiyon mekanizmaları olarak tanımlanmaktadır (Hill 1993). Bu sistemler üzerinde yürütülen yoğun araştırmalar, şüphesiz ki yeni grupların ilavesine yol açacaktır. L. lactis suşlarında doğal faj dirençlilik sistemlerinin faj enfeksiyon sürecinde etkinlik gösterdiği aşamalar, şekil 2.1’de şematize edilmiştir.

 

2.3.1. Restriksiyon/modifikasyon sistemleri

 

Restriksiyon/modifikasyon tipte faj dirençlilik sistemleri, tüm laktik asit bakterilerinde yaygın olarak bulunmaktadır. Sistemin restriksiyon enzim komponenti, modifiye olmamış DNA sekanslarını özel bölgelerden tanıma ve kesme aktivitesi göstermektedir. Bu şekilde, hücreye giren modifiye olmamış faj DNA parçalanarak faj çoğalması engellenmektedir. Konakçı DNA’ inin kendi restriksiyon enzim aktivitesinden korunması ise, bu sistemin ikinci komponenti olan modifikasyon aktivitesi ile sağlanmaktadır. Modifikasyon aktivitesinden sorumlu enzimler, restriksiyon kesim bölgelerini metilleyen özel metilazlardır (Dinsmore and Klaenhammer 1995). Restriksiyon/modifikasyon sistemleri, faj DNA enjeksiyonu gerçekleşir gerçekleşmez aktive olduğu için, hücrenin faj enfeksiyonundan zarar görmesine olanak tanınmadan faj DNA parçalanmaktadır. Bu avantajına rağmen, konakçı restriksiyon sistemlerinden kaçan fajların modifikasyon sistemleri tarafından konakçı hücre genomu gibi algılanmak suretiyle modifiye edilmeleri, sistemin etkinliğini düşürmektedir (Hill 1993, Daly et al. 1996).

 

Restriksiyon/modifikasyon sistemlerinin genetik determinantları üzerinde yürütülen araştırmalarda, L. lactis suşlarında bu özelliğin genellikle plazmidler tarafından kodlandığı saptanmıştır (Fitzgerald et al. 1982, Chopin et al. 1984, Sanders 1988, Hill 1993, Twomey et al. 1997, Akçelik 1999). Değişik  L. lactis suşlarında  tanımlanan LlaI ve LlBI sistemleri, gen kodu plazmidler üzerinde bulunan restriksiyon/modifikasyon sistemlerinin tipik örneklerini teşkil etmektedir (Mayo et al. 1991, O’Sullivan and Klaenhammer 1995, Twomey et al. 1997). L. lactis suşlarında gen kodu kromozomal DNA üzerinde bulunan tek restriksiyon / modifikasyon sistemi, L. lactis subsp. cremoris UC503 suşunda tanımlanan ScrFI sistemidir. Ancak sistemin içerdiği iki modifikasyon enzimine ait genler, bazı suşlarda ve rekombinantlarda plazmidler üzerinde saptanmıştır. Bu suşlarda, söz konusu plazmidler üzerindeki metilaz genlerinin dizi analizleri ve DNA homolojileri; bu genlerin de kromozomal DNA kökenli fragmentlerin transpozisyonu ile plazmidlere taşındığını göstermiştir (Hill 1993, Dinsmore and Klaenhammer 1995, Su et al. 1998).

 

2.3.2. Faj DNA enjeksiyonunun  engellenmesi

 

Faj DNA enjeksiyonunun engellenmesi tipte faj dirençlilik sisteminin laktik asit bakterilerinde bulunduğuna dair ilk veriler, Lactobacillus casei YIT 9002 suşunda, PL-1 fajı ile yürütülen çalışmalardan elde edilmiştir (Watanabe et al. 1984).  L. lactis suşlarında bu faj dirençlilik sisteminin varlığı ve genetik determinantları üzerinde toplam üç makale bulunmaktadır. Garvey et al. (1996), c2 fajına karşı yüksek düzeyde duyarlılık gösteren L. lactis subsp. lactis MG1614 suşuna, pNP40 plazmidinin aktarımı sonucu oluşturdukları transformantlarda, söz konusu faj DNA’ inin hücre içine enjeksiyonunun engellendiğini saptamıştır. Yine c2 fajı ile yürütülen bir diğer araştırmada, L. lactis subsp. lactis LM2301 suşunda faj DNA enjeksiyonunun kromozomal DNA kökenli genlerin aktivitesi sonucu engellendiği belirlenmiştir (Garbutt et al. 1997). Son olarak, Akçelik (1998) L. lactis subsp. lactis MPL18 suşunda la2 fajına karşı dirençliliğin, faj DNA enjeksiyonunun bloke edilmesi suretiyle etki gösterdiğini ve kromozomal DNA kökenli bir özellik olduğunu tanımlamıştır.

 

L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonundan sonra, faj DNA’ inin hücre içine translokasyonunu yöneten proteinlerin varlığı saptanmıştır (Monteville et al. 1994). Ancak yukarıda özetlenen her üç araştırmada da, bu proteinlerin inaktivasyonuna dair biyokimyasal deliller sunulmamıştır.

 

2.3.3. Abortif enfeksiyon

 

Abortif enfeksiyon (Abi), restriksiyon/modifikasyon aktiviteleri dışında kalan ve hücre içinde faj çoğalmasını engelleyen mekanizmaların tümünü kapsamaktadır. L. lactis suşlarında tipik olarak plazmidler tarafından kodlanan bu faj dirençlilik sisteminin, nadir kromozomal DNA kökenli örnekleri de saptanmıştır (Dinsmore and Klaenhammer 1995, Klaenhammer and Dinsmore 1995,  Klaenhammer and Dinsmore 1997). L. lactis suşlarında tanımlanan abortif enfeksiyon sistemleri; etki mekanizması ve dirençliliğin moleküler doğası esas alınarak, AbiA, AbiB, Abi C, Abi D, Abi D1, Abi E, Abi F, Abi G, Abi H, Abi K ve Abi L olmak üzere, 11 alt gruba ayrılmıştır (Moineau  et al. 1997).

 

Abi A; 280C ve 320C de aktif ancak 370C inkübasyon sıcaklığında inaktif olan ve faj plak çapı ile faj plak etkinliğini düşürmek suretiyle etki eden, ısı duyarlı dirençlilik mekanizmasıdır (Moineau et al. 1997). Abi B sisteminin  dirençlilik etkinliği, faj transkriptlerinin azaltılması olarak tanımlanmaktadır. Çoğu kez aynı suşta Abi A ile birlikte saptanan Abi C ise, faj patlama büyüklüğünü indirgemektedir (Cluzel et al. 1991). Abi D ve Abi D1 alt gruplarının her ikisinde de faj dirençlilik, küçük izometrik başlı fajların translasyon süreçlerinin engellenmesi sonucu sağlanmaktadır. Bu sistemler, farklı gen yapısı ile birbirinden ayrılmaktadır (Renault 1996, McLandsborough et al. 1998). Abi E ve Abi F’ de, tıpkı Abi D ve Abi D1 gibi, aynı suşta bulunan iki farklı gen tarafından determine edilmektedir. Abi E, küçük izometrik fajlarda transkripsiyon, translasyon ve paketleme aşamalarında, Abi F ise aynı fajlar için yalnız replikasyon aşamasında dirençlilik sağlamaktadır (Garvey et al. 1995). Düşük oranda G+C içeriği ile karakterize edilen Abi G genleri protein ürünleri de, farklı faj tiplerinin replikasyonunu engelleme yönünde aktivite göstermektedir (Fitzgerald et al. 1996). 11 alt grup içerisinde tek kromozomal DNA kökenli Abi sistemi olan Abi H, izometrik baş yapısındaki fajların plak etkinliğini düşürmektedir. Abi K sistemi, prolat ve küçük izometrik fajlarda plak çapı ve patlama büyüklüğü redüksiyonuna yol açmaktadır (Prevots et al. 1996). L. lactis’ te tanımlanan son abortif enfeksiyon sistemi Abi L, prolat ve küçük izometrik fajların transkripsiyon sonrası enfeksiyon aşamalarını inhibe etmektedir (Yi-Mo et al. 1999)

 

2.3.4. Faj adsorbsiyonunun engellenmesi

 

Fajlara karşı hücresel direncin ilk aşaması, hücre yüzeyinde faj adsorbsiyonunun (tutunma) engellenmesidir. Hücre duvarı ya da  stoplazma membranı üzerinde lokalize olan faj almaç bölgelerine (faj reseptörleri) ait kimyasal bileşenlerin birinin eksikliği ya da monomerlerinin hatalı polimerizasyonu yanında, bu almaç bölge materyalini maskeleyecek bir başka kimyasalın hücre tarafından üretimi de söz konusu bölgelerin inaktivasyonuna yol açabilmektedir (Hill 1993). L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonunun engellenmesi üzerine yürütülen çalışmalar; kromozomal genlere ve plazmidlere bağlı mutant geliştirme ve seçme olmak üzere, iki temel stratejiyi esas almaktadır. Her iki genetik yaklaşım sonucunda da, bu dirençlilik sisteminin biyokimyasal esası üzerindeki bilgi, mutantların hücre yüzey karakteristiklerinde meydana gelen değişimlerin tanımlanması ile sağlanmaktadır (Dinsmore and Klaenhammer 1995).

 

L. lactis suşlarında faj adsorbsiyon karakteristiklerinin belirlenmesine ilişkin ilk araştırmalar Oram and Reiter (1968) tarafından yürütülmüştür. Araştırıcılar, L. lactis subsp. lactis ML3 suşunda ml3 fajına ait almaç bölgenin stoplazma membranı üzerinde lokalize olduğunu ve faj adsorbsiyonunda hücre duvarının rol oynamadığını belirlemiştir. Daha sonra ml3 fajının test edildiği diğer laktokok suşlarında  da faj adsorbsiyonunun, stoplazma membranı üzerindeki özel almaç bölgelerde meydana geldiği saptanmıştır. Ancak ml3 fajı yanında denemeye alınan 5 farklı laktokok fajının ise, ml3 fajına karşı test edilen tüm laktokok suşlarına hücre duvarında yer alan almaç bölgelerden tutunduğu tespit edilmiştir. L. lactis subsp. lactis ML3 suşu membran yapılarının biyokimyasal analizi sonucu, ml3 fajına ait almaç bölgenin lipoprotein yapıda olduğu tanımlanmıştır (Oram 1971).

 

Günümüzde, adsorbsiyonun engellenmesi tipte dirençlilik özelliğine sahip mutantlar, fermente süt endüstrisinde önemli bir yer tutan peynir üretiminde starter kültürler olarak kullanılmaktadır (King et al. 1983, Vlegels et al. 1988). Bu mutantlar ve diğer laboratuvar suşları üzerinde yürütülen genetik ve biyokimyasal esaslı araştırmalar sonucu, laktokok hücrelerindeki faj almaç bölgelerin doğası hakkında önemli ip uçları elde edilmiştir.

 

 Değişik araştırıcılar, laktokok suşlarında faj almaç bölgelerin adsorbsiyon spesifitelerinin, genellikle bu suşların hücre duvarında lokalize olan karbonhidratlar tarafından determine edildiğini belirlemiştir (Sijtsma et al. 1988, Sijtsma et al. 1990a, Valyasevi et al. 1990, Schaffer et al. 1991, Valyasevi et al. 1994). Valyasevi et al. (1990) tarafından L. lactis subsp. cremoris KH suşunda yürütülen araştırmada; bu suşun hücre duvarında spesifik almaç bölgeleri bulunan ve yüksek oranda adsorbsiyon yeteneği gösteren 5 laktokok fajının, hücre duvarındaki galaktozun azalışına bağlı olarak, KH suşuna karşı adsorbsiyon ilgilerini hızlı bir şekilde yitirdikleri, saptanmıştır. Galaktozun hücre duvarından tamamen elimine edilmesi halinde ise, hiç faj tutunması meydana gelmemiştir. Schaffer et al. (1991), L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis F7/2 ve L. lactis subsp. lactisWg2-1 suşlarının hücre duvarlarına metaperiodat ve asit hidrolizi uygulamaları sonucu, suşların faj adsorbsiyon ilgilerinde meydana gelen değişimleri esas alarak, bu suşlarda da faj almaç bölgelerin karbonhidrat polimerleri olduğunu ileri sürmüştür. Ancak,  araştırmada faj almaç bölge tanısına yönelik detaylı kimyasal analizler yapılmamıştır.

 

Gopal and Crow (1993) L. lactis subsp. cremoris E8 suşu ve bu suşun kromozomal DNA mutasyonları sonucu oluşturulmuş mutantı 398’ de, hücre duvarı ile gevşek bir şekilde ilişkilenmiş bir materyalin (LAM) varlığını tanımlamıştır. Doğal suşta iki farklı fajın LAM materyaline adsorbsiyonu yüksek oranda meydana gelirken, aynı fajların mutant suşa (398) adsorbsiyonunun engellendiği belirlenmiştir. Buradan hareketle araştırıcılar, LAM materyalinin faj adsorbsiyonu ile doğrudan ilişkili olduğunu ve bu materyalde meydana gelen yapısal ya da bileşen değişimlerinin faj duyarlılığı ya da dirençliliği belirlediğini ileri sürmüştür. Nitekim L. lactis subsp. lactis 398’ de LAM materyalinin, atasal suş E8’ den 2-3 kat daha fazla olduğu, 5 kat daha fazla ramnoz ve 2 kat daha fazla galaktoz içerdiği saptanmıştır. Ayrıca 398’ e ait LAM materyalinde, E8 LAM materyalinde tanımlanan 21 kDa büyüklükteki bir proteinin yer almadığı tesbit edilmiştir. Tüm bu bulgulara rağmen, faj adsorbsiyonunun bu komponentlerin herhangi biri ile doğrudan ilişkisi, araştırma kapsamında tanımlanamamıştır.

 

Faj almaç bölgelerde lökalize olan karbonhidratlar, belirli fajların adsorbsiyonunu teşvik ederken, bazılarının adsorbsiyonunu ise engelleyebilmektedir. Bu şekilde aynı almaç bölgeye sahip fajlar arasında, L. lactis suşlarının homolog fajları lehine adsorbsiyon koşulları oluşmaktadır. L. lactis subsp. lactis C2 suşu ile yürütülen, homolog faj c1 ve diğer laktokok fajları ml3, kh, 1, h, 5 ve 13’ün kullanıldığı çalışmalarda; bu suşun hücre duvarında, tüm fajlar için tek bir almaç bölgenin bulunduğu saptanmıştır. Almaç bölgenin detaylı kimyasal analizi sonucu ramnoz içerdiği ve tüm fajların karışımına maruz bırakılan hücrelerde homolog faj c1’ in adsorbsiyonu teşvik edilirken, diğer fajların adsorbsiyonunun baskılandığı belirlenmiştir. Yine aynı araştırmada, sk1 fajının, C2 suşu hücre duvarında yer alan ancak diğer fajlardan farklı olan almaç bölgesinin, glukoz ve ramnoz polimeri olduğu saptanmıştır (Valyasevi et al. 1994).

 

L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemlerinin plazmidler tarafından kodlandığına dair ilk bulgular Sanders and Klaenhammer (1983) tarafından yayınlanmıştır. Bu araştırmada, L. lactis subsp. lactis ME2 suşunda, Ø18 fajının adsorbsiyonunun pME0030 olarak adlandırılan 31 MDa  büyüklükteki bir plazmidin varlığında engellendiği saptanmıştır. pME0030 plazmidinin giderildiği L. lactis subsp. lactis ME2 mutantlarında Ø18 fajı adsorbsiyonu % 98 gibi yüksek bir orana ulaşmıştır. Ancak araştırma kapsamında plazmid kodlu dirençlilik sisteminin biyokimyasal doğasına dair bir sonuç verilmemiştir. Benzer olarak de Vos et al. (1984) L. lactis subsp. cremoris SK110 suşunda tanımladıkları 54 kb büyüklükteki pSK11 plazmidinin sk11G fajı adsorbsiyonunu engelleyen mekanizmayı kodladığını belirlemiştir. Bu suşta faj dirençlilik sisteminin etki mekanizmasının analizine yönelik çalışmalar sonucu (Sijtsma et al. 1988, Sijtsma et al. 1990a, Sijtsma et al. 1990b); pSK11 plazmidini içeren doğal suş L. lactis subsp. cremoris SK110 ile, bu suşun pSK11 plazmidini içermeyen ve sk11G fajına duyarlı mutantı SK112’ nin hücre yüzey karakteristiklerinin farklı olduğu kanıtlanmıştır. İlk belirlenen farklılıklar; SK112 mutantında  hücre yüzeyinin, SK110 suşuna göre daha yüksek oranda negatif yük içermesi ve daha yüksek düzeyde hidrofobisiteye sahip olması şeklinde tanımlanmıştır. Araştırmalarda, hücre yüzeyi karbonhidrat kompozisyonu; lektinlerin spesifik şekerlere ilgisi esas alınarak belirlenmiştir. Adsorbsiyonun engellenmesi tipte faj dirençlilik özelliğine sahip doğal suş SK110, terminal b-D-galaktozil kalıntılarına spesifik lektinlerin muamelesi sonucu aglutine olmuş, ancak terminal glukozil kalıntılarına spesifik lektinlerle muamele edildiğinde reaksiyon vermemiştir. Bu suşun faj duyarlı mutantı SK112 ise; atasal suş SK110’ un aksine, terminal b-D-galaktozil kalıntılarına spesifik lektinlerle reaksiyon vermezken, terminal glukozil kalıntılarına spesifik lektinlerle muamelesi sonucu aglutine olmuştur. Atasal suş ve mutant suşa ait hücre duvarı bileşimi karşılaştırıldığında; SK110 suşunun, SK112’ ye oranla çok yüksek miktarda galaktoz içerdiği belirlenmiştir. Atasal suşta, alkali muamelesi sonucu faj duyarlılığın meydana gelmesi ise; söz konusu suşta faj almaç bölgenin bozulmadığının, ancak bu bölgeyi maskeleyen ve galaktozil içeren materyalin ortadan kalktığının işareti olarak kabul edilmiştir. Her iki suşta da lipotaykon asidinin (LTA) analiz sonuçları karşılaştırıldığında; tek farklılığın atasal suşa ait lipotaykon asidindeki galaktoz olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar, bu bulgulardan hareketle, SK110 suşunda lipotaykon asidinin faj adsorbsiyonundan sorumlu yapı olduğunu ileri sürmüştür.

 

Dunny et al. (1988) L. lactis subsp. lactis LM2301 suşunda faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sisteminin gen kodunu içeren 90 kb büyüklükteki plazmid ile, bu suşun hücre duvarında yer alan antijenik özellikteki proteinlerin ilişkisini araştırdıkları çalışmada; söz konusu plazmidin varlığında, faj almaç bölgede lokalize olan 16 ve 20 kDa’ luk iki proteinin üretildiği ve 22 kDa’luk bir başka proteinin ise üretiminin engellendiği saptanmıştır. Araştırıcılar, 16 ve 20 kDa’ luk proteinlerin faj almaç bölgeyi maskeleyerek inaktive ettiğini, 22 kDa’ luk  proteinin ise faj tutunması için aktif merkez görevi gördüğünü ileri sürmüştür. Bu araştırmada; Oram (1971) tarafından bildirilen bulgulardan sonra, L. lactis suşlarında faj almaç bölgelerin protein doğasına dikkat çeken ilk araştırma olması bakımından da önem taşımaktadır. Laktokoklarda faj almaç bölgelerin protein yapıda materyaller tarafından maskelenmek suretiyle inaktive edildiklerine dair bir başka delil Akçelik and Tunail (1992) tarafından yürütülen araştırmada elde edilmiştir. Bu çalışmada Türkiye’ den izole edilen L. lactis subsp. lactis P25 suşunda, laktoz fermantasyon yeteneği ve 4 farklı faja karşı adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemini kodlayan, 37.5 kb büyüklükte bir plazmid tanımlanmıştır. Fajlara dirençli konjugal verici atasal suş, 37.5 kb büyüklükteki p2520L plazmidini içeren transkonjugantlar ve fajlara duyarlı konjugal alıcı suşun immünoblotting ile kombine edilmiş poliakrilamid jel analizleri; faj dirençli suşların, faj duyarlı suşlardan  yegane farkının, protein profillerinde saptanan 30 kDa’ luk protein bandı olduğunu göstermiştir. Bu bulgular ışığında araştırıcılar, 30 kDa’ luk proteinin faj almaç bölgeleri maskelemek suretiyle inaktive ettiğini ileri sürmüştür.

 

Harrington and Hill (1992), L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis DPC220 suşunda, ØD1 fajı ile enfeksiyon işleminden sonra oluşan spontan bir faj dirençli mutant (DPC 721) tanımlamış ve söz konusu mutantın atasal suşta bulunmayan 26.75 kb büyüklükte pHA90 plazmidini içerdiğini tesbit etmiştir. Restriksiyon endonukleaz enzim haritaları ve DNA hibridizasyon çalışmaları bu plazmidin, atasal suşta bulunan pHA82 (20.75 kb) ve pHA33 (6 kb) plazmidlerinin birleşmesi sonucu oluştuğunu göstermiştir. DNA sekans analizleri ile, pHA90 plazmidinin restriksiyon/modifikasyon ve faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte faj dirençlilik sistemlerinin gen kodunu taşıdığı belirlenmiştir. Araştırıcılar, bu plazmid üzerindeki faj dirençlilik genlerinin, ancak pHA33 plazmidi ile birleşme sonucu aktive olmasının; bir regülatör protein aracılığı ile meydana gelebileceğini ileri sürmüş, ancak bu öngörüyü destekleyen delilleri saptayamamıştır.

 

Lucey et al. (1992) L. lactis subsp. lactis UC503 suşunda izole ettikleri pCI528 plazmidinin (46 kb), hücre yüzeyinde değişim meydana getirmek suretiyle faj adsorbsiyon etkinliğini düşürme yönünde dirençlilik sağladığını belirlemiştir. pCI528 plazmidinin  L. lactis subsp. lactis UC503 suşundan, faj duyarlı suş L. lactis subsp. lactis MG1363’ e aktarımı sonucu; prolat ve küçük izometrik fajlara karşı tam dirençlilik fenotipinin oluştuğu saptanmıştır. Bu dirençlilik sisteminin farklı fajların adsorbsiyonunu aynı şekilde engellemesi, pCI528 tarafından üretilen maskeleyici materyalin belirli bir faj almaç bölgesine özel olmadığına işaret etmiştir. Dirençli ve duyarlı suşlar ile sürdürülen çalışmalarda, pCI528 plazmidini içeren kolonilerin agarlı besiyerinde oldukça sıkı koloni morfolojisi oluşturduğu gözlenmiş ve bu suş kültürleri santrifüj işlemine tabi tutulduğunda yumuşak (kolay çözülebilir) bir hücre çökeltisi oluşmuştur. Elektron mikroskopik incelemeler sonucunda da, söz konusu hücrelerin yüzeyinde düzensiz bir dağılım gösteren, ekstraselüler bir materyalin varlığı tesbit edilmiştir. pCI528 plazmidini içermeyen ve faj duyarlı olan hücreler ise, pürüzsüz ve düzenli bir hücre yüzeyi karakteristiğine sahip bulunmuştur. pCI528 plazmidini içeren L. lactis subsp. lactis UC503 hücrelerinin deterjanlar, asitler ve proteazlarla muamelesi sonucunda, faj dirençlilik fenotipinde herhangi bir değişim meydana gelmemiştir. Ancak, bu hücrelerin alkali muamelesi ile faj adsorbsiyonunu engelleme özelliklerini  yitirdiği saptanmıştır. Bu değişimin kimyasal doğasını belirlemek için, pCI528 plazmidini içeren atasal suşun alkali muamelesinden önce ve sonra izole edilen hücre duvarı örneklerinde polisakkarit içeriği, gaz-sıvı kromatografisi yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Sonuçta alkali (NaOH) muamelesinden sonra hücre duvarında galaktoz ve ramnoz oranının önemli ölçüde düştüğü belirlenmiştir. Aynı şekilde, faj duyarlı mutantların hücre duvarında da galaktoz ve ramnoz oranının belirgin bir şekilde düşük bulunması; L. lactis subsp. lactis UC503 suşunda faj almaç bölgenin galaktoz ve ramnoz polimerizasyonu ile oluşan bir materyal tarafından maskelendiğinin delili olarak kabul edilmiştir.

 

Daha önce de belirtildiği gibi, L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik özelliği gen kodu, kromozomal DNA üzerinde de bulunabilmektedir. Kromozomal DNA kökenli faj adsorbsiyonunun engellenmesi sistemlerinin moleküler doğasına ilişkin ilk önemli bulgular, Valyasevi et al. (1991) tarafından yapılan araştırmada ortaya konmuştur. Araştırıcılar L. lactis subsp. lactis C2 suşunda, c2 fajının hücre duvarından sonra membrana tutunmasının, gen kodu kromozomal DNA üzerinde bulunan bir protein tarafından engellendiğini belirlemiştir. Diğer yandan, bu suşun c2 fajına dirençlilik özelliğini sürdüren mutantlarında ise; faj adsorbsiyonunun her iki aşamada da  yüksek bir oranda meydana geldiği saptanmıştır. Söz konusu mutant suşlar ile doğal suşun hücre duvarı karbonhidrat bileşimi karşılaştırıldığında, tamamen aynı bulunmuştur. Doğal suşta nihai faj tutunmasını engelleyen ve mutantlarda aktif olmayan yapının protein doğası, hücrelerin proteinaz K ile muamelesi sonucu tanımlanmıştır. Proteinaz K uygulaması ile, doğal suşta c2 fajı adsorbsiyonu ve duyarlılık fenotipi meydana gelmiştir. Kısmi saflaştırması gerçekleştirilen bu protein, 32 kDa moleküler ağırlıkta bulunmuştur. Protein denatürasyonunun yapılmadığı elektroforez koşullarında, 32 kDa’ luk proteinin, 350 kDa büyüklükte bir membran kompleksinin bileşeni olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmayı esas alan bir diğer araştırmada, Geller et al. (1993) L. lactis subsp. lactis C2 suşu kromozomal DNA’ inden klonladıkları ve c2 faj DNA’ i enjeksiyonu için zorunlu proteini kodlayan pip genini, faj adsorbsiyonunun gerçekleştiği ancak halen faj dirençlilik özelliğini sürdüren mutantlara aktardıklarında; söz konusu mutantların duyarlı hale dönüştüğünü saptamıştır. Klonlanan genin DNA sekanslarından hareketle, protein ürününün yaklaşık 99.5 kDa ağırlıkta olduğu ileri sürülmüştür. Ayrıca söz konusu proteininin amino ucunda bir sinyal serisinin bulunduğu ve bu serinin membran üzerinde 4-6 adet arası potansiyel bağlanma bölgesi içerdiği öngörülmüştür. Ancak, L. lactis subsp. lactis C2 suşunda belirlenen ve faj adsorbsiyonunu engelleme görevi gören 32 kDa’ luk protein ile faj DNA enjeksiyonu için zorunlu 99.5 kDa’ luk “pip” proteini arasındaki ilişki bu çalışma kapsamında tanımlanamamıştır. Monteville et al. (1994) L. lactis subsp. lactis C2 suşunda, 7 farklı laktokok fajının geri dönüşebilir adsorbsiyonunun hücre duvarında bulunan ramnoz komponenti üzerinde gerçekleştiğini ispat ettikleri araştırmaları, Geller  (1993) tarafından elde edilen sonuçları anlaşılır hale getirmiştir. Bu araştırmada, söz edilen 7 fajın nihai ve geri dönüşsüz adsorbsiyonunun “pip” geni tarafından kodlanan membran proteini üzerinde meydana geldiği saptanmıştır. Pip geni içermeyen mutantlarda faj adsorbsiyonu hücre duvarında meydana gelirken, stoplazma membranında nihai adsorbsiyonunun ve dolayısı ile hücre içine faj DNA enjeksiyonunun gerçekleşememesi nedeni ile faj dirençlilik özelliği devam etmektedir. Zira faj DNA’inin hücre içine enjeksiyonu, ancak faj adsorbsiyonunun geri dönüşsüz olarak gerçekleştiği ikinci aşamadan (pip proteinine tutunma aşaması) sonra meydana gelebilmektedir. Doğal suşta ise, 32 kDa’ luk protein hücre membranında yer alan pip proteinini maskeleyerek geri dönüşsüz faj adsorbsiyonunu engellemektedir. Sadece 32 kDa’luk proteininin üretiminin engellendiği C2 mutantlarında, pip proteininin varlığı nedeniyle nihai adsorbsiyon ve faj DNA enjeksiyonu gerçekleşmekte ve faj duyarlı fenotip oluşmaktadır. L. lactis subsp. lactis C2 suşunda faj morfotiplerine göre, pip proteini etkinliğinin araştırıldığı çalışmada; bu membran proteininin prolat fajların enfeksiyonu için zorunlu olduğu, ancak küçük izometrik baş yapılı fajlara karşı bir etkinlik göstermediği saptanmıştır (Kraus and Geller 1998).

 

 

3. MATERYAL ve YÖNTEM

 

3.1. Materyal

 

3.1.1. Bakteriler ve fajlar

 

Araştırmada kullanılan L. lactis subsp. lactis MA83  suşu ile Øla2 ve Øld5 ve Ølc7  fajları, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Gıda Mikrobiyolojisi kültür kolleksiyonundan, Ø857 fajı ise Dr. Andrea-Budde Niekiel’ den (Wisby, Niebüll, Germany)  sağlanmıştır. Bakteriler, M17 (Terzaghi and Sandine, 1975) dik agarda +4 0C ve litmuslu süt ortamında –20 0C de saklanmıştır. Fajlar, M17 broth ortamlarına % 15 oranında steril gliserol ilave edilerek,  -4 0C de korunmuştur. Faj biyodenemeleri için sürekli kullanılan faj stokları ise aynı şekilde hazırlanmış, ancak +4 0C de tutulmuştur.

 

M17 Broth ve Agar

Polipepton                                       5        g

Fitopepton                                       5        g

Maya ekstraktı                           2.5     g

Et ekstraktı                                5        g

β- disodyum glisero fosfat                    19        g

Laktoz (% 10)                                     50     mL

MgSO4.7H2O (1 M)                              1     mL

Askorbik asit                                   0.5     g

Agar                                      15        g

Destile su                                       950     mL

pH 7.15 (Sterilizasyondan önce)

 

Ortam  içerikleri  950 mL destile su içerisinde çözülerek, agar ilavesinden önce pH 7.15’ e ayarlanmıştır. Sterilizasyon 121 0C de 15 dk süre ile yapılmıştır. Ortam soğutulduktan sonra (45 0C), ayrı sterilize edilen laktoz çözeltisi (50 mL) ilave edilmiştir (Terzaghi and Sandine 1975).

 

3.2. Yöntem

 

3.2.1. L. lactis subsp. lactis hücrelerine kimyasal uygulaması

 

30 0C’ de 18 saat süreyle geliştirilen bakteri kültürleri (15 mL), 1.5 mL’ lik hacimler halinde steril eppendorf tüplerine aktarılmış ve 5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilmiştir. Hücre çökeltileri üç kez steril destile su ile yıkandıktan sonra; farklı tüplere, 1.5 mL steril triton-X-100 (% 1), sodyum dodesil sülfat (SDS % 1), HCl (0.1 M), NaOH (0.05 M), α-amilaz (0.5 mg/mL), pronaz E (1.5 mg/mL), tripsin (1.5 mg/mL) ve proteinaz K (1.5 mg/mL) ilave edilmiştir. Kontrol tüplerdeki hücre çökeltisine, 1.5 mL steril destile su uygulanmıştır. Triton-X-100 ve sodyum dodesil sülfat uygulanan tüpler 45 0C’ de, sırasıyla 30 ve 45 dk, NaOH ve HCl uygulanan tüpler 21 0C’ de 30 dk, pronaz E, proteinaz K ve tripsin uygulanan tüpler 37 0C’ de 30 dk ve α-amilaz uygulanan tüpler 37 0C’ de 60 dk süreyle inkübasyona tabi tutulmuştur (Sijtsma et al. 1988). İnkübasyon işlemi bitiminde her bir tüp için, faj adsorbsiyon oranı tanımlanmıştır.

 

L. lactis subsp. lactis’ de faj adsorbsiyonunun farklı monosakkaritlere spesifik lektinler ile inhibisyonu; Vicia sativa, Banderiaea simplificolia ve Momordica charantia lektinlerinin (Sigma Chem. Co., USA) hücrelere denenmesi suretiyle saptanmıştır. İlk aşamada, hücrelerin lektinlerle aglutinasyon verip vermedikleri araştırılmıştır. 30 0C’ de 18 saat geliştirilen kültürler (10 mL), 5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilerek çöktürülmüş ve 1 mL β-gliserofosfat tampon (% 1.9 β-gliserofosfat, % 0.025 MgSO4, 10 mM kalsiyum-boro-glukonat, pH 6.8) içeresinde süspanse edilmiştir. Hücre süspansiyonlarına lektinler, 1 μg/mL olacak şekilde uygulandıktan sonra, 25 0C’ de 20 dk inkübasyona tabi tutulmuştur. Aglutinasyon, ışık mikroskobunda 1500X büyütmede gözlenmiştir (Sijtsma et al. 1998). Hücrelerin lektinlerle aglutinasyon karakteristikleri belirlendikten sonra, yukarıda anlatıldığı şekilde geliştirilip çöktürülen bakteri kültürleri, yine 1 mL β-gliserofosfat tampon içerisinde süspanse edilmiş ve 2.5 mg/mL olacak şekilde lektinler uygulanmıştır. 25 °C’ de 20 dk inkübasyondan sonra, hücreler 5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilerek çöktürülmüştür. (Valyasevi et al. 1994). Hücre çökeltisi, steril M17 broth’ ta 105 düzeyine kadar dilüe edilerek; Ømpl51, Ømpl86, Ølc961 ve Øld1083 fajlarına karşı adsorbsiyon oranlarındaki değişmeler araştırılmıştır (3.2.2.).

 

3.2.2. Faj adsorbsiyon oranının saptanması

 

30 0C’ de 18 saat süreyle geliştirilen bakteri kültürlerinden 0.7 mL alınarak, titreleri 105 pfu/mL düzeyine seyreltilen 0.75 mL faj süspansiyonu ve 37.5 μL CaCl2.6H2O (0.185 M) çözeltisi ile karıştırılmıştır. Bu karışımları içeren eppendorf tüpleri 30 0C su banyosunda 15 dk tutularak, adsorbsiyonun tamamlanması sağlanmıştır. Bu süre bitiminde tüpler, 5000 devir/dk hızda 3 dk santrifüj işlemine tabi tutulmuştur. Adsorbe olmayan fajları içeren üst sıvıdan 1 mL alınarak, 9 mL’ lik steril fizyolojik su içeren tüplerde seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Bu dilüsyonlar, fajların homolog konakçı suşlarına denenmek suretiyle faj adsorbsiyonundan sonraki titre saptanmıştır. % Faj adsorbsiyonu, aşağıdaki formül kullanılarak belirlenmiştir:

 

                (Başlangıç faj titresi – Adsorbsiyondan sonraki titre)

% Faj adsorbsiyonu =                                                                                           x 100

          Başlangıç faj titresi

 

(Luria et al. 1978, Lucey et al. 1992).

 

3.2.3. Tek aşama faj çoğalma testi

 

Latent dönem, artış dönemi ve patlama büyüklüğü gibi faj gelişme parametrelerinin belirlenmesinde, tek aşama faj çoğalma testi kullanılmıştır (Luria et al. 1978). Faj ve homolog konakçı suş 1/1 oranında ( 105 pfu/mL ve 105 cfu/mL) karıştırıldıktan sonra, 0.185 M CaCl2.6H2O muamele edilmiş ve karışım 30 0C’ de 15 dk tutulmuştur. Adsorbe olmayan fajların ortamdan elimine edilmesi için, tüpler 5000 devir/dk hızda 3 dk santrifüj işlemine tabi tutulmuş ve üst sıvı atılmıştır. Adsorbsiyon halindeki faj-bakteri çökeltisi, orijinal hacim kadar steril M17 broth içerisinde karıştırıldıktan sonra, 30 0C’ de inkübasyona devam edilmiştir. İnkübasyon süresince her bir tüpten 5 dk aralıklarla alınan örnekler filtre edilerek (0.4 μm por çapında; Sartourius, Germany), denenen fajların homolog konakçı suşları ile karşılaştırılmış ve çift tabaka M17 agar ortamlarında faj plak oluşumu gözlenmiştir. Çalışma süresince kontrol olarak, faj uygulanmayan bakteri kültürleri kullanılmıştır.

 

İlk faj partiküllerinin M17 çift tabaka agar ortamında görüldüğü süre, faj latent döneminin sonu olarak değerlendirilmiştir. Ancak populasyondaki bazı hücrelerde latent dönemin uzamasına bağlı olarak, bu süreden sonra da faj plak sayısında artış meydana gelmiştir. Latent dönemin sonundan, M17 çift tabaka agar ortamlarında faj plak sayısının sabitleşmesine kadar geçen süre de, artış dönemi olarak karakterize edilmiştir. Artış döneminde saptanan ortalama faj plak sayısının, latent dönemde saptanan ortalama faj plak sayısına bölünmesi suretiyle, faj patlama büyüklüğü tanımlanmıştır.

 

Faj plak etkinliği; fajların homolog konakçılarında belirlenen titrenin, test suşunda belirlenen titreye bölünmesi sonucu saptanmıştır.

 

Çift tabaka M17 agar ortamlarının hazırlanması: Faj denemelerinde, M17 alt tabaka agar ortamı, ayrı sterilize edilen 0.185 M CaCl2.6H2O çözeltisinden 10 mL/L ilave edilerek petrilere aktarılmış (15-20 mL) ve 22-25 0C’ de 18 saat  tutulmuştur. Üst tabaka ortamı, CaCl2.6H2O hariç, M17 alt tabaka içeriklerinin tümünün katılması ile hazırlanmıştır. % 0.45 oranında agar içeren üst tabaka, 3 mL’ lik porsiyonlar halinde ve alt tabaka gibi 121 0C’ de 15 dk sterilize edilmiştir (Terzaghi and Sandine 1975).

 

3.2.4. Faj titresinin belirlenmesi

 

Faj titresinin, plak oluşturma birimi/mL (pfu/mL) esasına göre saptanmasında M17 çift tabaka agar ortamları kullanılmıştır. İçerisinde 9 mL steril fizyolojik tuzlu su (% 0.85 NaCl) bulunan tüplere, aseptik koşullarda ve steril pipet aracılığı ile faj süspansiyonlarından 1 mL aktarılmış ve 10-8 düzeyine kadar seyrelti dizisi hazırlanmıştır. 3 saatlik M17 broth kültürlerinden, M17 yumuşak agar içine 0.1 mL ilave edilip, köpürmeyecek bir şekilde karıştırılmış ve petri kutusuna, homojen yayılmasına özen gösterilerek, dökülmüştür. Yumuşak agarın donması için 15 dk beklendikten sonra, cam yazar kalem ile çizilerek bölümlere ayrılan petri plaklarının herbir bölümüne, faj süspansiyonlarından ve hazırlanan faj seyreltilerinin herbirinden 10’ ar μL aktarılmıştır. 30 0C’ de 18 saat inkübe edilen petri kutularında, faj uygulama bölgelerindeki lize plakları (berrak plaklar) incelenerek faj titreleri belirlenmiştir (Şanlıbaba ve Akçelik 2000).

 

3.2.5. Doğal suşlardan plazmidlerin giderilmesi ve plazmidleri giderilmiş mutantların seçimi

 

L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda plazmid giderme ajanı olarak akriflavin (Sigma Chem. Co.,USA) kullanılmıştır. Öncelikle, 5 μg/mL – 50 μg/mL oranında akriflavin içeren bir dizi steril M17-glukoz broth ortamı hazırlanmıştır. Bu ortamları içeren herbir ardışık tüpte akriflavin oranı, 1μg/mL olacak şekilde arttırılmıştır. 30 0C’ de 12 saat süreyle geliştirilen aktif L. lactis subsp. lactis kültürlerinden, akriflavin içeren tüplere % 1 oranında inokülasyon yapılmış ve inkübasyona devam edilmiştir. İşlem beş kez tekrar edildikten sonra, bu ortamlardan hazırlanan seri dilüsyonlardan laktoz indikatör agar ortamlarına sürme ekim yapılmış ve 30 0C’ de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi bitiminde, ortamda gelişimleri sonucu indikatör boya rengini sarıya dönüştüren koloniler, laktoz fermentasyon yeteneğini sürdüren (Lac+), beyaz koloniler ise laktoz fermentasyon yeteneğini kaybetmiş (Lac-) koloniler olarak değerlendirilmiştir (McKay et al. 1972, McKay and Baldwin 1973, Wolfe and McKay 1983). Son aşamada plazmidleri giderilmiş mutant suşun tanımlanması, bu ortamda seçilen Lac+ ve Lac- kolonilere akriflavin uygulamasına devam edilerek gerçekleştirilmiştir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Laktoz İndikatör Agar

 

Tripton                                                            20      g

Jelatin                                                               2.5   g

Dekstroz                                                           2.5   g

Glukoz (% 1)                                                100   mL

NaCl                                                                  4      g

Sodyum asetat                                                              1.5   g

Askorbik asit                                                    0.5   g

Brom krezol purpur (% 0.004)                       10   mL

Agar                                                                15      g

Destile su                                                      880   mL

pH 6.8 (Sterilizasyondan önce)

 

880 mL destile su içerisinde ortam içerikleri çözülmüş ve pH 6.8’ e ayarlanmıştır. 121 0C’ de 15 dk sterilizasyon işleminden sonra, ayrı sterilize edilen laktoz ve brom krezol purpur ana besiyerine ilave edilmiştir. Besiyeri 45 0C’ ye kadar soğutulduktan sonra, 20 mL hacimler halinde petri kutularına dökülmüştür.

 

3.2.6. L. lactis subsp. lactis’de plazmid içeriklerinin tanımlanması

 

3.2.6.1. Plazmid izolasyonu

 

M17 broth besiyerinde 30 0C’ de 18 saat geliştirilen L. lactis subsp. lactis kültürlerinden, 1.44 g DL-treonin içeren 600 mL’ lik M17 broth besiyerine % 10 oranında inokülasyon yapılarak 30 0C’ de 3.5 saat inkübe edilmiştir (Gasson 1980). Bu süre sonunda kültürler, +4 0C’ de 7000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilerek çöktürülmüş ve hücre çökeltisi 30 mL sakkaroz tampon içerisinde süspanse edilmiştir. 37 0C’ de 5 dk tutulan ortama 7.5 mL lizozim aktarılarak, karıştırılmıştır. 37 0C’ de 5 dk daha bekletilen ortama 3.75 mL tris-EDTA-2 ve 2.25 mL sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi uygulanmış, elle çok yavaş bir şekilde çevrilerek ortamın karışması sağlanmıştır. Hücre parçalanmasının tamamlanması için santrifüj tüpleri 37 0C su banyosunda 10 dk süre ile tutulmuştur. Bu süre sonunda tüpler, mekanik karıştırıcıda yüksek devirde 30 saniye karıştırılarak kromozomal DNA’ in kırılması sağlanmıştır.  Ortama, yeni hazırlanmış 3 N NaOH çözeltisinden 2.40 mL ilave edilmiş ve tüpler düz bir yüzey üzerinde 10 dk çevrilerek kromozomal DNA’ in denatürasyonu gerçekleştirilmiştir. Denatürasyon aşamasının sonunda, ortama 3.90 mL tris-Cl (2M) çözeltisi aktarılarak 3 dk karıştırılmıştır. Tüplere; +4 0C’ de tutulan 5 M NaCl çözeltisinden 5 mL ve % 3 NaCl ile doyurulmuş fenol çözeltisinden 55.8 mL ilave edilerek, +4 0C’ de 7000 devir/dk hızda ve 10 dk süre ile santrifüj işlemi uygulanmıştır. Oluşan üst faz plastik Pasteur pipetleri (Sigma Chem. Co., USA) ile yeni tüplere aktarılmış ve deproteinasyonun sağlanması için kloroform/izoamil alkol (24:1) çözeltisinden 55.8 mL ilave edilmiştir. Tüpler +4 0C’ de 15000 devir/dk hızda 20 dk santrifüj edilerek üst faz alınmış ve eşdeğer hacimde izopropanol ile muamele edilmiştir. Ekstraktlar –20 0C’ de 1 gece bekletilmiş ve plazmid DNA, 15000 devir/dk hızda 20 dk santrifüj edilmek suretiyle çöktürülmüştür. Son aşamada sıvı faz akıtılarak DNA çökeltisi kurutulmuş ve 1 mL Tris-EDTA-1 içerisinde çözülmüştür. Yoğunluk gradienti uygulamasından önce, örneklere 100 μl RNaz A çözeltisi ilave edilerek 37 0C’ de 45 dk tutulmuştur (Anderson and McKay 1983).

 

Sakkaroz Tampon

 

Tris                               0.655      g

EDTA                           0.0372    g

Sakkaroz                      6.7          g

Destile su                 100          mL

pH 8.0

 

Lizozim Çözeltisi

 

Tris                             0.3            g

Lizozim                       0.1            g

Destile su                 10            mL

pH 8.0

Tris–EDTA–1

 

Tris                      0.60    g

EDTA                         9.31    g

Destile su                100       mL

pH 8.0

 

Tris–Cl

 

Tris – Cl               31.52  g

Destile su                  100     mL

pH 7.0

 
SDS Çözeltisi

 

Tris                      0.60    g

EDTA                         0.74    g

SDS                          20         g

Destile su                 100      mL

pH 8.0

 

Tris–EDTA–2

 

Tris                      0.121  g

EDTA                         0.037  g

Destile su                 100      mL

pH 7.5

 

RNaz A stok çözeltisinin hazırlanması : 5 mL destile su içerisinde hazırlanan 0.05 M sodyum asetat çözeltisinin pH’ sı, asetik asit ile 5.0 olacak şekilde ayarlanmış ve üzerine 10 mg RNaz A (Sigma Chem. Co., USA) ilave edilmiştir. Kaynar su içerisinde 5 dk tutulan RNaz A stok çözeltisi, -20 0C’ de saklanmıştır (Maniatis et al. 1986).

 

% 3 NaCl ile doyurulmuş fenol çözeltisinin hazırlanması : 100 g fenol üzerine 20 mL destile su ve 3 g NaCl aktarılarak, 45 0C’ ye ayarlı su banyosunda çözülmüştür. Ortama 0.1 g hidroksiguinolin ilave edildikten sonra, karıştırılarak oda sıcaklığında tutulmuştur.

 

3.2.6.2. Plazmidlerin saflaştırılması

 

Bakterilerden izole edilen plazmidlerin saflaştırılmasında, sezyum klörür – etidyum bromit yoğunluk gradienti yöntemi kullanılmıştır (Klaenhammer et al. 1978). 4 Farklı DNA örneği için; 52.64 g sezyum klörür, 46.52 mL tris–EDTA–1 içerisinde (3.2.6.1) çözülmüş ve üzerine 1 mL Na2HPO4 (0.2 M) ilave edilerek karıştırılmıştır. 4 Ultrasantrifüj tüpünün her birine 10 mg/mL konsantrasyondaki stok etidyum bromit çözeltisinden 225 μL, tris–EDTA–1 (3.2.6.1) içerisinde çözülen DNA örneklerinden 1 mL ve sezyum klörür çözeltisinden 10 mL aktarılmıştır. Kapatılan tüpler +10 0C’ de, 70000 devir/dk hızda 8 saat santrifüj edilmiştir. Bu işlem sonunda, ccc (kovalent bağlarla oluşmuş süper heliksel dönüşler içeren çevrimsel form) plazmid DNA bandı, ultraviyole ışık altında (Model UVL-56, Blackray Lamp, UV Product Inc., USA) steril şırıngalar aracılığı ile alınmıştır. Örnekler sezyum klörür ile doyurulmuş izoamil alkolde ekstrakte edilerek, ortamdaki etidyum bromid uzaklaştırılmıştır. Bu işlemin bitiminden sonra dializ tüplerine (Cellulose Membrane, D-9277, Sigma Chem. Co., USA) aktarılan örnekler, 2 L tris-EDTA-1 içerisinde 24 saat dializ edilmiştir. Son aşamada 11.5 mL ultrasantrifüj tüplerine aktarılan örnekler, +4 0C’ de 20000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj (Sorwall Combi Plus Ultracentrifuge, T-880 T4 pe Rotor, Dupont, USA) işlemi ile çöktürülmüş ve 100 μl tris-EDTA-1 içerisinde çözülmüştür. Örnekler –20 0C’ de saklanmıştır.

 

Dializ tüplerinin hazırlanması : Dializ membran şeritlerinden 20 cm uzunlukta kesilen parçalar, kaynar % 2 sodyum bikarbonat ve 1 mM EDTA çözeltisi (2L) içerisinde 10 dk tutulmuştur. Bu süre sonunda steril destile su ile yıkanan membranlar, 2 L EDTA (0.001 M) içerisinde 10 dk daha kaynatılmıştır. Ortam soğutulduktan sonra, dializ membranları aynı çözelti içerisinde ve +4 0C’ de saklanmıştır (Maniatis et al. 1986)

 

3.2.6.3. Agaroz jel elektroforezi

 

DNA örneklerinin elektroforezi % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde yapılmıştır (Meyers et al. 1976). Yatay ve dikey jel sistemleri için agaroz, 100 mL tris-fosfat elektroforez tamponu içerisinde, kaynar su banyosunda çözülmüştür. 45 0C’ ye kadar soğutulan ortam elektroforez plakalarına dökülmüş ve jel tarakları yerleştirilerek 60 dk beklenmiştir. Bu süre sonunda elektroforez tampon çözeltisi, tank içerisine jeli kapatacak düzeyde ilave edilmiş ve taraklar çıkarılmıştır. 37 0C’ de 45 dk inkübe edilen DNA örnekleri, su banyosundan alınarak 2 μl marker boya çözeltisi ile karıştırılmış ve mikro pipet aracılığı ile jel kuyucuklarına aktarılmıştır. Elektroforez, 100 voltta 3.5 saat süreyle yapılmıştır. Marker boyanın jel sistemleri terk etmesinden sonra elektrik akımı kesilmiş ve ortamdan alınan jeller, kullanılan elektroforez tamponunun, yeni hazırlanmış 0.2 μg/mL etidyum bromit içeren çözeltisinde 1 saat boyanmıştır. Boyama işlemi bitiminde jeller, 366 nm dalga boyunda ultraviyole ışıkta incelenmiş ve fotoğraflar siyah-beyaz film kullanılarak alınmıştır. Fotoğrafların çekiminde ultraviyole filtreden (Kodak # 15) yararlanılmıştır (Macrina et al. 1982).

 

Tris-Fosfat Tampon (10 x)

 

Tris                                         108         g

% 85 Fosforik asit (1.679 μg/mL)          15.5   mL

EDTA (0.5 M)                                    100      mL

pH 8.0

 
Marker Boya Çözeltisi

 

Bromfenol blue                            0.25  g

Sakkaroz                                                40       g

Destile su                                   100    mL

 

 

 

3.2.7. L. lactis subsp. lactis’ de hücre duvarı izolasyonu ve hücre duvarı proteinlerinin sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi ile tanımlanması

 

3.2.7.1. Hücre duvarı izolasyonu

 

30 0C’ de 18 saat geliştirilen L. lactis subsp. lactis kültürleri (1 L), 5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj işlemine tabi tutulmuş ve hücre çökeltileri, destile su ile 3 kez yıkanmıştır. 10 mL fosfat tampon içerisinde (10 mM fosforik asit, pH 6.8) süspanse edilen hücre çökeltilerini içeren tüpler buz banyosuna yerleştirilmiş ve vibrasyon % 100’ e ayarlanarak (Vibra Cell, Type VC70, USA) 3 vuruş olacak şekilde ultrasonikasyon uygulanmıştır. Parçalanan hücrelerin kaba kalıntıları, 3000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj işlemi ile ayrılmış ve üst sıvı plastik Pasteur pipetleri kullanılarak ultrasantrifüj tüplerine (Polyallomer, Sorwall Inst., Dupont, USA) aktarılmıştır. 30000 devir/dk hızda 20 dk santrifüj (Sorwall Combi Plus Ultracenrifuge, T-880 Type Rotor, Dupont, USA) işleminden sonra, 1 mL tris hidroklorit (50 mM, pH 7.5) ve 100 μl MgCl2 (0.1 M) karışımında süspanse edilen hücre duvarı ekstraktlarına, tüm hacimde 0.14 mg/mL olacak şekilde RNaz A (3.2.6.1) ve 0.10 μg/ml olacak şekilde DNaz I uygulanarak 37 0C’ de 30 dk inkübasyona tabi tutulmuştur. Son santrifüj aşamasının tekrarlanması ile, hücre duvarı ekstraktları elektroforez işlemi için hazır hale getirilmiştir (Schaffer et al. 1991).

 

DNaz I stok çözeltisinin hazırlanması : % 50 Gliserol, 20 mM sodyum asetat (pH 6.5), 5mM CaCl2 ve 0.1 mM fenilmetil sulfonil ilavesi ile hazırlanan tampon çözelti üzerine, 10 mg/mL olacak şekilde DNaz I (Sigma Chem. Co., USA) aktarılmıştır. Ortam karıştırılarak DNaz I’ in tamamen çözülmesi sağlandıktan sonra, filtre edilmiş (0.45 μm por çaplı membran filtre, Sartorius, Germany) ve stok çözelti –20 0C’ de saklanmıştır (Maniatis et al. 1986).

 

 

 

 

3.2.7.2. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)

 

SDS-PAGE deneyleri Laemmli (1970) tarafından önerilen yöntem kullanılarak yapılmıştır. Elektroforez plakaları % 70’ lik etanol çözeltisi ile yıkanıp kurulandıktan sonra 15mm eninde ayırıcılar konulmuş ve elektroforez tankına yerleştirilmiştir. Ayırıcı jel dökülmeden önce, plakaların ayırıcılarına % 1’ lik agaroz uygulanarak jelin akması engellenmiştir. Bu aşamadan sonra, jel tarağının 1 cm altına kadar gelecek şekilde ayırıcı jel dökülmüştür. Üzerine 1 mL destile su ilave edilen ayırıcı jelin polimerizasyonu için 45 dk beklenmiş ve su, filtreler aracılığı ile ortamdan alınmıştır. Plakanın geri kalan kısmı, toplayıcı jel dökülerek tamamlanmış ve tarak yerleştirilmiştir. Toplayıcı jelin polimerizasyonu için 45 dk daha beklendikten sonra tarak çıkarılmış ve elektroforez tankına elektrot tamponu ilave edilmiştir. 100 μl tris-SDS tampon içerisindeki hücre duvarı ekstraktlarına ½ oranında kaynatma çözeltisi muamele edilip, 100 0C’ de 5 dk su banyosunda tutularak denatüre edilen örnekler, jel kuyucuklarına 15 μl olacak şekilde uygulanmıştır. İlk yarım saatte jel sistemine 25 mA, kalan 4.5 saat süresince de 60 mA elektrik akımı verilmiştir. Elektroforez işlemi süresince elektrot tamponu 3 kez değiştirilmiştir. Bu süre sonunda Commasie brilliant blue çözeltisinde, 37 0C’ de 45 dk boyanan jel, fazla boyanın geri alındığı fiksasyon çözeltisinde yine 37 0C’ de 1 gece tutulmuştur (Özcan 1998). Beyaz ışık kaynağı üzerinde yerleştirilerek alınan jel fotoğraflarında proteinlerin moleküler büyüklükleri; 66, 45, 36, 29 ve 20 kDa’ luk proteinleri içeren marker karışımı kullanılarak saptanmıştır.

 

Ayırıcı Jel

 

Akrilamid                             12       mL

Tris (2M, pH 8.8)                  5.62  mL

SDS (% 10)                        300       mL

Destile su                             12.1    mL

 

Dökmeden hemen önce, 200 μL % 10 amonyum persülfat ve 20 μL tetrametil etilen diamin (TEMED) ilave edilmiştir.

Toplayıcı Jel

 

Akrilamid                                   1.8    mL

Tris (0.5 M, pH 6.8)                  3.65  mL

SDS (% 10)                           150        μL

Destile su                                  9.4    mL

 

Dökmeden hemen önce, 100 μL % 10 amonyum persülfat ve 10 μL TEMED ilave edilmiştir.

 

Tris-SDS Tampon

 

Tris                                              5.9     g

SDS                                             0.4     g

Destile su                                100     mL

pH 6.7

 

Akrilamid Çözeltisi

 

Akrilamid                                  30        g

Bis-akrilamid                              0.8     g

Destile su                                 100     mL

 

Çözeltinin hazırlandığı erlenmayer, alümünyum folyo ile kaplanarak +4 0C’ de tutulmuştur.

 

Elektrot Tamponu

 

Glisin                                      8        g

Tris                                       12.64   g

SDS                                        2        g

Destile su                              2        L

Kaynatma Çözeltisi

 

Tris-SDS tampon                  1     mL

SDS (% 25)                           0.8  mL

β-merkaptoetanol                  0.5  mL

Gliserol                                  1     mL

Brom fenol blue                     0.01   g

 

Commasie Brilliant Blue Boya Çözeltisi

 

Commasie brilliant blue        1.25   g

Metanol                             250     mL

Glasiyel asetik asit             50     mL

Destile su                           200     mL

 

Jel Fiksasyon Çözeltisi

 

Glasiyel asetik asit             70    mL

Metanol                               50    mL

Destile su                           880    mL

 

3.2.8. Hücre duvarı karbonhidrat analizi

 

L. lactis subsp. lactis atasal suşu ve faj adsorbsiyonunu engelleme özelliğini kaybetmiş mutantında hücre duvarı karbonhidrat bileşimindeki değişimler, Yüksek Performans Sıvı Kromotografisi (HPLC, Specra System, Thermo Separation Products, USA) analizleri yapılarak araştırılmıştır (Wallace 1980, Kennedy and Sutherland 1987). 30 0C’ de18 saat geliştirilen bakteri kültürleri, 5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj işlemi ile çöktürülmüş ve % 30 NaOH çözeltisinde, 100 0C’ de 3 saat muamele edilmiştir. Bu ekstraktlara, 1/1 oranında etanol uygulanarak hücre duvarı polimerleri çöktürülmüştür. İzole edilen materyal, 2 M HCl çözeltisinde, 100 0C’ de 3 saat tutularak hidrolize edilmiştir. Son aşamada HCl, vakum uygulanmak suretiyle ortamdan uzaklaştırılmıştır. Çift destile steril saf su içerisinde çözülen örneklerden HPLC kolonuna 20 μl enjeksiyonlar yapılarak, karbonhidrat içerikleri tanımlanmıştır.

 

HPLC analizlerinde; P4000 model pompa (maksimum basınç, 600 psi), SCM 1000 tip vakum degasser, RI-71 tip rekraktif endeks detektörü (Showa Denko, Japan), SN 4000 dijital analog konventer içeren SN 4000 tip interface card, IPX 486 DX4/100 MHz, 16 MB RAM, 540 MB HD, bilgisayar, PC 1000 software program, 7125 NS vakum pompası (KNF/No 26.1-2 AN 18, Germany), Asihipac NH2P-50 poliamid-bağlı polimerik jel kolonu (4.6x250 IDxL, mm çapında, 5μm partikül çapına uygun), maksimum 100 0C kolon fırını (Timberline Instrument Inc., USA), Ultrapure (HPLC grade) su sistemi (Barnstead/Thermolyne Corporation, USA) kullanılmıştır.

 

Analiz süresince, kolon sıcaklığı 55 0C ve solvent akış hızı 0.4 mL/dk olarak ayarlanmıştır.

 

 

 

 

                                  

 

 

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA

 

Akçelik et al. (2000) Lactococcus lactis MA83 suşunun; Türkiye’ nin farklı bölgelerinden sağlanan çiğ süt ve peynir altı suyu örneklerinden izole edilen 22 laktokok fajına karşı, faj adsorbsiyonun engellenmesi tipte dirençlilik sistemi içerdiğini, saptamıştır.

Çalışmamızın ilk aşamasında, L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda; ekzopolisakkarit yapının, bu suşun faj dirençlilik özelliği ile ilişkisi araştırılmıştır. L. lactis subsp. lactis  MA83 şuşunda ekzopolisakkarit kapsül yapısı, boyama yapılmaksızın lam-lamel arasında hazırlanan preparatların faz-kontrast mikroskopta (1500xbüyütme) incelenmesi sonucu saptanmıştır. Daha önceki çalışmalarda (Akçelik et al. 2000) Türkiye ve Avrupa kökenli bir çok dominant faja karşı direnç özelliği belirlenmiş olan MA83 suşu için; araştırmamızda faj duyarlılık testlerinde kullanılmak üzere, 3 adet Türkiye kökenli (fla2, fld5, flc7) ve 1 adet, Avrupa’da peynir işletmelerinde sorun yaratan laktokok fajı (f857) (Dr. A. Budde-Niekiel, Whisby, Niebüll/Germany) seçilmiştir. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda faj dirençliliğin, bu suşun ürettiği ekzopolisakkarit yapı ile ilişkisi, bu suş kültürlerinin  ayrı tüplerde ancak eş zamanlı olarak; SDS (%1), Triton X-100 (%1), HCl (0.1 M), NaOH (0.05 M), a-amilaz (0.5 mg/mL), Proteinaz K (1.5 mg/mL), Pronaz E (1.5 mg/mL) ve Tripsin (1.5 mg/mL) ile muamele edilmesinden sonra, her bir tüpteki MA83 kültürlerinin fla2, fld5, flc7 ve f857 fajları karşılaştırılması ve bu fajların adsorbsiyon oranlarının saptanması suretiyle tanımlanmıştır. Faj adsorbsiyon oranı (%) Lucey ve ark. (1982) tarafından önerilen yönteme göre belirlenmiştir. fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarının adsorbsiyonunun gerçekleşmediği MA83 suşunda; SDS, Triton X-100, HCl ve NaOH muamelesi sonucunda faj adsorbsiyonunun %94.0 - %98.8 gibi yüksek oranlarda meydana gelmesi, ekzopolisakkarit yapının faj almaç bölgelerini maskeleyerek, faj adsorbsiyonunu engellediğine işaret etmektedir. Diğer yandan Proteinaz K, Pronaz E ve Tripsin gibi proteolitik enzimlerin MA83 suşunun faj adsorbsiyon karakteristiklerinde herhangi bir değişime yol açmamıştır. a-amilaz uygulamasının ekzopolisakkarit yapı üzerinde etkili olmaması ve dolayısı ile MA83 suşunda faj adsorbsiyon karakteristiklerini değiştirmemesi, bu yapıda glikozidik bağların bulunmadığını göstermektedir (Çizelge 4.1). Tüm bu bulgular, alkali ya da asit muamelesinin hücre duvarına kovalent olmayan (zayıf) bağlarla tutunan ekzopolisakkarit yapıyı bakteri yüzeyinden elimine ettiğini ve L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun hücre duvarında bulunan faj almaç bölgeleri aktive ettiğini kanıtlamaktadır. Laktokoklarda faj almaç bölgelerin tanımlanmasını esas alan birçok araştırmada, söz konusu bölgelerin protein ya da  karbonhidrat polimerleri olduğu saptanmıştır (Schaffer et al. 1991, Hill 1993, Sandberg et al. 1994, Dinsmore and Klaenhammer 1995). Detaylı kimyasal analizler, bu bölgelerdeki karbonhidratların genellikle glukoz, galaktoz ve ramnoz monomerlerinin ayrı ayrı ya da glukoz/galaktoz, glukoz/ramnoz ve ramnoz/galaktoz halinde polimerizasyonu sonunda oluştuğunu kanıtlamıştır (Lucey et al. 1992, Valyasevi et al. 1994,  Dinsmore and Klaenhammer 1995, Allison and Klaenhammer 1998).

Almaç bölgenin maskelendiği koşullarda, hücre duvarı ekstraktlarında tüm fajların adsorbsiyonunun geri dönüşsüz bir şekilde meydana gelmesi, MA83 suşunda faj almaç bölgenin hücre duvarında yer aldığını kanıtlamaktadır. Zira, bazı laktokok suşlarında hücre duvarı ekstraktlarında meydana gelen faj adsorbsiyonunun, santrifüj işlemi uygulandığında fajların almaç bölgeden ayrılması ile sonuçlandığı saptanmıştır. Bu suşlarda faj adsorbsiyonunun ilk aşaması (geri dönüşebilir adsorbsiyon) hücre duvarındaki almaç bölgelerde gerçekleşirken, faj enfeksiyonunun başlangıcı olarak nitelendirilen geri dönüşsüz adsorbsiyon, fajların bir stoplazma membran proteini ile ilişkilenmesi sonucu meydana gelmektedir (Klaenhammer 1984, Lodics and Steenson 1993, Akçelik 1994, Monteville et al. 1994, Garbutt et al. 1997 Allison and Klaenhammer 1998). Ancak MA83 suşunda, fla2, fld5, flc7 ve f857  fajlarının geri dönüşsüz adsorbsiyonu için herhangi bir stoplazma membran yapısına gereksinim duyulmamaktadır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Çizelge 4.1. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda fajların adsorbsiyonu üzerine kimyasalların etkisi

Uygulanan Kimyasal

Suş Kod No.

Faj Adsorbsiyonu (%)

fla2

fld5

flc7

f857*

Kontrol**

MA83

-

-

-

-

SDS (%1)

94.4

98.0

98.4

94.6

Triton X-100 (%1)

96.0

97.6

98.8

95.2

HCl (0.1 M)

96.2

98.2

98.2

94.0

NaOH (0.05 M)

96.2

98.0

98.4

94.4

a-Amilaz (0.5 mg/mL)

-

-

-

-

Proteinaz K (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

Pronaz E (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

Tripsin (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

 

*   Kontrol litik faj (Whisby, Niebüll/Germany)

** Hiçbir kimyasal muameleye tabi tutulmamıştır


L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun hücre duvarında yer alan faj almaç bölgelerinin kimyasal doğasının saptanması için, yukarıda söz edilen kimyasallar; bu kez MA83 suşunun akriflavin muamele edildikten sonra seçilen, ekzopolisakkarit yapı oluşturma yeteneğini kaybetmiş mutantına (L. lactis subsp. lactis MA83-28) karşı denenmiştir. Ekzopolisakkarit yapı oluşturma yeteneğini kaybetmiş mutant, doğal suşa 50 mg/mL akriflavin (Sigma Chem. Co., USA) uygulamasından sonra, laktoz indikatör agar (McKay vd. 1972) ortamında seçilmiş ve daha önce söz edildiği şekilde hazırlanan bakteri preparatlarının faz-kontrast mikroskopta incelenmesi suretiyle tanımlanmıştır. Mutant suş MA83-28’de faj adsorbsiyonu; fla2 için %98.6, fld5 için %98.2, flc7 için %96.6 ve f857 için %99.4 oranlarında meydana gelmiştir ve bu mutanta SDS, Triton X-100, HCl, NaOH ve a-amilaz uygulaması söz konusu adsorbsiyon oranlarında herhangi bir değişime yol açmamıştır (Çizelge 4.2). Kontrol deneme ile kimyasal uygulamalar arasında saptanan %1’in altındaki faj adsorbsiyon farklılıkları deneysel hassasiyetten kaynaklanmaktadır. Diğer yandan, Proteinaz K, Tripsin ve Pronaz E uygulaması sonucunda mutant suş MA83-28’de -tıpkı doğal suş MA83’de olduğu gibi – hiç bir fajın adsorbsiyonu meydana gelmemiştir (Çizelge 2). Bu sonuçlar, L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda, denemeye alınan fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarının almaç bölgelerinin hücre duvarında bulunduğunun ve protein yapıda olduğunun güçlü kanıtlarıdır. Aynı denemenin ekzopolisakkarit yapı oluşturmayan ve faj almaç bölge materyali protein olan kontrol suş L. lactis subsp. lactis 965 (Dr. A. Budde-Niekiel, Whisby, Niebüll/Germany) ile tekrarlandığında, MA83-28 mutant suş ile benzer sonuçların alınması da (Çizelge 4.3) bu bulguları doğrulamaktadır.

L. lactis subsp. lactis MA83 doğal suşunda alkali muamelesinden sonra tüm fajların adsorbsiyonunun meydana gelmesi (Çizelge 4.1) ve MA83-28 mutantında ise, proteolitik enzim uygulaması ile tüm fajların adsorbsiyonunun tamamen engellenmesi (Çizelge 4.2), bu suşta söz konusu fajlar için tek bir almaç bölgenin bulunduğunu kanıtlamaktadır. Bu bulgu, bazı laktokok suşlarında birden fazla faj için tek bir almaç bölgenin bulunduğuna yönelik literatür verilerini (Valyasevi et al. 1994, Neve 1996, Kraus and Geller 1998) desteklemektedir.

 

 

 

Çizelge 4.2 L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ekzopolisakkarit üretmeyen mutantında (MA83-28) fajların adsorbsiyonu üzerine kimyasalların etkisi

Uygulanan Kimyasal

Suş Kod No.

Faj Adsorbsiyonu (%)

fla2

fld5

flc7

f857

Kontrol*

MA83-28

98.6

98.2

96.6

99.4

SDS (%1)

98.2

97.8

96.4

99.4

Triton X-100 (%1)

98.2

97.8

96.6

99.4

HCl (0.1 M)

98.0

98.2

96.2

99.2

NaOH (0.05 M)

98.4

98.0

96.6

98.8

a-Amilaz (0.5 mg/mL)

98.0

98.2

96.0

99.0

Proteinaz K (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

Pronaz E (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

Tripsin (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

 

* Hiçbir kimyasal muameleye tabi tutulmamıştır


Çizelge 4.3. Ekzopolisakkarit üretmeyen ve faj almaç bölge materyali proteinden oluşan kontrol suş L. lactis subsp. lactis 965’de (Whisby, Niebüll/Germany) faj adsorbsiyonu üzerine kimyasalların etkisi

Uygulanan Kimyasal

Suş Kod No.

Faj Adsorbsiyonu (%)

fla2

fld5

flc7

f857

Kontrol*

965

98.2

96.0

92.4

94.6

SDS (%1)

98.2

96.0

90.8

94.2

Triton X-100 (%1)

98.2

95.6

91.6

94.6

HCl (0.1 M)

97.6

95.8

90.6

94.6

NaOH (0.05 M)

98.0

96.0

92.4

94.6

a-Amilaz (0.5 mg/mL)

98.0

96.2

92.0

94.4

Proteinaz K (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

Pronaz E (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

Tripsin (1.5 mg/mL)

-

-

-

-

 

* Hiçbir kimyasal muameleye tabi tutulmamıştır


L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda ekzopolisakkarit yapının biyokimyasal doğasının ön belirlenmesi amacı ile lektin aktivasyon testleri yapılmıştır. Bu amaç doğrultusunda MA83 suşu; terminal b-D-galaktozil (Momordica charantia, MCA), N-asetilglukozamin (Bandeiraea simplificolia, BS-I) ile glukozil ve mannozil (Vicia sativa, VCA) kalıntılarına spesifik lektinlerle muamele edilmiş ve aglutinasyon özellikleri belirlenmiştir. Test sonucunda yalnız Momordica charantia lektini ile aglutinasyon meydana gelmiştir (Çizelge 4.4). Bu bulgu, L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun oluşturduğu ekzopolisakkarit yapının bir galaktoz polimeri olduğuna işaret etmektedir.  L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda, bazı literatür verilerinin aksine (Dinsmore and Klaenhammer 1995, Daly et al. 1996), galaktoz faj almaç bölgenin oluşturulmasında değil faj adsorbsiyonunun engellenmesinde rol almaktadır. Bu açıdan söz konusu suş laktokoklarda faj dirençlilik araştırmalarına yeni bir boyut katma potansiyeli taşımaktadır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Çizelge 4.4. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun monosakkaritlere spesifik lektinlerle aglutinasyonu

Lektinler

Suş Kod No.

Aglutinasyon

Kontrol

MA83

-

BS-I

-

MCA

+

VSA

-

 

BS-I     : Bandeiraea simplificolia

MCA   : Momordica charantia

VSA    : Vicia sativa

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda ekzopolisakkarit yapının ve faj reseptör materyalinin yüksek basınç sıvı kromotografisi (HPLC) ve sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi yöntemleri ile kesin tanısı yapılmıştır. Klasik testler sonucunda L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği ekzopolisakkarit materyalin % 49.9 oranında karbonhidrat ve  % 9.3 oranında fosfat içerdiği saptanmıştır (Çizelge 4.5).  Ekzopolisakkarit yapının ana materyali olan karbonhidratların oluştuğu alt ünitelerin tanısında ise HPLC yöntemi kullanılmıştır (Wallace 1980, Kennedy and Sutherland 1987). HPLC analizleri sonucunda ekzopolisakkarit yapının ana bileşen galaktoz yanında galaktozamin ve ramnoz içerdiği de saptanmıştır (Çizelge 4.6).

 faj reseptör proteinin tanısı amacı ile; bu suşun ekzopolisakkarit üretme yeteneği giderilmiş faj duyarlı mutantı MA83-28 ve bu mutantın 40°C ısı uygulaması sonucu (48 saat) seçilen faj dirençli türevinin (MA83-28-T) hücre duvarı protein profilleri karşılaştırılmıştır. Suşlarda hücre duvarı izolasyonunda Schaffer et al. (1991) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. Hücre duvarı protein analizlerinde ise SDS-PAGE (Laemmli 1970) sisteminden yararlanılmıştır. SDS-PAGE analizleri sonucunda L. lactis subsp. lactis MA83-28 mutantında büyüklükleri 16.3 kDa ile 102.7 kDa arasında değişen 28 adet proteinin varlığı belirlenmiştir. Bu suşun faj dirençli türevinde ise  (MA83-28-T) sadece 102.7 kDa büyüklükteki protein kaybolmuştur (Şekil 4.1). Bu sonuçlar L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda faj almaç bölgeyi oluşturan yapının 102.7 kDa büyüklükteki protein olduğunu kanıtlamaktadır.

 


 

 

 

Çizelge 4.5. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği ekzopolisakkarit yapının kimyasal bileşimi

 

 

Bileşik

L. lactis subsp. lactis MA83

Miktar

(mg/100mg kuru hücre için)

Ekstrakte Edilen Toplam Ekzopolisakkarit (%)

Toplam Ekzopolisakkarit

6.95

100

Karbonhidrat

3.72

49.9

Fosfat

0.70

9.3

Protein

-

-

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Çizelge 4.6. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği ekzopolisakkarit materyalin monosakkarit bileşimi

 

 

Monosakkarit

L. lactis subsp. lactis MA83

Miktar

(mg/100mg kuru hücre için)

Molar Oran

Galaktoz 

284.4

3.3

Galaktozamin

157.3

1.8

Ramnoz

62.1

0.7

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.1. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ekzopolisakkarit üretme yeteneğini kaybetmiş (Eps-), faj duyarlı (fs) mutant suşu (MA83-28) ve bu suşun faj dirençli (fr) türevinin (MA83-28-T) protein içerikleri

1

Protein Marker

 

2

MA83-28

(Eps- fs)

2

MA83-28-T

(Eps- fr)

kDa

kDa

kDa

200.0

102.7

97.4

116.2

97.4

93.8

97.4

93.8

88.3

66.2

88.3

80.9

45.0

80.9

73.5

31.0

73.5

71.8

21.5

71.8

69.1

 

69.1

66.2

 

66.2

65.5

 

65.5

61.7

 

61.7

55.9

 

55.9

53.9

 

53.9

50.2

 

50.2

46.5

 

46.5

43.4

 

43.4

39.6

 

39.6

37.8

 

37.8

35.5

 

35.5

33.2

 

33.2

30.5

 

30.5

29.4

 

29.4

27.1

 

27.1

25.9

 

25.9

24.8

 

24.8

23.6

 

23.6

18.7

 

18.7

16.3

 

16.3

 

 

HPLC sonuçları da, lektin testlerinde olduğu gibi, L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği ekzopolisakkaritin ana bileşeninin  galaktoz olduğunu doğrulamaktadır. Galaktoza ilave olarak, ekzopolisakkarit yapısında galaktozamin ve ramnoz da düşük miktarda saptanmıştır. Ancak bu şekerlerin hücre duvarı kontaminantları olma olasılığı yüksektir. Laktokokların faj almaç bölgelerinde lökalize olan karbonhidratların, asit ve alkali muamelesine yüksek düzeyde hassasiyet gösterdiği, değişik araştırıcılar tarafından belirlenmiştir (Sijtsma et al. 1990a, Klaenhammer and Fitzgerald 1994, Daly et al. 1996, Şanlıbaba et al. 1999). Ancak, laktokokların ürettiği ekzopolisakkaritlere yönelik kromotografik analizlere ait az sayıda literatür verisi bulunmaktadır (Sijtsma et al. 1988, Valyasevi et al. 1991). Araştırmada elde edilen HPLC analiz verileri, bu açıdan da önem taşımaktadır

Bakterilerde faj adsorbsiyonun, karbonhidrat-protein interaksiyonlarına bağlı inhibisyonu ilk kez Goldstein et al. (1965) tarafından tanımlanmıştır. Genellikle laktokoklarda faj almaç bölgeler ve faj almaç bölgeleri maskeleyen materyallerin tanısı, bağımsız araştırmalarda ve farklı suşlarda yürütülmüş olduğu için, bu interaksiyonu kanıtlayan çok az sayıda araştırma bulunmaktadır (Lodics and Steenson 1993, Monteville et al. 1994, Allison and Klaenhammer 1998). Özellikle Bacillus türlerinde tanımlanan söz konusu interaksiyon, bu araştırma kapsamında L. lactis subsp. lactis MA83 suşu için, kesin delillerle tanımlanmıştır. Bu interaksiyonların kimyasal doğasının detaylı analizler sonucu belirlenmesi; özellikle faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemi içeren endüstriyel starter suş geliştirme çalışmalarına, yeni bir ufuk ve ivme kazandıracaktır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda ekzopolisakkarit yapının genetik  determinantlarının araştırılmasında , ekzopolisakkarirt üretme yeteneğini kaybetmiş mutantların, ekzopolisakkarit üretme yeteneğine sahip doğal suş ile arasındaki plazmid içeriği farklılıkları esas alınmıştır.

Çalışmada mutajen ajan olarak akriflavin kullanılmıştır. Akriflavin uygulamasından sonra, laktoz indikatör agar ortamında tanımlanan laktoz fermentasyon özelliğini sürdüren (Lac+) ve laktoz fermentasyon özelliğini kaybetmiş (Lac-) mutantların faj duyarlılıkları; Akçelik et al. (2000) tarafından kullanılan materyalden seçilen fla2, fld5, flc7 ve Dr. Andrea-Budde Niekiel’ den (Wisby, Niebüll, Germany) sağlanan f857 fajlarına denenmek suretiyle saptanmıştır. Faj duyarlı mutant suşların tümünde ekzopolisakkarit üretim özelliğinin ve laktoz fermenrasyon yeteneğinin eş zamanlı bir şekilde kaybolduğu belirlenmiştir. Mutant suşlarla yürütülen faj duyarlılık testleri ve plazmid analizleri; L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik fenotipinin ( dolayısı ile ekzopolisakkarit üretiminin ve laktoz fermentasyon yeteneğinin), 32.7 kb plazmidin giderilmesine bağlı olarak, stabil bir şekilde etkinliğini kaybettiğini göstermiştir. Diğer yandan sadece bu plazmidi içeren mutantlarda bile ekzopolisakkarit üretiminin, laktoz fermentasyonun ve faj dirençlilik özelliklerin sürdürülmesi, bu özelliklerin 32.7 kb plazmid tarafından kodlandığına işaret etmektedir (Şekil 4.2). Bu güne kadar değişik laktokok suşları ile yürütülen araştırmalarda; bu bakterilerin içerdiği bazı laktoz plazmidlerinin, ekzopolisakkarit üretimi ile ilişkili olduğu belirlenmiş ancak , ekzopolisakkarit üretimi ile faj dirençlilik arasında bir ilişki tanımlanmamıştır (Sanders 1988, Daly et al. 1996, Fitzgerald et al. 1996, Kok 1996, Leewacharamas et al. 1997, Moineau et al. 1997, Yi-Mo et al. 1999, Tükel ve Akçelik 2000).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.2.         L. lactis subsp. lactis MA83 suşu ve mutantlarında plazmid

                        içerikleri

 

1 (MA83-36, Lac+, Ør , Eps+): 32.7 kb

2 (MA83-80, Lac+, Ør , Eps+): 32.7 kb

3(MA83-28, Lac-,  Øs ,  Eps-): Tüm plazmidleri giderilmiş 

4(MA83, Doğal suş, Lac+, Ør, Eps+): 44.3, 32.7, 19.6, 16.2, 10.4, 9.1, 4.0 kb

5(MA83-13, Lac+, Ør , Eps+): 32.7 kb

6(MA83-78, Lac+, Ør , Eps+): 32.7 kb

 

  Lac+: Laktoz fermentasyonu yeteneğ

  Lac- : Laktoz fermentasyonu yeteneğini kaybetmiş

  ØS    : Faj duyarlı

  Ør    : Faj dirençli

   kb   : Kilobaz

 

Araştırmada, ekzopolisakkarit üretim özelliğinin, adsorbsiyonun engellenmesi gibi güçlü bir faj dirençlilik sistemine yol açtığının tanımlanması ve bu materyalin ana bileşeninin belirlenmesi, starter kültür suşlarının geliştirilmesini esas alan endüstriyel çalışmalara büyük katkılar yapacaktır. Diğer yandan bu özelliklerin konjugal hareketliliğe sahip ve laktokok suşlarında oldukça stabil olan laktoz plazmidlerin üzerinde taşınıyor olması da, genetik manupilasyonlara kolaylık sağlaması açısından, kritik önem taşımaktadır.

 

KAYNAKLAR

 

 

Akçelik, M. and  Tunail, N. 1992. A 30 kd cell wall protein produced by plasmid DNA which encodes inhibition of phage adsorption in Lactococcus lactis subsp.  lactis P25. Milchwissenschaft, 47; 215-217.

Akçelik, M. 1994. Adsorption and growth characteristics of some lactic phages. Doğa (Tr. J. of Biology), 18; 155-160.

Akçelik, M. 1998. A phage DNA injection-blocking type resistance mechanism encoded by chromosomal DNA in Lactococcus lactis  subsp. lactis. Milchwissenschaft, 53; 619-622.

Akçelik, M. 1999. The conjugal plasmid pLL10236 encodes lactose fermentation ability, restriction/modification activity, bacteriocin production and immunity in Lactococcus lactis subsp. lactis LL102. Food Microbiology, 16; 487-494.

Akçelik, M., Şanlıbaba, P. and Tükel, Ç. 2000. Phage resistance in L. lactis subsp. lactis isolated from tradional fermented milk products in turkey. Int. J. Food Sci. Technol., In Press.

Allison, G.E.and Klaenhammer, T.R. 1998. Phages resistance mechanisms in lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 8; 207-226.

Anderson, D.G. and Mc Kay, L.L. 1983. A simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci. Appl. Environ. Microbiol., 46; 549-552.

Babu, K.S., Spence, W.S., Monteville, M.R. and Geller, B.R. 1995. Characterization of a cloned gene (pip) from Lactococcus lactis required for phage infection. In: Genetics of Streptococci, Enterococci and Lactococci (J.J. Ferretti, M.S. Gilmore, T.R. Klaenhammer and F. Brown, Eds), p. 569-575, Basel, Switzerland.

Boumerdassi, H., Monnet, C., Desmazeaud, M. and Corrieu, G. 1997. Isolation and properties of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis CNRZ 483 mutants producing diacetyl and acetoin from glucose. Appl. Environ. Microbiol., 63; 2293-2299.

Chopin, A., Chopin, M.C., Batt, G.M. and Langella, P. 1984. Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid, 11; 260-263.

Cluzel, P.J., Chopin, A., Ehrlich, S.D. and Chopin, M.C. 1991. Phage abortive infection mechanism from Lactococcus lactis subsp. lactis, expression of which is mediated by an ISO ISS 1 element. Appl. Environ. Microbiol., 57; 3547-3551.

Daly, C., Fitzgerald, G.F. And Davis, R. 1996. Biotechnology of lactic acid bacteria   

           with special reference to bacteriophage resistance. Antonie Van Leeuwenhoek,

           70; 99-110.

de Vos, W.M., Underwood, H.M. and Davıes, F.L. 1984. Plasmid encoded bacteriophage resistance in Streptococcus cremoris SK11. FEMS Microbiol. Lett. 23, 175-178.

de Vos, W.M. 1989. On the carrier state of bacteriophages in starter lactococci. Neth. Milk Dairy J., 43; 221-228.

Dinsmore, P.K. and Klaenhammer, T.R. 1995. Bacteriophage resistance in Lactococcus. Molecular Biotechnology, 4; 297-314.

Dunny, G.M., Krug, D.A., Pan, C.L. and Ledford, R.A.  1988. Identification of cell wall antigens associated with a large conjugative plasmid encoding phage resistance and lactose fermentation ability in lactic streptococci. Biochemie, 70; 443-450.

Erlandson, K. and Batt, C. 1997. Strain-specific differentiation of lactococci in mixed starter culture population using randomly amplified polymorphic DNA-derived probes. Appl. Environ. Microbiol., 63; 2702-2707.

Fitzgerald, G.F., Daly, C., Brown, L.R. and Gingeras, T.R. 1982. ScrF1: A new sequence spesific endonuclease from Streptococcus cremoris. Nucleic Acid Research, 10; 8171-8178.

Fitzgerald, G.F., Hill, C. and Garvey, P.1996. Restriction modification systems in Lactococcus lactis. Gene, 157; 13-18.

Garbutt, K.C., Kraus, J. and Geller, B.L. 1997. Bacteriophage resistance in Lactococcus lactis engineered by replacement of a gene for a bacteriophage receptor. J. Dairy Sci, 80; 1512-1519.

Garvey,P., Fitzgerald, G.F. and Hill, C. 1995. Cloning and DNA sequence analysis of two abortive infection phage resistance determinants for the lactococcal plasmid pNP40. Appl. Environ. Microbiol., 61; 4321-4328.

Garvey, P., Hill,C. and Fıtzgerald, G.F. 1996. The lactococcal plasmid pNP40 encodes a third bacteriophage resistance mechanism, one which affect phage DNA penetration. Appl. Environ. Microbiol., 62; 676-679.

Gasson, M. 1980. Production, regeneration and fusion of Protoplasts in lactic streptococci. Appl. Environ. Microbiol., 40; 964-966.

Geller, B.L., Ivey, R.G., Trempy, T.E. and Hettinger-Smith, B. 1993. Cloning of a chromosomal gene required for phage infection of Lactococcus lactis subsp. lactis C2. J. Bacteriol., 175, 5510-5519.

Goldstein, I.J., Hollerman, C.E. and Smith, E.E. 1965. Protein-carbohydrate ınteraction II. inhibition studies on the interaction of concanavalin A with polysaccharides. Biochemistry, 4: 876-883.

Gopal, P.K. and Crow, V.L. 1993. Characterization of loosely associated material from the cell surface of Lactococcus lactis subsp. cremoris E8 and its phage resistant variant  strain 398. Appl. Environ. Microbiol., 59; 3177-3182

Harrington, A. and Hill, C. 1992. Plasmid involvement in the formation of a spontaneous bacteriophage insensitive mutant of Lactococcus lactis. FEMS. Microbiol. Lett., 96; 135-142.

Hill, C. 1993. Bacteriophage in dairy starter culture technology. Food Technology, 38; 41-50.

Holt, G.H., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T. and Williams, S.T. 1994. Bergey’ s manual of determinative bacteriology. Williams and Wilkins Co., Ninth Edition, 787 p.

Kennedy, F,D. and Sutherland, I,W. 1987. Analysis of bacterial exopolysacchorides. Biotechnol. Appl. Biochem., 9: 12-19.

King, W.R., Collins, E.B. and Barrett, E.L. 1983. Frequencies of bacteriophage-resistant and slow acid-producing variants of Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol, 45; 1481-1485.

Klaenhammer, T.R., McKay, L.L. and Baldwin, K.A. 1978. Improved Lysis of Group N streptococci for isolation and rapid characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. Appl. Environ. Microbiol., 35; 592-600.

Klaenhammer, T.R. 1984. Interactions of bacteriophages with lactic streptococci. Adv. Appl. Microbiol., 30; 1-29.

Klaenhammer, T.R. and Fitzgerald, G.F. 1994. Bacteriophage and bacteriophage resistance. In: genetics and biotechnology of lactic acid bacteria (M.J. Gasson, W.M. de Vos, Eds), Blackie Acad. Press., Glaskow, pp; 106-168.

Klaenhammer, T.R. and Dinsmore, P.K. 1995. Phenotypic consequences of altering the copy number of abi A, infection in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 60; 1129-1136.

Klaenhammer, T.R. and Dinsmore, P.K. 1997. Moleculer characterization of a genomic region in a Lactococcus bacteriophage that is involved in its sensitivty to the phage defense mechanism Abi A. J. Bacteriol., 63; 2949-2957.

Kok, J. 1996. Inducible gene expression and environmentally genes in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek, 70; 129-145.

Kraus, J. and Geller, B.L. 1998. Membrane receptor for prolate phages is not required for infection of Lactococcus lactis by small or large isometric phages. J. Dairy Sci., 81; 2329-2335.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685.

Leewacharamas, V., Chia, L.G., Charoenchai, P., Kunajakr, N., Liu, C. and Dunn, N.W. 1997. Plasmid-encoded copper resistance in Lactococcus lactis. Biotechnology Letters, 19; 639-643.

Lodics, T.A. and Steenson, L.R. 1993. Phage-host interactions in commerical mixed dairy starter cultures: practical significance-a rewiev. J. Dairy Sci., 76; 2380-2391.

Lucey, M., Daly, C. and Fitzgerald, G.F. 1992. Cell surface characteristics of Lactococcus lactis harbouring pCI528, a 46 kb plasmid encoding inhibition of bacteriophage adsorption. J. Gen. Microbiol., 138; 2137-2143.

Luria, S.E., Darnel, Y.E. and Campbell, A. 1978. General virology. Joh Wiley and Sons, New York, 578p.

Macrina, F.L., Kopecko, D.J, Jones, K.R., Evans, R.P. and Clewell, D.B. 1982. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sangius. Gene, 19;345-353.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. 1986. Molecular cloning. a laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory (CSH), New York. 455p.

Mayo, B., Hardisson, C. and Brana, A.F. 1991. Nucleolytic activities in Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 497. FEMS Microbiol. Rev., 52; 812-818.

McKay, L.L., Baldwin, K.A. and Zottola, E.A. 1972. Loss of lactose metabolism in lactic streptococci. Appl. Microbiol, 23; 1090-1096.

McKay, L.L. and Baldwin, K.A. 1973. Induction of prophage in Streptococcus lactis C2 ultraviolet irradiation. Appl. Microbiol., 25; 682-684.

McLandsborough, L.A., Sechaud, L. and McKay, L.L. 1998. Synergistic effect of Abi E or Abi F from pNP40 when cloned in combination with Abi D from pBF61. J. Dairy Sci., 81; 362-368.

Meyers, J.A. Sanches, D., Elwell, L.P. and Falkow, S. 1976. Simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol., 127; 1529-1537.

Moineau, S., Kondo, J.K., Vedamuthu, E.R., Emond, E., Holler, J.B., Boucher, I. and Vandenbergh, P.A. 1997. Phenotypic and genetic characterization of the bacteriophage abortive infection mechanism Abi K from Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol., 63; 1274-1283.

Monteville, M.R., Ardestani, B. and Geller, B.A. 1994. Lactococcal phages require a host cell wall carbohydrate and a plasma membrane protein for adsorption and ejection of DNA. Appl. Environ. Microbiol., 60; 3204-3211.

Neve, H. 1996. Bacteriophage. In: dairy starter cultures (T.M. Cogan and J.P. Accolas. Eds), VCH Publishers, New York, pp; 157-189.

Nordström, K. and Forsgren, A. 1974. Effect of protein A on adsorption of bacteriophages of Staphylococcus aureus. J. Virol., 14; 198-202.

Oram, J.D. and Reiter,B. 1968. The adsorption of phage to group N streptococci. The specificity of adsorption and the location of phage receptor substances in cell-wall and plasma-membrane fractions. J. Gen. Virol., 3; 103-119.

Oram, J.D. 1971. Isolation and properties of a phage receptor substance from the plasma membrane of Streptococcus lactis ML3. J. Gen. Virol., 13; 59-71. 

O’Sullivan, D.J. and  Klaenhammer, T.R. 1995. C-LlaI is a bifunctional regulatory protein of the LlaI restriction modification operon from Lactococcus lactis. In Genetics of Streptococci, Enterococci, and Lactococci; Proceeding of the IVth International Conference on Streptococcal Genetics (Ferretti, J.J,  Gilmore, M., Klaenhammer, T.R., Brown, F., Eds.), Dev. Biol. Stand., Basel, 85; 591-595.  

Özcan, B.D. 1998. Bacillus subtilis’e ait selülaz genlerinin E. coli’ de klonlanması. Çukurova Üniversitesi Fen Bil. Enst. Yüksek Lisans Tezi. 70 s, basılmamış.

Prevots, F., Daloyau, M., Bonin, O., Dumont, X. and Tolou, S. 1996. Cloning and sequencing of the novel abortive infection gene abiH of Lactococcus lactis subsp.lactis biovar. diacetylactis S94. FEMS Microbiol. Letters, 142; 295-299.

Renault, P. 1996. Progress in genetic research of lactic acid bacteria. Current Advances in Metabolism, Genetics and Applications. 15-37p, France.

Reyrolle, J., Chopin, M.C., Letellier, F. and Novel, G. 1982. Lysogenic strains of lactic acid streptococci and lytic spectra of their temperate bacteriophages. Appl. Environ. Microbiol., 43; 349-356.

Sandberg, S., Laux, P. and Süssmuth, R. 1994. Correlation between phage-resistance and fructose-tolerance in Lactococcus lactis subsp. lactis 4513-5. Milchwissenschaft, 49; 552-555.

Sanders, M.E. and Klaenhammer, T.R. 1983.  Characterization of phage-sensitive mutants from a phage-insensitive strain of Streptococcus lactis: evidence for a plasmid determinant that prevents phage adsorption. Appl. Environ. Microbiol., 46; 1125-1133.

Sanders, M.E. 1988. Phage resistance in lactic streptococci. Biochemie, 70; 411-421.

Schaffer, A., Geis, A., Neve, H. and Teuber, M. 1991. Bacteriophage receptors of Lactococcus lactis subsp. diacetylactis F7/2 and Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2-1. FEMS Microbiol. Lett., 78; 69-74.

Schleifer, K.H. 1987. Recent changes in taxonomy of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Rev., 46; 201-203.

Shaerman, C., Underwood, H.M., Jury, K. and Gasson, M. 1989. Cloning and DNA sequence analysis of Lactococcus bacteriophage lysin gene. Molecular General Genetics, 218; 214-221.

Sijtsma, L., Sterkenburg, A. and Wouters, J.T.M. 1988. Properties of the cell walls of Lactococcus lactis subsp. cremoris SK110 and SK112 and their relation to bacteriophage resistance. Appl. Environ. Microbiol., 54; 2808-2811.

 

 

Sijtsma, L., Jansen, N., Hazeleger, W.C., Wouters, J.T.M. and Hellingwerf, K.J. 1990a. Cell surface characteristics of bacteriophage-resistant Lactococcus lactis subsp. cremoris SK110 and its bacteriophage-sensitive variant SK112. Appl. Environ. Microbiol., 56; 3230-3233.

Sijtsma, L., Jansen, N., Wouters, J.T.M. and Hellingwerf, K.J. 1990b. Isolation and characterization of lipoteichoic acid, a cell envelope component in preventing phage adsorption, from Lactococcus lactis subsp cremoris SK110. J. Bacteriol., 172; 7126-7130.

Su, P., Ng, A., Kennelly, V., Costello, M., Harvey, M. and Dunn, N. 1998. Additive effects of two different plasmid-linked restriction and modification systems in lactococcus. Biotechnology Letters, 20; 515-518.

Şanlıbaba, P., Tükel, Ç., Tuncer, Y. ve Akçelik, M. 1999. L.lactis suşlarında faj reseptör bölgeleri maskeleyen plazmid kodlu ürünlerin özellikleri. Biyoteknoloji (Kükem) Dergisi, XI KÜKEM Kongresi Özel Sayısı, 23; 113-119.

 Şanlıbaba, P. ve Akçelik, M. 2000. Çiğ süt ve peyniraltı sularından izole edilen laktokokların faj duyarlılıkları. Doğa (Tr. J. of Biology), Yayına kabul edildi.

Terzaghi, B.E. and Sandine, W.E. 1975. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl. Microbiology, 29; 807-813.

Teuber, M. 1990. Strategies for genetic modification in lactic acid bacteria. Food Biotechnology, 4; 537-546.

Tükel, Ç. ve Akçelik, M. 2000. Lactococcus lactis subsp. lactis suşlarında laktoz plazmidlerinin tanımlanması. Doğa (Tr. J. of Biology), basımda.

Twomey, D.P., Gabillet, N., Daly, C. and Fitzgerald, G.F. 1997. Molecular characterization of the restriction endonuclease gene (Scr FI) associated with the ScrFI restriction/modification system from Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503. Microbiology, 143; 2277-2286.

Valyasevi, R., Sandine, W.E. and Geller, B.L. 1990. The bacteriophage kh receptor of Lactococcus lactis subsp. cremoris KH is the rhamnose of the extracellular wall polysaccharide. Appl. Environ. Microbiol., 56; 1882-1889.

Valyasevi, R., Sandine, W.E. and Geller, B.L. 1991. A membrane protein is required for bacteriophage c2 infection of Lactococcus lactis subsp. lactisC2. J. Bacteriol., 173; 6095-6100.

Valyasevi, R., Sandine, W.E. and Geller, B.L. 1994. Lactococcus lactis subsp. lactis C2 bacteriophage sk1 receptor involving rhamnose and glucose moieties in the cell wall. J. Dairy Sci., 77; 1-6.

Vlegels, P.A.P., Hazeleger, W.C., Helmerhorst, T.H. and Wouters, J.T.M. 1988. Phage resistance of Streptococcus cremoris due to low adsorption efficiency. Neth. Milk Dairy J., 42; 195-206.

Watanabe, K., Ishibashi, K., Nashima, Y. and Sakurai, T. 1984. A phage-resistance mutant of Lactobacillus casei which permits phage adsorption but not genome injection. J. Gen. Virol., 65; 981-986. 

Wallace, R.J. 1980. Cytoplasmic reserve polysaccharide of Selenomonas ruminantium. Appl. Environ. Microbiol., 39; 365-366.

Wolfe, T.W. and McKay, L.L. 1983. Isolation and partical characterization of lactose-negative mutants from Streptococcus lactis C2 defective in the phosphotransferase system. J. Dairy Sci., 67; 950-959.

Yi-Mo, D., Liu, C-Q. and Dunn, N.W. 1999. Genetic organization and functional analysis of a novel phage abortive infection system, Abi L, from Lactococcus lactis. J. Biotechnol., 67; 135-149.

 

 

ŞEKİLLER DİZİNİ

 

 

Şekil 2.1. L. lactis suşlarında doğal faj dirençlilik sistemleri ve bunların

                faj enfeksiyon sürecindeki etki basamakları……………………………..6

Şekil 4.1. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ekzopolisakkarit

                üretme yeteneğini kaybetmiş (Eps-), faj duyarlı (fs)

                mutant suşu (MA83-28) ve bu suşun faj dirençli (fr)

                türevinin (MA83-28-T) protein içerikleri ………………………………43

Şekil 4.2. L. lactis subsp. lactis MA83 suşu ve mutantlarında plazmid içerikleri…46

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ÇİZELGELER DİZİNİ

 

 

Çizelge 4.1. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda fajların

                    adsorbsiyonu üzerine kimyasalların etkisi                                 34

Çizelge 4.2. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ekzopolisakkarit üretmeyen

                     mutantında (MA83-28)  fajların adsorbsiyonu üzerine kimyasalların

                     etkisi……………………………........................................................38

Çizelge 4.3. Ekzopolisakkarit üretmeyen ve faj almaç bölge materyali

                    proteinden oluşan kontrol suş L. lactis subsp. lactis 965’de

                    (Whisby, Niebüll/Germany) faj adsorbsiyonu üzerine

                    kimyasalların etkisi..............................................................................37

Çizelge 4.4. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun monosakkaritlere

                    spesifik lektinlerle aglutinasyonu……………………………………39

   Çizelge 4.5. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği ekzopolisakkarit

                       yapının kimyasal bileşimi…………………………………………....41

Çizelge 4.6. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği ekzopolisakkarit

                    materyalin monosakkarit bileşimi…………………………………….42