T.C.
ANKARA
ÜNİVERSİTESİ
ARAŞTIRMA FONU PROJESİ
KESİN RAPORU
GSTM1
Geninin Normal Bireylerde ve Akciğer Kanserli
Hastalarda
RFLP Analizi ile İncelenmesi
Proje
Yürütücücsü: Dr.Sümer ARAS
Proje
numarası: 2000-07-05-018
Başlama Tarihi: 26. Haziran 2000
Bitiş Tarihi: 26. Haziran 2001
Rapor Tarihi: 26. Haziran 2001
GSTM1
Geninin Normal Bireylerde ve Akciğer Kanserli Hastalarda RFLP Analizi ile
İncelenmesi
An
Investigation on the Frequency of GSTM1 gene in Turkish population by RFLP: A
Correlation Between Null Allele Gene Frequency and Lung Cancer
ÖZET
Sitozolik glutatyon S-transferaz süpergen ailesine üye olan enzimler pek çok karsinogenik elektrofili detoksifiye etme kapasitesine sahip dimerik yapıda enzimlerdir. Sigara dumanında bulunan bir çok bileşenin yanı sıra polisiklik aromatik hidrokarbonlar bu enzimlerin en önemli substratlarıdır. Bu enzim ailesinin bir üyesi olan GSTM1 polimorfik yapıdadır. Çalışmalar bu enzimin aktivitesinin olmadığı bireylerde akciğer kanseri riskinin arttığını göstermiştir. Bugüne kadar pek çok değişik popülasyonda yapılan incelemeler null allel frekansının toplumlar arasında farklılık gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu çalışmada Türk toplumunda normal bireylerde ve akciğer kanserli hastalarda GSTM1 null allel frekansı incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre akciğer kanserli hastalarda GSTM1 null allel frekansı (N=44) % 72.7, normal bireylerde ise (N=100) % 66 olarak bulunmuştur. Akciğer kanserli hastalarda null allel frekansı normal bireylerden yüksek olmasına karşın bu fark istatistiksel anlam taşımamaktadır (OR=0.73; %95 CL=0.33-1.59). Elde edilen bu ilk sonuçlar GSTM1 null genotipinin Türk hastalarda akciğer kanser gelişimine bir katkısı bulunmadığını savunmaktadır.
ABSTRACT
The enzymes that are the members of cytosolic glutathione
S-transferase supergene family have the capacity to detoxify carcinogenic
electrophiles. Many compounds which are present in the tobacco smoke and also
aromatic hydrocarbons are the substrates of these enzymes. Polymorphic GSTM1 is a member of this supergene family. A series of studies
have suggested that individuals lacking GSTM1
could potentially be at higher risk for lung cancer. In
different ethnic groups variations in null allele frequency has been observed.
In this present study GSTM1 null
allele frequency was investigated in Turkish population among healthy
individuals and also in patients with lung cancer. According to the results GSTM1 null allele frequency was found to
be (N= 44) 72.7% among lung cancer patients and (N= 100) 66% in normal
population. Although the GSTM1 null
genotype is somewhat over represented among the lung cancer patients the
difference was not statistically significant (OR=0.91, %95 CL=0.38-2.21). These
results indicate that GSTM1 null
genotype has no effect on lung cancer risk in Turkish patients.
II. Amaç ve Kapsam
Glutatyon S-transferazlar memeli
dokularında ekspres edilen ve çok geniş substrat spesifitesine sahip olan bir
enzim ailesidir. Primer yapılarına göre sitozolik enzimler a,m,p,d,q olmak üzere beş sınıfa
ayrılırlar. Bu enzimlerin çoğu detoksifikasyon reaksiyonlarında görev alırlar
ve redükte glutatyonun, konjugasyonunu katalizlerler. Bu aileye ait enzimleri
kodlayan pek çok gen insanda polimorfiktir. Bunlardan GSTM1 geni, polisiklik aromatik hidrokarbonların
detoksifikasyonunda rol alan GST m sınıfı bir izoenzimi kodlar (1). Sigara içenlerde GSTM1 aktivitesi bulunmamasının akciğer
kanseri için daha büyük bir risk faktörü oluşturduğu gösterilmiştir (2, 3,
4). Beyaz ırkta bu enzimin aktivitesi
%40-45 oranında bulunmuştur (5). Takip
eden çalışmalarda GSTM1 null
fenotipinin GSTM1 geninin homozigot
delesyonuna bağlı olduğu gösterilmiştir. Bu buluş GSTM1 polimorfizminin non-invasiv şekilde RFLP analizi ile ve daha
sonra PCR çalışmaları ile tespit edilebilmesini mümkün kılmıştır (6). Pek çok
RFLP çalışmasında elde edilen sonuçlar GSTM1
izoenziminin akciğer kanserine karşı koruyucu bir etki oluşturabileceği fikrini
desteklemesine karşın diğer bazı
çalışmalar GSTM1 null alleli ve
akciğer kanseri arasında önemli bir ilişkinin bulunmadığını savunmaktadır
(1,5,7,2,6).
Gen
sıklığı pek çok ayrı popülasyonda incelenmiş olup Japonlarda yüksek olduğu
anlaşılmış ve ayrıca akciğer kanseri ile ilişkisi tam olarak belirlenmiştir
(7). Bunun yanı sıra gen sıklığı Fransa, İngiltere, İspanya gibi Avrupa
ülkelerinde de incelenmiş, frekansın daha düşük olduğu tespit edilmiş ve kanser
bağıntısında rol oynayabileceği gösterilmiştir (5, 2, 6).
Çalışmamızda amaç doğrultusunda, Orta Anadolu’da yaşayan sağlıklı bireylerden alınan örneklerde ve akciğer kanseri hastalarında GSTM1 gen polimorfizimi incelenmiş, diğer toplumlara ait sonuçlarla karşılaştırılmıştır.
III. Materyal ve Yöntem:
Kan
Örnekleri:
Kontrol grubunu oluşturan kan örnekleri her iki cinsiyetten, yaşları 20 ile 65 arasında değişen ve Orta Anadolu’da yaşayan, sağlıklı gönüllülerden alındı. Kanser veya herhangi bir kronik hastalık öyküsü bulunan bireyler çalışmaya dahil edilmedi.
Akciğer kanseri hastalarına ait
örnekler Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları bölümünde ve
Başkent Üniversite Hastanesinde teşhis edilen hastalardan alındı.
DNA
İzolasyonu:
DNA,
taze periferal kan örneklerinden fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi ile izole
edildi (8). İzole edilen DNA örnekleri TE tampon çözeltisi (10mM Tris, 1mM EDTA
pH:8.2) içerisinde çözüldü ve kullanılana kadar –20oC’da
saklandı.
PCR
Amplifikasyonu:
GSTM1
polimorfizim analizi daha önce Zhong ve ark, (9) ve Hirhovonen ve ark (13)
tarafından açıklanan protokole göre yapıldı. PCR amplifikasyonunda üç ayrı
primer kullanıldı; primer 1: 5’
CGCCATCTTGTGCTACATTGCCCG 3’ ;
primer 2: 5’
ATCTTCTCCTCTTCTGGGTTCCTTCC 3’ ;
primer 3: 5’
TTCTGGATTGTAGCCAGATCA 3’ .
Primer 3 özel olarak GSTM1 genini
amplifiye ederken, primer 1 ve 2, m sınıfı başka bir geni (GSTM4) de amplifiye etmektedir (10). Bu üç primerle kontrol olarak kabul edilen 158 baz çiftlik
ve GSTM1 pozitif genotipi gösteren
231 baz çiftlik iki ürün elde edildi (Şekil 1).
İstatistik Analiz:
Verilerin
değerlendirilmesinde, One Way Anoava, Chi Square, ve Student’s t-testleri
kullanıldı.
IV. Analiz ve Bulgular
GSTM1 genotiplerinin sınıflandırılması amacıyla
uygulanan PCR analiz sonuçları Şekil 1’de gösterilmiştir. Ekson 4 ve 5
bölgelerine ait üç primer kullanılmıştır. Polimorfik GSTM1 geni, 231 bazçifti PCR ürününün varlığı veya yokluğu ile
tespit edilmiştir. Kontrol olarak kullanılan 158 baz çiftlik fragman tüm
örneklerde bulunmuştur (9,5). Tablo I çalışmaya dahil edilen hastaların
özelliklerini göstermektedir. Hastaların büyük kısmı (%84.1) uzun süredir günde
bir paketin üzerinde sigara içen bireylerdir. Hasta ve kontrol grubunda
belirlenen GSTM1 polimorfizim
dağılımı Tablo II’de gösterilmiştir. Sağlıklı bireylerin %66’sında, hasta
grubun ise %72.7’sinde genin delesyonu gözlenmiştir. GSTM1 null genotipi hasta grubunda yüksek olmasına karşın bu fark
istatistiksel bir anlam taşımamaktadır (OR= 0.73; %95 CL= 0.33-1.59). GSTM1 geninin bireyler arası dağılımı
Şekil 2’de gösterilmiştir.
Şekil 1. GSTM1
and GSTM4 genlerine ait PCR
ürnlerinin agaroz jel elektroforezi ile ayırılması. M 1 kb ladder markör . 158
baz çiftlik PCR ürünü tüm örneklerde gözlendi , 231 baz çiftlik PCR ürünü ise
sadece GSTM1 genini taşıyan
bireylerde gözlendi. Şerit 1, 2, : GSTM1
null genotipleri; Şerit 3, 4, 5,: GSTM1 pozitif genotipler.
Şekil 2. GSTM1’in kontrol ve akciğer kanseri için patolojik değerlendirme
ile beraber oranları.
Şekil GSTM1+
genotipe sahip bireylerin oranını göstermektedir..
Tablo I. Akciğer kanseri
hastalarının özellikleri
|
|
No(%) |
Ortalama Yaş (+ SD) |
Cinsiyet (E/K) |
Sigara Alışkanlığı (+/-) |
|
Akciğer
kanseri vakaları |
44 (100%) |
59.77 (+
10.03) |
40/4 |
37/7 |
|
Yassı
hücreli karsinoma |
23 (52.3%) |
60.48 (+
10.67) |
22/1 |
22/2 |
|
Adenokarsinoma |
10 (23.7%) |
57.90 (+8.76) |
9/1 |
8/2 |
|
Küçük
hücreli karsinoma |
9 (20.5%) |
61.78 (+9.99) |
7/2 |
6/3 |
|
Diğer |
2 (4.5%) |
52 (+11.31) |
2/0 |
2/0 |
Tablo
II. GSTM1 polimorfik geninin akciğer
kanserli hastalarda ve kontrol grubunda genotipik dağılımı
|
|
GSTM1+ GSTM1- |
|||||
|
|
||||||
|
Tüm akciğer kanseri vakaları (n=44) |
12 (27.3%) |
|
|
32 (72.7%) |
|
|
|
OR |
0.73 |
|
|
|
|
|
|
%95 CL |
0.33-1.59 (p>0.05) |
|
|
|
|
|
|
Yassı hücreli karsinoma (n=23) |
5(21.7%) |
|
18(78.3%) |
|
|
|
|
OR |
0.54 |
|
|
|
|
|
|
%95 CL |
(0.18-1.58) (p>0.05) |
|
|
|
|
|
|
Küçük hücreli karsinoma (n=9) |
5(55.6%) |
|
4(44.4%) |
|
|
|
|
OR |
2.43 |
|
|
|
|
|
|
%95 CL |
0.61-9.63 (p>0.05) |
|
|
|
|
|
|
Adenokarsinoma
(n=10) |
2(20%) |
|
8(80%) |
|
|
|
|
OR |
0.49 |
|
|
|
|
|
|
%95 CL |
0.1-2.41 (p>0.05) |
|
|
|
|
|
|
Diğer (n=2) |
Uygulanamaz |
|
|
|
|
|
|
Sağlıklı kontroller (n=100) |
34(34%) |
|
66(66%) |
|
|
|
V. Sonuç ve Öneriler:
Polimorfik genlerin metabolik polimorfizim ve akciğer kanseri riski ile
ilişkili rolleri geniş ölçüde incelenmiştir. Pek çok çalışma metabolize edici
enzimlere ait polimorfik GSTler gibi genlerin, akciğer kanserinde özellikle
sigara tüketenlerde önemli olduğunu göstermiştir (11, 12, 13, 9).
Bazı çalışmalar düşük seviyede
lökositik GSTM1 ile akciğer kanseri
arasında bir ilişki olduğunu savunmaktadır (14, 15). GSTM1 geni metabolik polimorfizim ve akciğer kanseri ile olan
ilişkisi açısından iyi çalışılmış bir gen olmasına karşın, null allelin etkisi
tam olarak açıklığa kavuşturulabilmiş değildir. Mc Williams ve ark gerçekleştirdikleri meta analiz çalışmasında GSTM1 enziminin olmaması durumunun
akciğer kanserinin gelişmesi için bir risk faktörü olduğunu göstermişlerdir
(16), buna karşın Deakin ve ark herhangi bir etkileşimin bulunmadığını
savunmaktadır (2). Bu çalışmada Türk
popülasyonunda ve Türk kanser hastalarında GSTM1
gen polimorfizimi değerlendirilmiştir.
Çalışmaya alınan sağlıklı bireyler Orta Anadolu’da genelde Ankara’da yaşayan bireylerdir. Hasta
bireylere ait kan örnekleri de yine aynı bölgede bulunan Ankara Üniversitesi
Hastanesinde teşhis edilip, tedavi gören hastalara ait örneklerdir. Tablo I
çalışmaya dahil edilen hastaların özelliklerini göstermektedir. Hastaların
büyük kısmı (%84.1) uzun süredir günde bir paketin üzerinde sigara içen
bireylerdir.
Daha önceden yapılan çalışmalar,
beyaz ırka dahil bireylerden oluşan popülasyonlarda GSTM1 null allel frekansının %50 civarında olduğunu göstermiştir.
Bu çalışmada elde edilen sonuç Türkiye’de (Orta Anadolu) genel popülasyondaki
bireylerin %66’sının GSTM1 null
genotipinde olduğunu göstermektedir. GSTM1
null allel frekansının Türk popülasyonunda yüksek olduğu anlaşılmaktadır,
bununla beraber diğer pek çok çalışma değişik etnik gruplarda null allel
frekansının %30 ile %70 arasında değişebildiğini ortaya koymuştur (17, 18,
19).
Akciğer kanser vakaları
incelendiğinde vakaların %72.7sinin GSTM1
null olduğu gözlenmiştir. Normal bireylerle (%66) karşılaştırıldığı zaman
akciğer kanserli hastalarda bir artış söz konusu olmasına karşın bu artış
istatistiksel bir önem göstermemiştir (OR= 0.73; %95 CL=0.33-1.59) (Tablo II).
GSTM1
null allel frekansının yüksek olmasının akciğer kanser riskini artırdığını
ileri süren çalışmalar bulunmasına karşın, diğer bazı çalışmalar bu genin
kanser riskini artırmadığını savunmaktadır. Bu çalışmada da akciğer kanseri
hastaları ile kontrol grubu arasında önemli bir farkın bulunmadığı
gözlenmiştir.
GST
enzim ailesine dahil theta sınıfı GSTT1 enzimi bazı detoksifikasyon
reaksiyonlarında GSTM1 enzimi ile aynı
yolakda rol almaktadır. Yine polimorfik bir lokus olan GSTT1 lokusunun gerek
tek başına akciğer kanser gelişimine bir katkı sağlayıp sağlamadığının ortaya
çıkarılması gerekse GSTM1 gen polimorfizimi ile bir sinerji gösterip
göstermediğinin anlaşılması bundan sonra üzerinde durulması gereken önemli noktalardır.
KAYNAKLAR
1.
Ketterer B, Harris JM, Talaska G, Meyer DJ, Pemble SE,
Taylor JB, Lang NP, Kadlubar FF. The human glutathione S-transferase supergene
family, its polymorphism and its effects
on susceptibility to lung cancer. Environ Hlth Perspect 1992; 98: 87-94.
2. Deakin M, Elder J, Hendrickse C, Peckham D, Baldwin D, Pantin C, Wild N, Leopard P, Bell DA, Jones P, Duncan H, Brannigan K, Allderson J, Fryer A, Strange R.C. Gluthione S-transferase GSTT1 genotypes and susceptibility to cancer: studies of interactions with GSTM1 in lung, oral, gastric and colerectal cancers. Carcinogenesis 1996; 17:881-884.
3. Kihara M, Kihara M, Kubota A, Furukawa M, Kimura H. GSTM1 gene polymorphism as a possible marker for susceptibility to head and neck cancers among Japanese smokers. Cancer Lett 1997; 112:257-262,.
4. Kihara, M. Lung cancer risk of GSTM1 null genotype is enhanced in the presence of GSTP1 mutated genotype in male Japanese smokers. Cancer Lett 1999; 137:53-60.
5.
Hirhovenen A,
Husgafvel-Pursiainen K, Anttila S, Vainio, H. The GSTM1 null genotype as a potential risk modifier for squamous cell
carcinoma of the lung. Carcinogenesis 1993; 14: 1479-1481.
6.
To-Figueras J, Gene M,
Gomez-Catalan J, Galan MC, Fuentes M, Ramon JM, Rodamilans M, Huguet E,
Corbella J. Glutathione S-transferase M1
(GSTM1) and (GSTT1) polymorphisms and
lung cancer risk among Northwestern Mediterraneans. Carcinogenesis 1997; 18:
1529-1533.
7.
Kihara M, Noda K, Kihara M.
Distribution of GSTM1 null genotype
in relation to gender, age and smoking status in Japanese lung cancer patients.
Pharmacogenetics, 1995; 5: S74-S79.
8.
Sambrook J, Fritsch EF,
Maniatis T. In: Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2nd ed. Cold
Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:9-19E,.
9.
Zhong S, Forbes Howie AF,
Ketterer B, Taylor J, Hayes JD, Beckett GJ, Wathen CG, Wolf CR, Spurr NK. Glutathione S-transferase mu locus:
use of genotyping and phenotyping assays to assess association with lung cancer
susceptibility. Carcinogenesis 1991; 12: 1533-1537.
10.
Zhong S, Spurr NK, Hayes JD,
Wolf CR. Deduced amino acid sequence, gene structure and chromosomal location
of a novel human class Mu glutathione S- transferase; GSTM4. Biochem J 1993; 291: 41-50.
11.
Alexandrie AK, Sundberg MI,
Seidegard J, Tornling G, Rannug A. Genetic susceptibility to lung cancer with
special emphasis on CYP1A1 and GSTM1:
a study on host factors in relation to age at onset, gender and histological
cancer types. Carcinogenesis 1994;15 1785-1790.
12.
Garcia-Closas M, Kelsey KT,
Wiencke JK, Xu X, Wain JC, Christiani
DC. A case control study of cytochrome P450 1A1, glutathione S-Transferase M1,
cigarette smoking and lung cancer susceptibility (Massachusetts, United States)
Cancer Causes Control 1997; 8:
544-553.
13.
Brockmoller J, Kerb R,
Drakoulis N, Nitz M, Roots I. Genotype
and phenotype of glutathione S-tansferase class mu isozymes m and j in lung cancer patients and controls. Cancer Res 1993; 53: 1004-1011.
14.
Seidegard J, Pero M, Miller
DG, Beattie EJ. A glutathione transferase in human leukocytes as a marker for
susceptibility to lung cancer, Carcinogenesis 1986; 7: 751-753.
15.
Seidegard J, Pero M,
Markowittz M, Rouch G, Miller DG,
Beattie EJ. Isozyme(s) of
glutahione transferase (class Mu) as a marker for susceptibility to lung
cancer: a follow up study. Carcinogenesis 1990; 11: 33-36.
16.
Mc Williams JE, Sanderson BJS, Harris EL, Richert-Boe KE, Henner WD. Glutathione S-transferase M1
deficiency and lung cancer risk. Cancer Epidemiol. Biomarkers Preven 1995; 4: 589-594,.
17.
Seidegard J, Pero M. The
hereditary transmission of high glutathione
transferase activity towards trans-stillbene oxide in human mononuclear
leukocytes. Hum Genet 1985; 69: 66-68.
18. Board PG.
Biochemical genetics of glutathione S-transferase. Am J Hum Genet 1981; 33:
36-43.
19.
Bell DA, Thompson CL, Taylor
JA, Miller CR, Perera F, Hsieh LL, Lucier GW. Genetic monitoring of human
polymorphic cancer susceptibility genes by polymerase chain reaction:
application to glutathione transferase m, Environ. Health Perspect 1992; 98: 113-117.
VII. Ekler
a) Mali Bilanço ve Açıklamaları
Proje
kapsamında ARFO’dan 1.436.000.000 TL.
alınmıştır. Tahsis edilen bu bütçe proje öneri formunda belirtilen bütçe
detayına göre, aşağıda açıklandığı gibi kullanılmıştır.
Tüketim mal ve malzemeleri |
|
Toplam |
|
Kimyasal
madde |
787.000.000.-+KDV |
965.000.000.- |
|
Kırtasiye |
20.000.000.- |
20.000.000.- |
|
Fotokopi |
20.000.000.- |
20.000.000.- |
|
Bilgisayar |
20.000.000.- |
20.000.000.- |
|
Toplam |
|
1.025.000.000.- |
|
Demirbaş alımları |
|
|
|
Elektroforez
tankı |
410.000.000.-+KDV |
471.000.000.- |
|
GENEL
TOPLAM |
|
1.436.000.000.- |
b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar
Bu proje kapsamında makine ve teçhizat alınmamıştır.
Demirbaş malzeme olarak alınan elektroforez tankı bundan sonra
gerçekleştirilecek moleküler biyoloji çalışmalarında da kullanılacaktır.