T.C.

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

KESİN RAPORU

BEHÇET HASTALARINDA OKSİDATİF STRESİN GÖSTERGESİ OLARAK İDRAR 8-İZOPROSTAGLANDİN F_2α DÜZEYLERİNİN ÖLÇÜLMESİ VE HASTALIK ALT TİPLERİNİN AKTİVİTESİYLE

İDRAR 8-İZOPROSTAGLANDİN F_{2α }DÜZEYLERİ

ARASINDAKİ İLİŞKİNİN SAPTANMASI

Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Mehmet Melli

Proje No: 2001-08-09-044

Başlama Tarihi: 04.04.2001

Bitiş Tarihi: 04.12.2002

Rapor Tarihi: 10.11.2003

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri

Ankara 2003

KISALTMALAR

COX	Siklooksijenaz
NSAİİ	Nonsteroidal anti-inflamatuar ilaç
PG	Prostaglandin
Tx	Tromboksan
izoP	İzoprostan
MBH	Mukokutanöz Behçet hastalığı
VBH	Vasküler Behçet Hastalığı
SLE	Sistemik Lupus Eritematozus
EİA	Enzim İmmünoassay
PMNL	Polimorfonükleer lökosit

ÖZET

Behçet hastalığında oksidatif stresin göstergesi olarak idrar 8-izoprostaglandin F_2α düzeylerinin ölçülmesi ve hastalık alt tiplerinin aktivitesiyle idrar 8-izoprostaglandin F_2α düzeyleri arasındaki ilişkinin saptanması

İzoprostanlar, serbest radikallerin indüklediği arakidonik asit gibi poliansatüre yağ asitlerinin, nonenzimatik peroksidasyonu ile oluşan prostaglandin izomerleridir. İzoprostanların ölçümü oksidatif hasarın erken ortaya çıkan, selektif ve spesifik göstergesi olarak kabul edilmektedir. Kronik seyir gösteren, polisemptomatik, rekürren sistemik bir vaskülit olan Behçet hastalığında oksidatif hasarın patolojiye katkısını değerlendirmek için değişik evrelerdeki Behçet hastalarında idrar 8-izoprostaglandin F_2α düzeyleri enzimimmünoassay yöntemiyle ölçüldü ve bu idrar düzeylerinin klinik seyir ile ilişkisi araştırıldı. Ayrıca daha önce literatürde 8-izoprostaglandin F_2α düzeylerinin arttığı bildirilen sistemik lupus eritematozus hastaları da pozitif kontrol olarak çalışmaya dahil edildi. Behçet’li ve sistemik lupus eritematozuslu hastaların idrar 8-izoprostaglandin F_2α düzeylerinin sağlıklı gönüllülerinkinden farklı olmadığı tespit edildi. Mukokutanöz ve vasküler Behçet’li hastalar arasında ve bunların aktif ve inaktif grupları arasında idrar 8-izoprostaglandin F_2α düzeyleri açısından fark bulunamadı. Ayrıca sistemik lupus eritematozuslu hastaların aktif ve inaktif grupları arasında fark yoktu. Hastaların çalışma sırasında tedavi protokollerinden birini alıyor olması nedeniyle serbest radikal hasarı ve dolayısıyle idrar 8-izoprostaglandin F_2α düzeyleri baskılanmış olabilir. Bu nedenle ve bireylerarası varyasyonun yüksek olması nedeniyle yeni tanı konulmuş daha fazla sayıda hasta ve sağlıklı gönüllü içeren çalışmalar, izoprostan düzeyi hakkında daha sağlıklı sonuçlar elde edilmesini sağlayacaktır.

ANAHTAR KELİMELER: Behçet hastalığı, oksidatif hasar, sistemik lupus eritematozus 8-izoPGF_2α.

SUMMARY

Assesment of urinary 8-isoprostaglandin F_2α level in Behcet disease as index of oxidative stress and establishment of correlation between disease activity and urinary 8-isoprostaglandin F_2α level

Isoprostanes are prostaglandin isomers that are generated from non-enzymatic peroxidation of polyunsaturated fatty acids like arachidonic acid via a free radical-catalyzed mechanism. Measurement of isoprostanes can provide a sensitive and specific assesment of early oxidative damage of tissues. In order to evaluate the contribution of oxidative damage to Behcet disease, known as a chronic, polysymptomatic, reccurrent, systemic vasculitis, urine 8-isoprostaglandin F_2α levels collected from patients at different disease stages were measured by EIA method and the releationship between clinical progression and the 8-isoprostaglandin F_2α levels were evaluated. Systemic lupus erythematosus patients in whom 8-isoprostaglandin F_2α levels were found to be increased were also involved as the positive control group. Urine 8-isoprostaglandin F_2α levels of patients with Behcet and systemic lupus erythematosus disease were not different from those of healty volunteers. Also, urine 8-isoprostaglandin F_2α levels of patients with mucocutaneous and vascular Behcet disease and active and inactive group of these diseases showed no difference. There was no difference between active and inactive groups of systemic lupus erythematosus patients also. These findings may be due to the supression of free radical damage and, as a result of, urinary 8-isoprostaglandin F_2α level because the patients have already taken one of the treatment protocol during study. Taking together these reasons with interindividual variations of urinary 8-isoprostaglandin F_2α, further studies involving large number of patients and healty volunteers will give more reliable results for isoprostane levels.

KEY WORDS: Behcet disease, oxidative damage, systemic lupus erythematosus,

8-isoPGF_2α.

1. AMAÇ VE KAPSAM:

İzoprostanlar (izoP) serbest radikallerin indüklediği, arakidonik asit gibi poliansatüre yağ asitlerinin nonenzimatik peroksidasyonu ile oluşan ürünlerdir. İnsanda izoprostanların in vivo oluşumu ilk kez Morrow ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir (1). Bu tarihten itibaren izoprostanların in vitro ve in vivo lipid peroksidasyonunun sensitif ve spesifik göstergesi olduğunu gösteren birçok kanıt bulunmuştur. İzoprostanlar, prostaglandinlerin kimyasal olarak stabil, yapısal izomerleridir. İzoprostanlar ve prostaglandinler arasındaki önemli yapısal fark; izoprostanların özel olarak cis yan zincirine sahipken prostaglandinlerin prostan halkasına trans pozisyonunda yan zincirler içermesidir. Bu maddeler siklooksijenaz (COX) ile oluşan prostaglandin F_2α’nın izomerleri olması nedeniyle F₂ izoP’lar olarak adlandırılmaktadır. PGD₂ benzeri bileşik olarak D₂ izoP’lar, PGE₂ benzeri bileşik olarak E₂izoP’ların in vivo aynı yolla oluştuğu gösterilmiştir. Bunların yanında lökotrienlerin ve tromboksanında benzer izomerleri tanımlanmıştır (2, 3) ama bunların içinde en fazla üzerinde çalışmalar yapılan ve hakkında bilgi sahibi olduğumuz F₂ izoP’lardır. Prekürsörleri arakidonik asit doku fosfolipidlerinden esterifiye olduğundan in situ F₂ izoP’lar oluşur ve hedef dokularda birikir. Ardından hücresel aktivasyona yanıt olarak ve fosfolipaz bağımlı bir mekanizma ile kan dolaşımına geçer ve idrarla atılırlar (4). Oluşum ve membrandan salınımını kontrol eden mekanizma ve metabolik dispozisyonları henüz tam olarak bilinmemektedir.

Kısaca izoprostanlar aşağıdaki gibi isimlendirilmiştir:

8-izoPGF_2a

· izo ön eki temel yapıya yan zincirlerin çiralitisini gösterir.

· D, E, F, G ve H harfleri prostaglandin adlandırılmasındaki siklopentan halkası tipini belirtir.

· Çift bağların sayısı altta yazılan 1, 2, 3, 4 rakamlarıyla gösterilir.

· a veya b sembolleri siklopentan halkasında hidroksil gruplarının stereokimyasını gösterir (5).

F₂ izoP’lar lipid peroksidasyonunun göstergesi olarak idrar, kan, safra (6, 7) perikardiyal sıvı (8) ve beyin-omurilik sıvısı (9, 10) gibi çeşitli vücut sıvılarında; beyin ve karaciğer dokusunda ölçülmüştür. Bu ölçümlerde değişik yöntemler kullanılmaktadır.

Gaz kromatografi-kütle spektrometre (GC/MS): Morrow ve Roberts’ın ilk olarak tanımladığı gaz kromatografi (GC)/elektron tutma/negatif kimyasal iyonizasyon kütle spektrometre (MS) yöntemi total serbest ve esterifiye F₂izoP’ları internal standart olarak izotopla işaretli PGF_2a kullanarak ölçmektedir (1). Ölçülen 8-izoPGF_2a in vivo total F₂izoP’ların bir göstergesidir. İzoprostanların internal standardının olmayışı ile GC’de ekstraksiyon ve pürifikasyon aşamalarının yetersizliğinden dolayı rezolüsyonunun iyi olmaması gibi bazı sınırlamaları vardı. Bu grup daha sonra internal standart olarak deuterium işaretli 8-izoPGF_2a kullanmaya başlamıştır (11). Bununla birlikte 8-izoPGF_2a izomerini diğer izomerlerden ve metabolitlerinden ayırt etmek mümkün değildir.

İmmüno-GC-MS: 8-izoPGF_2α için immüno afinite kolonu ile saflaştırma yapıldıktan sonra MS ile kantitasyona dayanan bir yöntemdir. Kolon bütün saflaştırma basamakları yerine geçer fakat kolonun ömrü sınırlıdır ve sabit bir antikor kaynağı gerektirmektedir (12).

Bu yöntemlerin en büyük dezavantajı pahalı olması ve özelleşmiş laboratuvarlar gerektirmesidir.

İmmünoassay: 8-izoPGF_2α için hem in vivo hem in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere immünoassay kitleri mevcuttur. GC/MS için gerekli olan ön hazırlama işlemleri bu yöntem için de gereklidir. İmmünoassay ile F₂-izoP’ların analizinin doğruluğu GC/MS ile test edilmiştir (13).

Oksidatif stresin ve lipid peroksidasyonunun göstergesi olan F₂ izoP’larla ilgili yapılan çalışmalarda kan, beyin omurilik sıvısı, perikard sıvısı gibi vücut sıvılarında kronik sigara içiminde (14), hiperkolesterolemi (15), koroner anjioplasti (16) gibi kardiyovasküler hastalıklarda, kronik obstrüktif akciğer hastalığında (17), Tip I ve Tip II diabetes mellitusda (18, 19), Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklarda (20) yüksek olduğu bildirilmiştir. Ayrıca izoP düzeyi yüksekliği sistemik lupus eritematozus (21), skleroderma (22) ve çeşitli romatolojik hastalıklar (23) gibi inflamatuar durumlarda da gösterilmiştir.

Behçet hastalığı kronik seyir gösteren, polisemptomatik, rekürren sistemik vaskülittir (24). İlk defa 1937 yılında Türk dermatoloğu Hulusi Behçet tarafından oral aft, genital ülser ve hipopiyonlu irit triadı olarak tanımlanmıştır. Bu üçlü semptom kompleksinin yanında oftalmik, mukokutanöz, kardiyovasküler, pulmoner, gastrointestinal, ürogenital ve kas-iskelet sistem tutulumu olabilir (25). Kesin etyoloji hala bilinmemekle birlikte bakteriyel veya viral enfeksiyon, genetik ve çevresel faktörler, toksik kimyasallar ve immün mekanizmalar Behçet hastalığı patogenezinde öne sürülmektedir. Son yıllarda Behçet hastalığı etyopatogenezinde reaktif oksijen bileşiklerinin rolü araştırılmış ve Behçet hastalarının aktive nötrofillerinde artmış bulunan reaktif oksijen türleri ile hastalıktaki vasküler ve endotelyal doku hasarının ilişkili olduğu gösterilmiştir (26, 27). Ayrıca Behçet hastalarında kontrol grubu ve inaktif hastalık grubuna göre plazma süperoksid dismutaz aktivitesi yüksek bulunmuştur (28).

Bu çalışmada bu zamana kadar oksidatif hasarın patolojiye katkısı açısından literatürde yeterli bilgi olmayan Behçet hastalığında oksidatif hasarın göstergesi olarak idrar 8-izo-PGF_{2α }düzeylerinin değişik evrelerdeki Behçet hastalarında ölçülmesi ve hastalığın klinik seyriyle ilişkisinin araştırılması planlanmıştır. Ayrıca daha once literatürde 8-izo-PGF_2α düzeylerinin arttığı bildirilen SLE hastaları da, pozitif kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edilmişlerdir.

2. MATERYAL VE YÖNTEM

2.1. HASTA SEÇİMİ:

Behçet Hastalığı Uluslararası Tanı Kriterlerine göre tanı konulmuş 56 Behçet hastası, 1982 ARA kriterlerine göre tanı konulmuş 11 sistemik lupus eritematozus hastası ve 11 sağlıklı gönüllü çalışmaya alındı.

Çalışmaya katılan Behçet hastaları Mukokutanöz Behçet (MBH) ve Vasküler Behçet (VBH) olmak üzere 2 gruba ayrıldı. Oral ve genital ülseri, cilt lezyonları ve pozitif paterji testi olanlar Mukokutanöz Behçet grubu olarak tanımlandı. Vasküler Behçet grubuna venöz trombozu, arteriyel trombozu ve/veya anevrizması olanlar alındı. İzole yüzeysel tromboflebiti olan hastalardan beraberinde derin ven trombozu olmayan MBH grubuna derin ven trombozu olanlar ise VBH grubuna dahil edildi. Vasküler Behçet tanısı klinik bulgular, renkli doppler ultrasonografi ve/veya anjiyografi ile konuldu.

Hastalar ayrıca hastalık aktivitelerine göre de sınıflandırıldılar. Çalışma sırasında iki veya daha fazla klinik bulgusu (oral ülser, genital ülser, göz lezyonları, cilt lezyonları, artrit, pulmoner ve nörolojik semptomlar, akut venöz tromboz, akut arter tombozu veya anevrizması) olanlar aktif grup, en az 1 aydır semptomu olmayanlar inaktif grup kabul edildi.

			n	Yaş [ort (alt-üst sınır)]	Cinsiyet (E: erkek, K: kadın)
Behçet	mukokutanöz	aktif	22	37 (20 - 49)	11 E, 11 K
		inaktif	14	38,7 (27 - 58)	5 E, 9 K
	vasküler	aktif	7	33,1 (30 - 42)	7 E
		inaktif	13	41,8 (28 - 52)	10 E, 3 K
		Toplam	56	37,6 (20 - 58)	33 E, 23 K
SLE		aktif	4	36 (34 - 38)	4 K
		inaktif	7	40,83 (19 - 59)	1 E, 6 K
		Toplam	11	35,1 (19 - 59)	5 E, 6 K
Sağlıklı gönüllü			11	30,9 (19 - 52)	4 E, 7 K

Tablo 1: Çalışmaya alınan hastaların özellikleri

2.2. İDRAR ÖRNEKLERİNİN TOPLANMASI:

Çalışmaya katılan hastalardan sabah ilk idrarları (8-10 saatlik) toplandı. Toplanan idrar herbiri 10 ml olacak şekilde tüplere ayrıldı. Bu 10 ml lik örneklerden biri antioksidan madde eklenmeden kreatinin ölçümü için saklandı. Diğer 10 ml lik örneklerin her birine final konsantrasyonları 1 mM olacak şekilde serbest radikal süpürücü olan 5-hidroksi tempo ve EDTA eklenerek ölçüm yapılana kadar -20°C’de saklandı.

2.3. İDRAR KREATİNİN DÜZEYLERİNİN ÖLÇÜLMESİ:

İdrarların kreatinin düzeyleri, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbni Sina Hastanesi Merkez Laboratuvarında ölçüldü.

2.4. İDRARDAN 8-izoPGF_{2α }’NIN EKSTRAKSİYONU:

İzoprostanların ekstraksiyonu için -20 °C’de saklanan örnekler çıkarılıp oda ısısnda çözdürüldükten sonra pH ~ 4 olabilmesi için glasial asetik asit ve recovery hesaplanması için 40000 dpm ³H-PGF₂ _eklendi. 4000 rpm’de +15^°C’de 10 dakika santrifüj edildikten sonra örnekler önce SepPak^TM C18 (100 mg) (Waters associates, Milford, Massachusetts, USA) kartuşdan geçirilerek ekstrakte edildi. Bu aşamada sırasıyla 5 ml metanol, 10 ml deiyonize su, 2 ml örnek, 5 ml deiyonize su, 5 ml hegzan geçiridikten sonra 1 ml %1 metanollü etil asetat ile elüent toplandı. Toplanan elüente 5 ml hegzan eklenip karıştırıldı. Daha sonra SepPak^TM Silika (100 mg) (Waters associates, Milford, Massachusetts, USA) kartuşdan ekstraksiyon için 5 ml etil asetat, 5 ml hegzan/etil asetat (1/1), C18 ekstraksiyonundan elde edilen elüent geçirilip 5 ml metanol/etil asetat (20/80) ile elüent toplandı. Vakum konsantratör (MaxiDry Plus, Heto Holten A/S, Allerod, Danimarka) ile organik faz uçurulduktan sonra enzim immünassay (EİA) tamponu (1 litre deionize su içinde 100 ml 1.0 M potasyum fosfat tamponu, 100 mg sodyum azid, 23.4 g NaCl, 370 mg tetrasodium EDTA, 1 g bovine serum albumin) içinde sulandırıldıktan sonra EİA yöntemiyle örneklerdeki 8-izo-PGF_2α ölçülmek üzere -80 °C’de saklandı.

Ekstraksiyon öncesinde ve sonrasında alınan örneklerde radyoaktivite saydırılması sonucunda hesaplanan recovery oranları % 62,46±2,77 bulunmuştur.

2.5. EİA İLE 8-izoPGF_2α’NIN ÖLÇÜLMESİ:

Örneklerdeki 8-izoPGF_2α düzeylerinin ölçümü için asetilkolin esteraz işaretli solid faz EİA (Enzyme Immun Assay) yöntemi kullanıldı (29). EİA ile yapılan ölçümlerde SPI-Bio'dan (Cedex, Fransa) sağlanan 8-izoPGF_2α’ya özel anti-serumu, asetilkolin esteraz tracer’ı ve standardı kullanıldı. Bütün örnekler EİA tamponu içinde sulandırılarak ölçüm yapıldı.

Platelere ölçüm yapılacak örnek, asetilkolin esterazla işaretli tracer ve anti-serum çözeltilerinin herbirinden 50 ml eklenerek yaklaşık 20 saat +4°C'de inkübe edildi. Bağlanmayan maddelerin EİA yıkama tamponu ile yıkanarak uzaklaştırılmasından sonra kuyucuklara 200 ml Ellman reaktifi eklendi. 60-90 dakika sonra spektrofotometrik olarak 414 nanometre dalga boyundaki adsorbans ölçüldü. 1,9 pg/ml ve 250 pg/ml arasında 8 derişim 8-izoPGF_2α kullanılarak her plate için bir standard eğri oluşturuldu. Örneklerde 8-izoPGF_2α düzeyi 4 parametreli lojistik modelin doğrusal olmayan regreyonundan hesap edildi. Sonuçlar her örneğin recovery sine göre düzeltildi. İdrarlardaki izoprostan düzeyleri hesaplanırken aşağıdaki formül kullanıldı.

)

İdrar kreatinini (mg/dl)

/

(

)

100

*

Ölçülen izoprostan değeri (pg/ml)

recovery

(

İdrar izoP (pg/mg kreatinin) =

EİA ile yapılan ölçümlerin doğruluğunu test etmek amacıyla sağlıklı gönüllü idrarına dışarıdan 3 farklı konsantrasyonda (2,5, 5 ve 10 pg/ml) 8-izoPGF_2α ekleyip EİA ile ölçüm yapıldı. Aynı deney 3 kere tekrar edildikten sonra elde edilen sonuçlarda yapılan regresyon analizinde R²=0.98 bulundu.

2.6. İSTATİKSEL ANALİZ:

Sonuçlar median değerleri verilerek Scatter grafikte gösterildi. Çeşitli hasta gruplarının ve kontrol grubunun idrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri Kruskal-Wallis testi ile karşılaştırıldı. İki grup arası karşılaştırma Mann-Whitney U testi ile yapıldı.

İstatistiksel analizler Statistical Package for Social Sciences (SPSS) v10.0 programı ile yapıldı.

3. ANALİZ VE BULGULAR:

3.1. Behçet’li hastalar, SLE’li hastalar ve sağlıklı gönüllülerde idrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri

İdrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri 56 Behçet’li hasta, 11 SLE’li hasta ve 11 sağlıklı gönüllüde EİA ile ölçüldü. 3 grup arasında idrar 8-izo-PGF_2α düzeylerinde fark yoktu (Şekil 1).

Şekil 1. Behçet’li, SLE’li ve sağlıklı gönüllülerde EİA ile ölçülen idrar 8-izoPGF_2α düzeyleri

3.2. Mukokutanöz ve vasküler Behçet’li hastalarda idrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri

İdrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri 36 mukokutanöz tip Behçet’li hasta ve 20 vasküler tip Behçet’li hasta da EİA ile ölçüldü. 2 grup arasında idrar 8-izo-PGF_2α düzeylerinde fark yoktu (Şekil 2).

Şekil 2. Vasküler Behçet’li ve mukokutanöz Behçet’li hastaların EİA ile ölçülen idrar 8-izoPGF_2α düzeyleri

3.3. Aktif ve inaktif Behçet’li hastalarda idrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri

İdrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri 29 mukokutanöz ve vasküler tip aktif Behçet’li hasta ile 27 mukokutanöz ve vasküler tip inaktif Behçet’li hastada EİA ile ölçüldü. 2 grup arasında idrar 8-izo-PGF_2α düzeylerinde fark yoktu (Şekil 3).

Şekil 3. Aktif ve inaktif Behçet’li hastaların EİA ile ölçülen idrar 8-izoPGF_2α düzeyleri

3.4. Aktif ve inaktif SLE’li hastalarda idrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri

İdrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri 4 aktif SLE’li hasta ile 7 inaktif SLE’li hastada EİA ile ölçüldü. 2 grup arasında idrar 8-izo-PGF_2α düzeylerinde fark yoktu (Şekil 4).

Şekil 4. Aktif ve inaktif SLE’li hastaların EİA ile ölçülen idrar 8-izoPGF_2α düzeyleri

3.5. Aktif ve inaktif mukokutanöz tip Behçet’li hastalarda idrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri

İdrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri 22 aktif mukokutanöz tip Behçet’li hasta ile 14 inaktif mukokutanöz tip Behçet’li hastada EİA ile ölçüldü. 2 grup arasında idrar 8-izo-PGF_2α düzeylerinde fark yoktu (veriler gösterilmedi).

3.6. Aktif ve inaktif vasküler tip Behçet’li hastalarda idrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri

İdrar 8-izo-PGF_2α düzeyleri 7 aktif vasküler tip Behçet’li hasta ile 13 inaktif vasküler tip Behçet’li hastada EİA ile ölçüldü. 2 grup arasında idrar 8-izo-PGF_2α düzeylerinde fark yoktu (veriler gösterilmedi).

4. TARTIŞMA:

İnflamasyon; vasküler ve hücresel komponenti olan, nöronal regülasyonun ve çeşitli mediatörlerin rol aldığı oldukça karmaşık bir yanıttır. Son yıllarda çok sayıdaki çalışmada serbest radikallerin inflamasyonun önemli bir komponenti olduğu gösterilmiştir. Serbest radikallerin mikroorganizmaları yıkıcı ve kemotaktik faktörlerin oluşumu gibi yararlı etkilerinin yanında doku hasarını arttırıcı gibi olumsuz etkileri de vardır. Tüm inflamatuvar yanıtlara, serbest oksijen radikallerinin göreceli katkısı biliniyorken bu katkının derecesi duruma ve zamana göre değişiklik gösterebilmektedir. Bu nedenle de inflamatuar durumlarda antioksidan tedavinin etkinliği değişiklik gösterir. İnflamatuar yanıtta oluşan serbest radikallerinin büyük kısmı fagositik hücrelerden kaynaklanmaktadır ki, bu hücreler aktive olduklarında büyük miktarlarda süperoksit ve hidrojen peroksit oluşturma yeteneğine sahiptirler. Bu radikaller serbest demir ile etkileşir sonuçta yüksek reaktif hidroksil radikali oluşur ve doku hasarına yol açarlar. Serbest radikallerin oluşturduğu bu ilave hasar nedeniyle yeni fagositik hücreler olaya katılmakta ve serbest radikallerin kemotaktik faktörlerin oluşumunu da stimüle etmeleri nedeniyle inflamatuar yanıtta kısır döngü oluşmaktadır (30).

Behçet hastalığında serbest oksijen radikallerinin rolü kesin olarak gösterilememişken Behçetli hastaların nötrofillerinde kemotaksis ve fagositoz gibi fonksiyonlarda bazı anormalliklerin olduğu (31) ve Behçet’li hastaların stimüle olmuş nötrofillerinde endotelyal doku hasarına neden olan serbest oksijen radikallerin düzeylerinin yükselmiş olduğu gösterilmiştir (26, 32). Ayrıca Behçet’li hastaların polimorfonükleer lökositlerinde (PMNL) (27, 33) ve plazmalarında (34) süperoksid süpürücü aktivitenin azaldığı gösterilmiştir. Bu bulgular PMNL’lerde artmış O₂^· oluşumunun Behçet’li hastalarda süperoksid süpürücü aktivitenin azalmasından sorumlu olabileceği ve PMNL’lerin dokularda daha fazla O₂^· radikalinin salınımına neden olabileceği düşüncesini desteklemektedir. Yapılan çalışmalarda PMNL’lerin diğer oksidan ve antioksidan enzim aktivitelerinde değişikliklerde bildirilmiştir. Behçet’li hastalarda süperoksid dismutaz, myeloperoksidaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz aktivitesinin azaldığı ve NADPH oksidaz aktivitesinin arttığı gösterilmiştir (35). Ayrıca yapılan bir başka çalışmada Behçet’li hastalarda yaşla ve hastalık süresiyle ilişkili olarak eritrositlerde lipid peroksidasyonunun göstergesi olan malondialdehit düzeylerinin arttığı gösterilmiştir. Yine bu çalışmada hidrojen peroksid ile indüklenmiş malondialdehit oluşumunun Behçet’li hastalarda sağlıklı gönüllülere göre daha fazla olduğu, gingko biloba ekstresi Egb761 ile malondialdehit düzeyinin sağlıklı gönüllüler düzeyine indiği gösterilmiştir (36). Kısacası Behçet’li hastaların plazma antioksidan sisteminde yetersizlik veya bozukluk olduğu ve O₂^· oluşumundaki artışın dokularda daha fazla lipid peroksidasyonuna yol açtığı kabul edilmektedir.

Bu çalışmada Behçet hastalığında oksidatif hasarın patolojiye katkısını değerlendirmek için oksidatif hasarın göstergesi olarak idrar 8-izo-PGF_{2α }düzeylerinin değişik evrelerdeki Behçet hastalarında ölçülmesi ve hastalığın klinik seyriyle ilişkisinin araştırılması planlandı. Literatürde Behçet hastalarında idrarda ve/veya plazmada 8-izo-PGF_2α düzeylerini değerlendiren bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Behçet’li hastaların idrar 8-izoPGF_2α düzeylerinin sağlıklı gönüllülerinkinden farklı olmadığı, mukokutanöz ve vasküler Behçetli hastaların idrar 8-izoPGF_2α düzeyleri arasında ve yine aktif ile inaktif gruplar arasında fark görülmediği tespit edildi. Literatürde 8-izoPGF_2α düzeylerinin geniş varyasyon gösterdiği bilinmektedir. Çalışmaya yeterli kabul edilebilecek sayıda Behçet hastası alınmasına rağmen (n:56), sağlıklı gönüllü (n:11) ve SLE hastası sayısı (n:11) düşüktür. Sağlıklı gönüllü ve SLE’li hastaların sayısının arttırılması durumunda daha farklı sonuçların alınması beklenebilir. Çeşitli gruplar tarafından yapılan çalışmalarda da, aynı hastalıkta farklı sonuçların alındığı bildirilmiştir. Bu kapsamda Alzheimer hastalığında 8-izoPGF_2α düzeylerinin arttığını gösteren grupların yanında (9, 37, 38) artmadığını gösteren gruplarda bulunmaktadır (39). Yine üzerinde çok çalışma yapılan tip I diyabette 8-izoPGF_2α düzeylerinin arttığını gösteren fazla sayıda çalışmanın yanında (19, 40, 41), artmadığını gösteren çalışma da bulunmaktadır (42).

Çalışmaya alınan hastalardan sadece 1 tanesi yeni tanı konulmuş ve tedavi almamış, diğerleri ise tedavi alan hastalardır. Tedavi alan hastalardan 47 tanesi kolşisin, 4 tanesi kolşisin ve steroid, 3 tanesi kolşisin ve imuran, 1 tanesi de kolşisin, imuran ve steroid kullanmaktadır. Tedavi sonucu hastalığın baskılanmasının, serbest radikal hasarını ve dolayısıyla idrar 8-izoPGF_2α düzeylerini baskılaması beklenir. Tip II diyabetli hastalarda metabolik kontrol sağlanması ile (19) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı olanlarda 14 günlük tedaviden sonra (43) artmış izoprostan düzeylerinin azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca Behçet’li hastalarda uygulanan tedavi sonucunda lipid peroksidasyon ürünlerinin düzeyinin düştüğü de gösterilmiştir (36, 44).

Iuliano ve arkadaşları antifosfolipid antikoru pozitif olan ve olmayan SLE’li hastalarda idrar 8-izoPGF_2α düzeylerini değerlendirerek 8-izoPGF_2α ile antifosfolipid antikor arasında ilişki olup olmadığını incelemek istemişlerdir. SLE’li hastaların idrar 8-izoPGF_2α düzeylerinin kontrol grubuna göre yüksek olduğunu ve bu yüksekliğin antifosfolipid antikor pozitif olanlarda daha sık olduğunu göstermişlerdir (21). Oysa bu çalışmada SLE’li hastaların idrar 8-izoPGF_2α düzeylerinin sağlıklı gönüllülerden farklı olmadığı aktif (n=4) ve inaktif (n=7) gruplar arasında farklılık olmadığı gösterildi. Çalışılan hasta sayısının azlığı ve antifosfolipid antikorların çalışmamızdaki hasta gruplarında değerlendirilmemiş olması, literatürdeki farklılığı açıklayabilir.

İzoprostanlar serbest radikal hasarının erken ortaya çıkan ve in vivo değerlendirilebilen bir göstergesi olması nedeniyle, çeşitli klinik durumlarda serbest radikal hasarının patolojiye katkısını değerlendirmek amacıyla kullanılabilecek bir kriter olarak görülmektedir. Yalnız bireylerarası varyasyonun yüksek olması bu değerlendirmede sorun yaratmaktadır. Bu nedenle fazla sayıda hasta ve sağlıklı gönüllü içeren çalışmalar, isoprostan düzeyi hakkında daha sağlıklı sonuçlar elde edilmesini sağlayacaktır.

5. KAYNAKLAR:

1. MORROW, J. D., HILL, K. E., BURK, R. F., NAMMOUR, T. M., BADR K. F., ROBERTS, L. J. (1990). A series of prostaglandin F₂-like compounds are produced in vivo in humans by a non-cyclooxygenase, free radical-catalyzed mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 9383-9387.
2. MORROW J. D., AWAD J. A., WU A., ZACKENT W. E., DANIEL V. C., ROBERTS L. J. 2nd (1996) Nonenzymatic free radical,catalyzed generation of thromboxane-like compounds (isothromboxanes) in vivo, J. Biol. Chem., 271:23185-23190.
3. HARRISON, K.A., MURPHY, R.C. (1995) Isoleukotrienes are biologically active free radical products of lipid peroxidation, J. Biol. Chem., 270: 17273-17278,.
4. MORROW J. D., AWAD J. A., BOSS H. J., BLAIR I. A., ROBERTS L. J. 2nd (1992) Non-cyclooxygenase derived prostanoids (F₂-isoprostanes) are formed in situ in phospholipids, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10721-10725,
5. SOUVIGNET, C., CRACOWSKI, J. L., STANKE-LABESQUE, F., BESSARD, G. (2000). Are isoprostanes a clinical marker for antioxidant drug investigation? Fundam. Clin. Pharmacol. 14 : 1-10.
6. PRATICO, D., ROSSI, E., MERLI, M., RIGGIO, O., FITZGERALD, G. A., VIOLI, F. (1998) Portal levels of the isoprostane iPF_2a-III, a marker of lipid peroxidation, do not correlate with increased portal pressure in cirrhoric patients. J. Invest. Med. 46: 430-434
7. LEO, A. M., ALEYNIK, S. I., SIEGEL, J. H., KASMIN, F. E., ALEYNIK, M. K., LIEBER, C. S. (1997) F₂-isoprostane and 4-hydroxynonenal excretion in human bile of patients with biliary tract and pancreatic disorders. Am. J. Gastroenterol. 92: 2069-2072
8. MALLAT, Z., NAKAMURA, T., OHAN, J., LESECHE, G., TEDGUI, A., MACLOUF, J., MURPHY, R. C. (1999) The relationship of hydroxyeicosatetraenoic acids and F₂-isoprostanes to plaque instability in human carotid atheroslerosis. J. Clin. Invest. 103: 421-427
9. PRATICO, D., LEE, V. M. Y., TROJANOWSKI, J. Q., ROKACH, J., FITZGERALD, G. A. (1998) Increased F₂-isoprostanes in Alzheimer’s disease: Evidence of enhanced lipid peroxidation in vivo. FASEB J. 12: 1777-1783
10. MONTINE, T. J., BEAL, M. F., CUDKOWICZ, M. E., O’DONNELL, H., MARGOLIN, R. A., MCFARLAND, L., BACHRACH, A. F., ZACKER W. E., ROBERTS, L. J., MORROW, J. D. (1999) Increased CSF F₂-isoprostanes concentration in probable AD. Neurology. 52: 562-565
11. MORROW, J. D., ROBERTS, L. J. (1999) Mass spectrometry of F₂-isoprostanes in biological fluids and tissues as measure of oxidant stress. Methods Enzymol. 300: 3-17
12. BACHI, A., ZUCCATO, E., BARALDI, M. FANELLI, R., CHIABRANDO, C. (1996) Measurement of urinary 8-epi-prostaglandin F_2a, a novel index of lipid peroxidation in vivo, by immunoaffinity extraction/gas chromatography-mass spectrometry. Basal levels in smoker and nonsmokers. Free Radic. Biol. Med. 20: 619-624
13. WANG, Z., CABATTONI, G., CREMINON, C., LAWSON, J., FITZGERALD, G. A., PATRONO, C., MADOUF, J. (1994) Immunological characterization of urinary 8-epi-PGF_2a excretion in man. J. Pharmacol. Exp. Ther. 275: 94-100
14. MORROW J. D., FREI B., LONGMIRE A. W., GAZIANO J. M., LYNCH S. M., SHYR Y., STRAUSS W. E., OATES J. A., ROBERTS L. J. 2nd (1995) Increase in circulating products of lipid peroxidation (F₂ isoprostanes) in smokers. Smoking as a cause of oxidative damage, N. Engl. J. Med., 332: 1198
15. REILLY M. P., PRATICO D., DELANTY N., DIMINNO G., TREMOLI E., RADER D., KAPOOR S., ROKACH J., LAWSON J., FITZGERALD G. A., (1998) Increased formation of distinct F2-isoprostanes in hypercholesterolemia, Circulation, 98: 2822-2828
16. REILLY M., DELANTY N., ROY L., ROKACH J., CALLAGHAN P. O., CREAN P., LAWSON J. A. (1997) Increased formation of the isoprostanes IPF_2α -I and 8-iso-PGF2a in acute coronary angioplasty: evidence for oxidant stress during coronary reperfusion in humans, Circulation, 96: 3314-3320,
17. REPINE J. E., BAST A, LANKHORST I. (1997) Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease, Am. J. Resp. Crit. Care Med., 156: 341
18. GOPAUL N. K., ANGGARD E. E., MALLET A. I., BETTERIDGE D. J., WOLFF S. P., NOUROOZ-ZADEH J. (1995) Plasma 8-epi-PGF_2α levels are elevated in individuals with non-insulin dependent diabetes mellitus, FEBS Lett., 368:225-229.
19. DAVI G., CIABATTONI G., CONSOLI A., MEZZETI A., FALCO A., SANTARONE S., PENNESE E., VITACOLONNA E., BUCCIARELLI T., CONSTANTINI F., CAPANI F., PATRONO C. (1999) In vivo formation of 8-iso-prostaglandin F_2α and platelet activation in diabetes mellitus. Effects of improved metabolic control and vitamin E supplementation. Circulation, 99: 224-229
20. PRATICO, D. AND DELANTY, N. (2000) Oxidative injury in the central nervous system-focus on Alzheimer’s disease, Am. J. Med. 109: 577-585

21. IULIANO L, PRATICO D, FERRO D, PITTONI V, VALESINI G, LAWSON J, FITZGERALD GA, VIOLI F. (1997) Enhanced lipid peroxidation in patients positive for antiphospholipid antibodies. Blood; 90: 3931

22. STEIN CM, TANNES SB, AWARD JA, ROBERTS LJ, MORROW JD. Evidence of free radical mediated injury (isoprostane overproduction) in scleroderma. Arthritis Rheum. 1996; 39: 1149

23. BASU, S., WHITEMAN, M., MATTEY, D.L AND HALIWELL (2001), B. Raised level of F2-isoprostanes and prostaglandin F2a in different rheumatic diseases. Ann. Rheum. Dis. 60: 627-631
24. OSHIMA, Y., SHIMIZU, T., YOKOHARI, R. ET AL. (1963), Clinical studies on Behçet’s syndrome. Ann. Rheum. Dis., 22: 36
25. BEHÇET, H., (1937) Über rezidivierende aphtöse, durc ein Virus verursachte Geschwüre am Mund, am Auge und an den Genitalien. Dermatol. Wochenschr, 105: 1152-1157
26. NIWA, Y.U., MIYAKE, S., SAKANE, T., SHINGU, M. AND YOKOYAMA, (1982) M. Auto-oxidative damage in Behçet’s disease-endothelial cell damage following the elevated oxygen radicals generated stimulated neutrophils, Clin. Exp. Immunol. 49: 247-255
27. PRONAI, L., ICHIKAWA, Y., NAKAZAWA, H. AND ARIMORI, S. (1991) Enhanced superoxide scavenging activity of peripheral blood leucocytes in Behçet’s disease-effects of colchicines. Clin. Exp. Rheumatol. 9: 227-233

28. TUTKAK H, YURTASLANI Z, TOKGÖZ G, AYDINTUĞ A.O, DÜZGÜN N, GÜRLER A. Superoxide dismutase activity of plasma, erythrocyte and lymphocytes(T,B) in patients with Behçet’s disease. In. Behçet’s Disease, Eds: Godeau P and Wechsler B, Elsevier Science Publishers B.V.

29. PRADELLES P., GRASSI J, MACLOUF J, (1985) Enzyme immünoassay of eicosanoids using AchE as label: An alternaive to RIA. Anal. Biochem. 57: 1170-1173.
30. KEHRER J. P. (1993) Free radicals as mediators of tissue injury and disease. Crit. Rev. Toxicol. 23 (1): 21-48.
31. JAMES D. W., WALKER J. R., SMITH J. D. (1979) Abnormal polymorphonuclear leucocytes chemotaxis in Behçet’s syndrome. Ann. Rheumatol. Dis. 38: 219-221
32. FUJITA Y., YAMADA M., ASAI K., MIMURA Y., (1984) Generation of superoxide radical by neutrophils in Behçet’s disease. Jpn. J. Opthalmol. 3: 221-226
33. PRONAI K., ICHIKAWA Y., NAKAZAWA H., ARIMORI S. (1990) Superoxide scavenging activity in rheumatoid arthritis and Behçet’s disease. Tokai J. Exp. Clin. Med. 15: 93-97.
34. PRONAI L., ARIMORI S. (1991) BD-104 enhances the decreased plasma superoxide scavenging activity in Behçet’s disease, Sjögren’s syndrome or hematological malignancy. Biotherapy 3: 365-371
35. DOĞAN P., TANRIKULU G., SOYUER Ü., KÖSE K., (1994) Oxidative enzymes of polymorphonuclear leucocytes and plasma fibrinojen, ceruloplasmin and copper levels in Behçet’s disease. Clin. Biochem. 27: 413-418.
36. KÖSE K., DOĞAN P., AŞÇIOĞLU M., AŞÇIOĞLU Ö. (1997) In vitro antioxidant effect of ginkgo biloba extract (Egb 761) on lipoperoxidation induced by hydrogen peroxide in erythrocytes of Behçet’s patients. Jpn. J. Pharmacol. 75: 253-258.
37. MONTINE T. J., MARKERSBERY W. R., MORROW J. D., ROBERTS L. J. II (1998). Cerebrospinal fluid F₂ isoprostane levels are increased in patients with Alzheimer’s disease. Annals Neurol. 44: 410-413
38. TUPPO E. E., FORMAN L. J., SPUR B. W., CHAN- TING R. E., CHOPRA A., CAVALIERI T. A. (2001) Sign of lipid peroxidaion as measured in the urine of patients with probable Alzheimer’s disease. Brain Res. Bull. 54(5): 565-568
39. MONTINE T. J., QUINN J. F., MILATOVIC D., SILBERT L. C., DANG T., SANCHEZ S., MORROW J. D. (2002) Peripheral F₂ isoprostanes and F₄ neuroprostanes are not increased in Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 52(2): 175-179.
40. DAVI G., CHIARELLI F., SANTILLI F., POMILIO M., VIGNERI S., FALCO A., PATRONO C. (2003). Enhanced lipid peroxidation and platelet activation in the early phase of type I diabetes mellitus. Circulation. 107(25): 3199-3203.
41. VESSBY J., BASU S., MOHSEN R., BERNE C., VESSBY B. (2002) Oxidative stress and antioxidant status in type I diabetes mellitus. J. Intern. Med. 251(1): 69-76
42. O’BRYNE S., FORTE P., ROBETRS L. J. II, MORROW J. D., BENJAMIN N. (2000). Nitric oxide synthesis and isoprostane production in subjects with type I diabetes mellitus and normal urınary albumin excretion. Diabetes 49(5): 857-862.
43. PRATICO D., BASILIS S., VIERI M., CORDOVA C., VIOLI F., FITZGERALD G. A. (1999). Chronic obstructive pulmonary disease is associated with an increase in urinary levels of isoprostane F_2α-III , an index of oxidant stress. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 26: 656-660
44. KOKCAM I, NAZIROGLU M. (2002). Effects of vitamin E supplementation antioxidants levels in patients with Behcet’s disease. Clin. Biochem. 35: 633-639

6. EKLER:

a) Mali Bilanço ve Açıklamaları:

Proje bütçesinde gelir toplamı 4,250,465,000 TL’sıdır. Bütçede sunulduğu şekilde 300 No’lu fasıldan 570,800,000 TL, 400 No’lu fasıldan 3,571,972,797 TL; toplam 4,142,772,797 TL harcanmış olup kalan miktar 107,692,203 TL’sıdır.

b) Makine ve Teçhizatın Konumu ile İlerideki Kullanıma Dair Açıklamalar

Proje ile makine ve teçhizat alınmamıştır.

c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar

Yoktur.

d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar)

Yoktur.

e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler

Yoktur.