T.C.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
ARAŞTIRMA FONU
PROJESİ
KESİN RAPORU
|
SIĞIR EMBRİYOLARININ
GLUTATHIONE (GSH) VE SUPEROXIDE DISMUTASE (SOD) İÇEREN
MEDİUMLARDA İN VİTRO ÜRETİMİ Yrd.Doç.Dr.Ongun UYSAL
2001-08-10-032 01.06.2001 30.06.2002
09.10.2002 |
Ankara Üniversitesi
Araştırma Fonu Müdürlüğü
Ankara - 2002
1-PROJENİN İNGİLİZCE , TÜRKÇE ADI VE ÖZETİ
EFFECT OF ANTIOXIDANTS ON INVITRO
PRODUCTION OF BOVINE
EMBRYOS
(Sığır Embriyolarının İnvitro
Üretimi Üzerine Antioksidantların Etkisi)
ABSTRACT
This research was carried out to
determine the effect of addition to medium with GSH and SOD combined in
different phases of the in vitro fertilization procedure on development of
bovine embryos to morula/blastocyst stage.
In this study, totally 1494
cumulus-compact oocytes were collected from 421 ovariums.The highest maturation
rates(96.65% and 95.77%) were recorded in maturation medium(TCM-199) added of
combined GSH(1mM) and SOD(1500 IU/ml) and significantly higher than those of
added only IVF(85.83%) and only IVC(85.14%) mediums(P<0.001) compared to
control group(86.35%).
With addition of combined GSH and
SOD to only IVF(76.05%) medium(TALP) or IVC(73.71%) were obtained significantly
higher fertilization rates than the other groups(P<0.001).But fertilization
rates in medium with only SOD throughout IVMFC and in control group were recorded
significantly lower than the other treatment groups(P<0.001).
Significant improvements in
proportion morulae and blastocyst development of embryos(27.86%) were achieved
when GSH was added to medium.The
addition of combined
GSH and SOD to IVM or IVMC medium was improved development of
bovine embryos to morulae/blastocyst stage, but there was no differences among
groups statistically(P>0.005).
These datas suggest that bovine
embryos are sensitive to oxidative stress and that medium supplementation with
the radical scavenger reduced glutathione or combined GSH and SOD can improve
embryo development in vitro.
Key words:Antioxidants, Bovine
embryo, Development, Glutathione, In vitro fertilization, Superoxide
dismutase.
ÖZET
Bu çalışma, in vitro
fertilizasyon prosedürünün farklı aşamalarında GSH ve SOD’nin kombine
edilerek mediumlara eklenmesinin ,
bovine embriyolarının morula/blastosist safhasına gelişimi üzerine etkisini
saptamak amacıyla yapılmıştır.
Bu çalışmada, toplam 421
ovaryumdan 1494 cumulus-compact oosit
elde edilmiştir.En yüksek maturasyon oranları(%96.65 ve %95.77) kombine edilmiş
GSH(1mM)
ve SOD(1500 IU/ml) eklenmiş maturasyon mediumunda(TCM-199)
kaydedildi , yalnızca IVF(%85.83) ve
IVC(%85.14) mediumlarına eklenenlerden ve kontrol grubundan (%86.35) önemli
ölçüde daha yüksek oldu(P<0.001).
Kombine
edilmiş GSH ve SOD’nin yalnızca IVF(%76.05) veya IVC(%73.71) mediumlarına
eklenmesi ile diğer gruplardan önemli ölçüde daha yüksek fertilizasyon oranları
elde edildi(P<0.001).Fakat tüm prosedür boyunca yalnızca SOD’nin eklendiği
mediumda ve kontrol grubundaki fertilizasyon oranları diğer gruplardan önemli
ölçüde daha düşük kaydedildi(P<0.001).
Embriyoların
morula ve blastosiste gelişme oranlarında, mediuma GSH eklendiğinde(%27.86)
önemli ilerlemeler kaydedildi.Kombine edilmiş GSH ve SOD’nin IVM ve İVMFC
mediumuna eklenmesi sığır embriyolarının morula ve blastosist safhasına
gelişimini artırdı, ancak istatistik olarak gruplar arası farklılıklar önemsiz
bulundu(P>0.05).
Bu veriler sığır embriyolarının
oksidatif streslere duyarlı olduğunu ve radikal parçalayıcı glutathione ve
kombine edilmiş GSH ve SOD’nin mediuma
eklenmesinin in vitro embriyo gelişimini artırabildiğini göstermiştir.
Anahtar Kelimeler:Antioksidantlar,
Sığır embriyosu, Gelişim, Glutathione, İn vitro fertilizasyon,Superoxide dismutase.
II-AMAÇ VE KAPSAM
Bütün canlılarda üreme olgusu fertilizasyon denilen temel mekanizma üzerinde gerçekleşmektedir.Bu mekanizma dişi gameti olan oosit ve erkek gameti olan spermatozoanın füzyonu ve bunun sonucunda zygot denilen yapının oluşmasıdır.Başlangıçta ovulasyona yakın olan Graff follikülünden veya ovulasyon sırasında ovaryumdan alınan ovumun kapasite olmuş spermatozoa ile uygun ortamda inkubasyona bırakılması ile yapılan in vitro fertilizasyon olayı günümüzde geliştirilen in vitro kapasitasyon ve in vitro oosit maturasyonu yöntemleri sayesinde tamamen canlı hayvanlardan bağımsız olarak yapılabilmektedir.Son yıllarda memelilerdeki in vitro fertilizasyon çalışmalarında dikkate değer gelişmeler olmuştur.Memeli oositlerinin dişi genital organı dışında fertilize edilebilmesi uygun prosedürler gerektirmektedir.
Ayrıca bu konuda yürütülen çalışmalar henüz tamamlanmadığı gibi, başarıyı artırmak için daha pek çok araştırma yapılması gerekmektedir.Dolayısıyla bu proje in vitro üretimin her aşamasında karşılaşılan bir problemi çözmeye yönelik hazırlanmış ve İVM, İVF ve İVC aşamalarında mediumlara katılacak bazı kimyasallarla, oositlerin in vitro fertilizasyonu ile morula ve blastosist evrelerine ulaşmalarındaki başarının yükseltilmesine çalışılmış ve bu konuda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir.
Damızlık değerini yitirmiş veya çeşitli nedenlerden dolayı damızlıktan zorunlu olarak çıkarılmış ineklerden in vitro üretim yöntemleri sayesinde kesim sonrasında da yavru alınabilme olanağı bulunmaktadır.Yöntem sadece kesim sonrası elde edilen ovaryumlardan değil, aynı zamanda canlı hayvanların ovaryumlarında bulunan antral folliküllerden ultrasaund önderliğinde, follikül içeriğinin aspire edilmesiyle kazanılan primer oositlere de uygulanmaktadırBöylece değerli damızlıkların ömürleri boyunca verebilecekleri maksimum 5-6 adet yavru sayısının 20-30’a çıkartılması, hatta kesimden sonra alınacak ovaryumlardan kazanılan oositlerde bu sayının 50’ye kadar yükseltilmesi mümkün olabilacektir.Buna paralel olarak bu araştırmanın hedefi ekonomik değerini kaybetmiş olan hayvanlardan elde edilen oositlerin, in vitro fertilizasyonu yoluyla, sığır embriyolarının üretilmesini sağlamaktır.Bu kapsamda bu çalışma, bir embryo için in vivo ve in vitro çevre arasındaki başlıca farklılıklardan birinin oksijen metabolizmasından kaynaklanan reaktif oksijen türlerinin(superoxide radikalleri,O2-, hydroxyl radikalleri,-OH ve hydrogen peroxide,H2O2) zararlı etkilerinden(enzimlerin inaktivasyonu, membran lipidlerinin peroxidasyonu ve DNA değişimleri) korunması gerektiği ve ayrıca embriyoların kültürü aşamasında bölünmelerin blokajının bu şekilde önlenebileceği düşüncesinden yola çıkılarak oluşturulmuştur.
O nedenle İVM, İVF ve İVC mediumlarına, fonksiyonlarını reaktif oksijen türlerini elimine ve detoksifiye ederek gösteren antioksidan maddelerin etkileri bu çalışma ile değerlendirilmiş ve çalışmanın sonucunda elde edilen verilerden antioksidant maddelerin in vitro embriyo üretiminde, maturasyonu, fertilizasyonu ve embriyoların morula ve blastosist safhasına ilerlemelerini önemli ölçüde geliştirdiği gözlenmiştir.
III-MATERYAL VE YÖNTEM
Çalışmada kullanılan kimyasallar Sigmadan alındı.Epidermal Growth Factor(EGF;
E-1264, 10 microgram/ml), LH(5mg/ml), FSH(10 mg/ml), Sodium pyruvate(P-5280; 20mM, 2.2 mg/ml),Heparin(H-3393; 1 mg/ml), Estradiol(E-4389; 1 mg/ml)’ün stok solusyonları hazırlandı, dozlanarak –20o C da kullanılıncaya kadar saklandı.Denemeler mineral yağ altındaki mediumlarda ve %5 CO2, %5 O2 ve %90 N2 bulunduran %97 nemlendirilmiş inkubatör koşullarında yürütüldü.
Oositlerin Elde Edilmesi ve İn Vitro
Maturasyon
Mezbahada
kesilen ineklerin ovaryumları 30-33o C’ daki fizyolojik tuzlu suda
(%0,9 NaCl) 2 saat içinde laboratuvara
getirildi .Ovaryumlar üzerinde 2-
Sıvısı, 3 mg/ml Bovine Serum Albumine(BSA,fraction V;A-9647) içeren Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline(PBS; D-5773) ile yıkanarak toplandı.Elde edilen kumulus oosit kompleksleri sınıflandırıldı ve kompakt kumuluslu ve homojen ooplazmaya sahip oositler, denemeler için seçilerek ayrıldı.Kumulus oosit kompleksleri 3 mg/ml BSA içeren PBS ve maturasyon mediumu(Tissue Culture Medium 199) ile ikişer kez yıkandı.İn vitro maturasyon mediumu(TCM-199; M-5017), sodium bikarbonate(K-13781023; Merck, 2.2 mg/ml), sodium pyruvate(P-5280; 10 microlitre/ml), penicillin-streptomisin(P-0906; 100 IU, 100 microlitre/ml) FCS(F-9665; 0.1 ml/ml) and Estradiol(1 microlitre/ml), Epidermal Growth Factor(EGF; 0.1 ml/20 ml) ile desteklenmiş Earle tuzlu TCM-199 dan ibarettir.Yıkama işleminden sonra 10’ar adet kumulus oosit kompleksi her biri 100 microlitre olan dropları içine alındı ve mineral altında CO2’li inkubatörde 24 saat in vitro maturasyona bırakıldı.
Spermanın Hazırlanması
Çalışmada dondurulmuş boğa sperması kullanıldı.BSA(0.124 gr/ml), sodium pyruvate(10 microlitre/ml) ve penicilline-streptomisin(100 İU; 100 microgram/ml) ile desteklenmiş 1.5 ml Sperm-TALP bulunduran bir test tüpünün dibinde 200 microlitre çözülmüş sperma tabakalandırıldı ve spermatozoonlara 39oC daki inkubatör koşullarında 1 saat swim-up işlemi uygulandı.Bu sürenin sonunda test tüpünün üstünde spermatozoonları bulunduran süpernatandan 1 ml başka bir tüpe alınarak santrifüj yapıldı(250g, 10 dakika).Supernatant uzaklaştırıldıktan sonra pellet kısım 200 microlitre sperm-TALP’ le yeniden sulandırılıp, hemositometrik yöntemle yoğunluğu saptandı.
İn vitro Fertilizasyon
Maturasyondan sonra, kumulus expanse oositler İVF-TALP’ le iki kez yıkanıp PHE(0.01 ml/ml), heparin(0.03 ml/ml), sodium pyruvate(0.0125 ml/ml), BSA(3 mg/ml), penicilline-streptomisin(100 IU, 100 microgram/ml) ile desteklenmiş 97 microlitre in vitro fertilizasyon droplarına 10'ar adet aktarıldı.Herbir İVF dropunda final konsantrasyonu 100X103 spermatozoon olacak şekilde mature oositler tohumlandı ve mineral yağ altında, CO2’li inkubatörde 18-20 saat fertilizasyona bırakıldı.
İn vitro Kültür
Fertilizasyondan sonra, kompleksler sodium pyruvate(1 microlitre/ml), BSA(3 mg/ml), penicillin-streptomisin(100 İU, 100 microgram/ml) ile desteklenmiş kültür mediumu(TCM-199) ile iki kez yıkandı, kumulus hücreleri pipetleme yöntemi ile uzaklaştırıldı.100 microlitrelik kültür droplarına alınan zygotlar(10 zygot/drop) %5O2, %5CO2, %90N2 ve %97 nemlendirilmiş inkubatör koşullarında 8 gün inkubasyona bırakıldı ve medium 48 saatte bir değiştirildi.Embriyoların gelişme safhaları 6,7 ve 8. Günlerde morula/blastosist safhasına ulaşana kadar embriyoların kültür periyodu boyunca invert mikroskopta bölünmeleri izlendi ve sayıları kaydedildi.
Çalışma planı
İn vitro sığır embriyosu üretiminin farklı safhalarında, GSH ve/veya SOD eklenmesinin, embriyo gelişimi üzerine etkisi dört farklı deneme ile ortaya konmaya çalışıldı.
denemede; kombine edilmiş
İN VİTRO MATURASYON MEDİUMU(STOK)
TCM-199(stok) 18 ml
Fetal Calf Serum(FCS) %10
Sodium pyruvate(20mM stok) 0.25mM
LH 10 microgram/ml
FSH 10 microgram/ml
Estradiol 1 microgram/ml
EGF(10 microgram/ml stok) 50 ng/ml
Penicilline-streptomisin 100 İU(100 microgram/ml)
TALP(STOK)
NaCl 3.33 gr
KCl 0.1175 gr
NaHCO3 1.052 gr
NaH2PO4H2O 0.0240 gr
CaCl2.2H2O 0.15 gr
MgCl2.6H2O 0.05 gr
Penicilline-streptomisin 100 İU(100microgram/ml)
Saf su 500 ml
SPERM-TALP(Swim-up için)
TALP(stok) 40 ml
BSA 3 mg/ml
Sodium
pyruvate
Penicilline-streptomisin 100 İU(100microgram/ml)
İN VİTRO FERTİLİZASYON
MEDİUMU(TALP)
TALP(Stok) 40 ml
Penicillamine(10mM
stok)
Hypotaurine(10mM
stok)
Epinefrine(1mM
stok)
Sodium
pyruvate(20mM stok)
BSA 3 mg/ml
Heparine(1mg/ml stok) 30 microgram/ml)
Penicilline-streptomisine 100 IU(100microgram/ml)
İN VİTRO KÜLTÜR MEDİUMU
TCM-199 50 ml
BSA 3mg/ml
Penicilline-streptomisin 100 IU(100microgram/ml)
ANTİOXİDANTLAR
Glutathione(GSH) 1mM
Superoxide Dismutase(SOD) 1500 IU/ml
IV-ANALİZ VE BULGULAR
Çalışmanın sonucunda elde edilen veriler Tablo 1,2,3,4,5,6,7, 8 de ve Resim 1,2,3,4,5,6 da gösterilmiştir.Deneme grupları arasındaki farklılıklar, istatistik yöntemlerinden X2 testi ile ortaya konmuştur.Kombine edilmiş GSH ve SOD veya yalnızca GSH ile desteklenmiş maturasyon mediumlarında oositlerin maturasyon oranları(%96.65, %95.77 ve %94.34), kombine edilmiş GSH ve SOD ile yalnızca İVF veya İVC mediumunun desteklendiği ya da İVMFC boyunca yalnızca SOD katılan ve kontrol grubundan (%85.83, %85.14 ve %86.76) önemli ölçüde daha yüksek bulundu(P<0.001).Kombine edilmiş GSH ve SOD’nin yalnızca İVF veya İVC droplarında bulunması durumunda, oositlerin fertilizasyon oranları en yüksek değere ulaştı(%76.05 ve %73.71).Bu değerlar diğer gruplardakinden önemli ölçüde daha yüksek kaydedildi(P<0.001).Fakat kontrol grubuyla(%53.12) SOD’li grup(%57.25) arasında fertilizasyon oranları yönüyle önemli bir farklılık gözlenmedi(P>0.05).Tohumlanan oositlerin morula ve blastosist safhasına gelişme oranının, in vitro üretimin her aşamasında GSH’nın bulunması durumunda arttığı saptandı.En düşük
blastosist formasyon oranı antioksidanların olmadığı kontrol grubunda gözlendi ve gruplar arasında önemli bir farklılık bulunmadı.
|
Ovaryum sayısı |
Seçilmiş oositler n |
Mature olmuş oositler n % |
Fertilize(bölünmüş) oositler n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma n % |
|||
|
55 |
330 |
319 |
96.65 |
202 |
63.28 |
51 |
25.28 |
Tablo 2.İVMFC Boyunca GSH(1mM) Eklenmesinin Sığır Embriyoları
Gelişimine Etkisi
|
Ovaryum sayısı |
Seçilmiş oositler |
Mature olmuş oositler n % |
Fertilize(bölünmüş) oositler n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma n % |
|||
|
86 |
287 |
270 |
94.34 |
182 |
67.17 |
50 |
27.86 |
Etkisi
|
Ovaryum sayısı |
Seçilmiş oositler |
Mature olmuş oositler n % |
Fertilize(bölünmüş) oositler n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma n % |
|||
|
107 |
305 |
265 |
86.76 |
152 |
57.25 |
29 |
19.14 |
Tablo 4.Sığır Oositlerinin İn Vitro Maturasyonunda Kombine Edilmiş GSH ve SOD’nin
Etkisi
|
Ovaryum sayısı |
Seçilmiş oositler |
Mature olmuş oositler n % |
Fertilize(bölünmüş) oositler
n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma n % |
|||
|
56 |
297 |
285 |
95.77 |
188 |
65.24 |
49 |
26.53 |
Tablo 5.Sığır
Oositlerinin İnVitro Fertilizasyonunda
Kombine Edilmiş GSH ve
SOD’nin Etkisi
|
Ovaryum sayısı |
Seçilmiş oositler |
Mature olmuş oositler n % |
Fertilize(bölünmüş oositler n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma
n % |
|||
|
110 |
270 |
231 |
85.83 |
186 |
76.05 |
44 |
22.96 |
|
Ovaryum sayısı |
Seçilen oositler |
Mature olmuş Oositler n % |
Fertilize(bölünmüş) oositler n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma n % |
|||
|
110 |
260 |
222 |
85.14 |
164 |
73.71 |
36 |
21.78 |
Tablo 7.Antioksidant
Eklenmeyen İVMFC Koşullarında Sığır Embriyolarının İn Vitro
Üretimi
|
Ovaryum sayısı |
Seçilmiş oositler |
Mature olmuş oositler n % |
Fertilize(bölünmüş) oositler n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma n % |
|||
|
90 |
330 |
286 |
86.35 |
148 |
53.12 |
25 |
16.64 |
Table 8.Sığır
Embriyolarında İn Vitro Üretimin Farklı Aşamalarındaki Antioksidant
Etkilerinin Genel Ortalamaları
|
Antioxidant |
İn vitro üretimin fazları |
Ovaryum sayısı n |
Seçilmiş oositler n |
Mature olmuş oositler n % |
Fertilize(bölünmüş) oositler n % |
Morula ve Blastosiste ulaşma n % |
|||
|
GSH |
IVMFC |
86 |
287 |
270 |
94.34 a |
182 |
67.17 b |
50 |
27.86 - |
|
SOD |
107 |
305 |
265 |
86.76 b |
152 |
57.25 d |
29 |
19.14 - |
|
|
Kombine edilmiş GSH ve SOD |
55 |
330 |
319 |
96.65 a |
202 |
63.28 a |
51 |
25.28 - |
|
|
IVM |
56 |
297 |
285 |
95.77 a |
188 |
65.24 ab |
49 |
26.53 - |
|
|
IVF |
110 |
270 |
231 |
85.83 b |
186 |
76.05 c |
44 |
22.96 - |
|
|
IVC |
110 |
260 |
222 |
85.14 b |
164 |
73.71 c |
36 |
21.78 - |
|
|
Antioksidansız |
Kontrol |
90 |
330 |
286 |
86.35 b |
148 |
53.12 d |
25 |
16.64 - |
a,b,c,d,ab : (P<0.001) Aynı sütunda farklı harfleri taşıyan grup ortalamaları arası fark önemli
- : (P>0.05) Grup ortalamaları arası fark önemsiz
Resim 1:Kumulus Kompakt Oositler
Resim 2:Kumulus Ekspanded Oositler
Resim 3:Bölünmüş Oositler
Resim 4:Morula
Resim 5:Blastosist
Resim 6:Hatching Blastosist
V-SONUÇ VE ÖNERİLER
Bu çalışma Türkiye’de ilk olması ile orijinal bir araştırmadır.İn vitro embriyo üretiminde başarı oranını artırmaya yönelik antioksidan maddelerin kullanılmaya başlanması dünyada da yenidir ve üzerinde en çok çalışılan konulardan biridir.
Söz konusu çalışma ile in vitro koşullarda embriyo gelişimini olumsuz etkileyen en önemli faktörlerden biri olan, oksidatif strese karşı ortama katılan antioksidanlar yoluyla oositlerin korunması başarılmıştır.Bu araştırmada serbest radikallerin oositler/spermatozoa/embriyolar üzerine yaptığı zararlı etkilerden korunmak amacıyla kombine edilmiş GSH ve SOD ile tek başına kullanılan GSH’nın diğer uygulamalardan daha başarılı olduğu ve daha yüksek morula/blastosist formasyon oranı elde edildiği saptanmıştır.
Ancak bu çalışmanın devamı olarak, benzer veya farklı antioksidantların kullanılması ayrıca değişik kombinasyon ve dozlar uygulanması ile morula/blastosiste ulaşma oranını yükseltmeye yönelik araştırmaların sürdürülmesi gerekmektedir.
VI-KAYNAKLAR
1.
Batt,P.A.;Gardner,D.K.;Cameron,A.W.N.(1991):Oxygen
concentration and protein source
affect the
development of preimplantation goat embryos in vitro.Reprod Fertil Dev, 3:601-
607.
2.
Nakayama,T.,Noda,Y.;Goto,Y.;Mori,T.(1994):Effects of
visible light and other environmental factors on the production of oxygen
radicals by hamster embryos.Theriogenology.41:499-510.
3.
Griveau,J.F.;Lannou,D.Le(1997):Reactive oxygen species
and human spermatozoa:physiology and pathology.Int J Androl.20:61-69.
4.
Legge,M.;Sellens,M.H.(1991):Fre3e radical scavengers
ameliorate the 2-cell block in mouse embryo culture.Hum Reprod.6:867-871.
5.
Caamano,J.N.;Ryoo,Z.Y.;Thomas,J.A.;Youngs,C.R.(1996): b-mercaptoethanol enhances
blastocyst formation rate of bovine in vitro matured, in vitro fertilized embryos.Biol.Reprod.55:1179-1184.
6.
Perreault,S.D.(1999):Regulation of sperm nuclear
reactivation during fert,ilization.In:Bavister B, Cummins J, Roldan
ERS(eds).Fertilization in Mammals.Proc Int Symp Fertil Mamm, Serono Symposia;
285-296.
7.
Mazur,P.(1984):Freezing of living cells; mechanisms
and implications.Am J Physiol, 247:C125-142.
8.
Noda,Y.;Matsumoto,H.;Umaoka,Y.;Tatsumi,K.;Kishi,J.;Mori,T.(1991):Involvement
of superoxide radicals in mouse two-cell
block.Mol Reprod Dev, 28:356-360.
9.
Grivieu,J.F.;Renard,P.;Le Lannon,D.(1995):Superoxide
anion production by human spermatozoa as a part of the ionophore-induced
acrosome reaction process.Int J Androl, 18:67-74.
10. Miesel,R.;Drzejczak,P.J.E.;Kurpisz,M.(1993):Oxidative
stress during the interaction of gametes.Biol Reprod, 49:918-923.
11. Chun,Y.S.;Kim,J.H.;Lee,H.T.;Chung,K.S.(1994):Effect
of superoxide dismutase on the development of preimplantation mouse
embryos.Theriogenology, 41:511-520.
12. Gardiner,C.S.;Reed,D.J.(1995):Synthesis
of glutathione in the preimplantation mouse
embryo.Arch
Biochem Biophys.318:30-36.
13. Nonogaki,T.;Noda,Y.;Narimoto,K.;Umaoka,Y.;Mori,T.(1992):Effects
of superoxide dismutase on mouse in vitro fertilization and embryo culture
system.J Assist Reprod Genet.9:274-280.
14. Yoshida,M.(1993):Role of Glutathione in the maturation
and fertilization of pig oocytes
in
vitro.35:76-81.
15. Blondin, P;
Coenen, K.;Sirard, M.A. (1997):The impact of reactive oxygen species on
bovine sperm
fertilizing abilitiy and oocyte maturation. J.Androl. 4:454-460.
16. De matos;
D.G.; Furnus, C.C. (2000): The importance of having high glutathione (GSH)
level after bovine in vitro maturation on embryo development effect of Beta-mercaptoethanol, cysteine,and cystine.
Theriogenology 53:761-771.
17. Luvoni,G,C.;Keskintepe,L.;Brachett,B.(1996):
Improvement in bovine embryo production in vitro by glutathione containing
culture media. Mol. Reprod. Rev. 13:137-143
18. Sutovsky,P.;Schatten,G.(1997):Depletion
of Glutathione during bovine oocyte maturation reversibly blocks the
decobndensation of the male pronucleus and pronuclear apposition during
fertilization.Biol Reprod, 56:1503-1512.
19. Boguest,A.C.;Abeydeera,W.H.;Day,W.B.N.(1999):Effect
of adding reduced glutathione during insemination on the development of porcine
embryos in vitro.Theriogenology,51:1311-1319.
20. Van
Langendonckt; Morales,H.;Massip,A.;Dessy,F.(1998):Effect of hydrogen peroxide
on in vitro development of bovine embryos.Theriogenology,49:221,abstr.
VII-EKLER
a-Mali Bilanço ve Açıklamaları
Kimyasal madde, enjektör filtre,
pastör pipeti, petri, saydam uç:4.570.845.000
Kırtasiye
: 127.155.000
Fotokopi
: 145.000.000
Benzin
: 1.500.000.000
6.343.000.000
e-Yayınlar(hakemli bilimsel dergiler) ve
tezler
Araştırma makalesi yayınlanmak üzere Indian Veterinary Journal dergisine gönderildi.