T.C.

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

KESİN RAPORU

SIÇANLARDA AKUT İNFLAMASYON MODELİNDE İZOPROSTANLARIN VE PROSTAGLANDİN E₂’NİN OLUŞUMU İLE SİKLOOKSİJENAZ İNHİBİTÖRLERİNİN VE ANTİOKSİDAN AJANLARIN BU OLUŞUM ÜZERİNE ETKİLERİ

Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Mehmet Melli

Proje Numarası: 2002-08-09-087

Başlama Tarihi: 01.10.2002

Bitiş Tarihi: 01.10.2003

Rapor Tarih: 13.10.2003

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara - 2003

KISALTMALAR

8-izoPG_2α	8-izoprostaglandin F_2α
COX	Siklooksijenaz
EİA	Enzim immünoassay
F₂-İzoP	F₂-İzoprostanlar
HPLC	Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi
izoP	İzoprostan
LDL	Düşük dansiteli lipoprotein
LPS	Lipopolisakkarit
GC/MS	Gaz Kromatografi/Kütle spektrometri
PG	Prostaglandin
TBARS	Tiobarbitürik asit reaktif bileşikleri
Tx	Tromboksan
vit E	Vitamin E

ÖZET

Sıçanlarda Akut İnflamasyon Modelinde 8-izoprostaglandin F₂_a’nın ve Prostaglandin E₂’nin Oluşumu ile Siklooksijenaz İnhibitörlerinin ve Vitamin E’nin Bu Oluşum Üzerine Etkileri

İzoprostanlar, serbest radikallerin indüklediği arakidonik asit gibi poliansatüre yağ asitlerinin, nonenzimatik peroksidasyonu ile oluşan ürünlerdir. İzoprostanların ölçümü oksidatif hasarın erken ortaya çıkan, selektif ve spesifik göstergesi olarak kabul edilmektedir. Sıçanlarda, 8-izoPGF_2α’nın inflamasyondaki rolünü araştırmak için, karagenin hava kesesi inflamasyon modelinde toplanan eksudada, EİA yöntemiyle 8-izoPGF_2α ve PGE₂ düzeyleri, eksuda hacmi ve lökosit sayısı değerlendirildi. Bu modelde, eksudada 8-izoPGF_2α düzeyinin arttığı görüldü. Bu artışın, klasik inflamatuvar yanıta mı, yoksa COX indüksiyonuna mı bağlı olduğunu araştırmak amacıyla, inflamatuvar yanıt olmaksızın sadece COX-2 indüksiyonunun oluştuğu bilinen, LPS hava kesesi modelinde de 8-izoPGF_2α düzeylerinin arttığı gösterildi. 8-izoPGF_2α’nın enzimatik oluşumunu değerlendirmek amacıyla, karagenin hava kesesi modelinde, nonselektif COX-1 inhibitörü indometazin 0,5 mg/kg ve 5 mg/kg, selektif COX-1 inhibitörü valeril salisilat 20 mg/kg ve selektif COX-2 inhibitörü SC 58236 10, 20 ve 40 mg/kg; LPS hava kesesi modelinde ise SC 58236 aynı dozlarda uygulandı. Her iki modelde de bu inhibitörlerin 8-izoPGF_2αdüzeylerini azalttığı gösterildi. Bu bulgular ile 8-izoPGF_2α oluşumunun hem COX-1 hem de COX-2 indüksiyonu ile olabileceği sonucuna varıldı. Karagenin ve LPS hava kesesi modellerinde oluşan 8-izoPGF_2α’ya 21 gün süreyle verilen vitamin E uygulamasının etkisi değerlendirildi ve vit E’nin her iki modelde de oluşan 8-izoPGF_2α’yı inhibe ettiği gösterildi. Bu bulgular, serbest radikal hasarı ve COX indüksiyonuyla 8-izoPGF_2αoluşumunun, vitamin E tarafından önlendiğini göstermektedir.

ANAHTAR KELİMELER: Deneysel inflamasyon modelleri, COX-2 indüksiyonu, vitamin E, 8-izoPGF_2α.

SUMMARY

Investigation of occurence of 8-isoprostaglandin F₂_a and prostaglandin E₂ in experimental inflammation model and effect of cyclooxygenase inhibitors and vitamin E on the occurence of these metabolites

Isoprostanes are prostaglandin isomers that are generated from non-enzymatic peroxidation of polyunsaturated fatty acids like arachidonic acid via a free radical-catalyzed mechanism. Measurement of isoprostanes can provide a sensitive and specific assesment of early oxidative damage of tissues. To investigate a possible role of 8-isoPGF₂_a in inflammation, 8-isoPGF₂_a and PGE₂levels were determined by EIA method, exudate volume and the leucocyte count were also measured in carrageenan induced air pouch inflammation model in rats. In this model, 8-isoPGF₂_alevels were found increased. To eveluate whether this increase is due to development of inflammation or COX induction, LPS-induced air pouch model, in which only COX-2 induction occurs without inflammation, was used. In this model 8-isoPGF₂_alevels were also found increased. Formation of 8-isoPGF₂_a was investigated in carrageenan-induced air pouch inflammation model by administrating non selective COX-1 inhibitor, indomethacin in doses of 0,5 and 5 mg/kg, selective COX-1 inhibitor valeryl salicilate 20 mg/kg and selective COX-2 inhibitor SC 58236 in doses of 10, 20, and 40 mg/kg; and in LPS-induced air pouch model by administrating SC 58236 in the same doses. In both of these models, these inhibitors inhibited 8-isoPGF₂_a levels. These findings indicate that 8-isoPGF₂_a can form by both COX-1 and COX-2 induction. The effect of vitamin E pretreatment for 21 days on 8-isoPGF₂_a formation was also evaluated in carrageenan and LPS-induced air pouch models and it was found that vitamin E inhibited 8-isoPGF₂_alevels in both models. These findings indicate that increased levels of 8-isoPGF₂_a,formed by both COX induction and free radical damage, decrease with vitamin E pretreatment.

KEY WORDS: Carrageenan-induced air pouch inflammation model, COX-2 inductions, vitamin E, 8-isoPGF₂_a.

1. AMAÇ VE KAPSAM

İzoprostanlar (izoP) serbest radikallerin indüklediği arakidonik asit gibi poliansatüre yağ asitlerinin nonenzimatik peroksidasyonu ile oluşan ürünlerdir. İn vitro oluşumları ilk kez Pryor ve ark. (1976) ile Porter ve ark.(1975) tarafından poliansatüre yağ asitlerinin oksidasyonu ile gösterilmiştir (Pryor ve ark., 1976; Porter ve ark., 1975). İnsanlarda in vivo oluşumları ise ilk defa 1990’da Morrow ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir (Morrow ve ark., 1990). Bu tarihten itibaren izoprostanların in vitro ve in vivo lipid peroksidasyonunun sensitif ve spesifik göstergesi olduğunu gösteren birçok kanıt bulunmuştur. İzoprostanlar serbest radikallerin katalizlediği arakidonik asit ürünleri olup, prostaglandinlerin kimyasal olarak stabil, yapısal izomerleridir. İzoprostanlar ve prostaglandinler arasındaki önemli yapısal fark; izoprostanların özel olarak cis yan zincirine sahipken prostaglandinlerin prostan halkasına trans pozisyonunda yan zincirler içermesidir.

İzoprostanlar; oluşumları için siklooksijenaz enzimi ve serbest arakidonik asit gereken klasik prostaglandinlerin (PG) aksine bu yağ asidi membran fosfolipidlerine bağlı iken de oluşabilir (Nourooz-Zadeh ve ark. 1987; Roberts ve ark. 1998). En fazla üzerinde çalışılan izoprostan, PGF_2α’nın izomeridir ve bu nedenle F₂-izoprostanlar (F₂- İzoP) denilmiştir. Diğer prostaglandinlerin, lökotrienlerin ve eikosaenoik asitlerin de serbest radikallerin etkisiyle oluşan izomerleri bildirilmiştir (Morrow ve ark. 1994; Mallat ve ark. 1999).

Kısaca isoprostanlar aşağıdaki gibi isimlendirilmiştir:

8-izoPGF₂_α

• izo ön eki temel yapıya yan zincirlerin çiralitisini gösterir.

• D,E,F,G ve H harfleri prostaglandin adlandırılmasındaki siklopentan halkası tipini belirtir.

• Çift bağların sayısı altta yazılan 1, 2, 3, 4 rakamlarıyla gösterilir.

• α veya β sembolleri siklopentan halkasında hidroksil gruplarının stereokimyasını

gösterir (Souvignet ve ark., 2000).

Prekürsörleri arakidonik asit, doku fosfolipidlerinden esterifiye olduğundan F₂- İzoP’lar in situ oluşur ve hedef dokularda birikir. Ardından hücresel aktivasyona yanıt olarak ve fosfolipaz bağımlı bir mekanizma ile kan dolaşımına geçer, idrarla atılır

(Morrow ve ark. 1992). Oluşumunu ve membrandan salınımı kontrol eden mekanizma henüz tam olarak anlaşılamamıştır.

İzoprostan biyosentezinin COX’dan bağımsız bir mekanizma ile gerçekleştiğini göstermek amacıyla yapılan bir çalışmada LDL ile insan aktive monositlerinin inkübasyonu sonucunda, zaman bağımlı olarak 8-izoPGF_2α oluşmuşken PGE₂ veya tromboksan B₂ (TxB₂) oluşumu görülmemiştir. 8-izoPGF_2α’daki artış tiyobarbitürik asit reaktif bileşikleri ve hidrojen peroksit artışı ile ilişkili bulunmuştur. Bu durum süperoksit dismutaz ve bütile hidroksi toluen gibi serbest oksijen radikal süpürücüleri ile inhibe edilirken, COX inhibitörleri ile inhibe edilememiştir (Pratico ve FitzGerald, 1996).

Yapılan bazı çalışmalarda ise COX’dan bağımsız oluşum mekanizması yanında trombositlerin kollajen, trombin ve arakidonat ile stimülasyonu sonucu COX-1 aktivitesinin minör ürünü olarak 8-izoPGF₂_α oluşabildiği gösterilmiştir. Aktive olmuş trombositlerde 8-izo-PGF₂_αve TxB₂ üretim oranı molar seviyede yaklaşık 1/1000 bulunmuştur (Wang ve ark., 1994; Pratico ve ark., 1995). Bu hücrelerin aktivasyonu oksidatif stres ve lipid peroksidasyonu ile seyreden birçok sendromda görüldüğü için önemli bir bulgudur. Ancak COX-1’in aktive olduğu bilinen kronik sigara içenlerde yapılan çalışmada ise nonselektif COX inhibitörü olan aspirin verilmesi, artmış 11- dehidro TxB₂düzeylerini süprese etmişken idrar 8-izoPGF₂_αdüzeylerini süprese edememiştir (Reilly ve ark., 1996). Bu nedenle COX-1 ile oluşan 8-izoPGF₂_α’nın idrar düzeyine etkisinin olmadığı kabul edilmektedir. Ayrıca, insan monositlerinde COX bağımlı 8-izoPGF_2α,PGE₂ ve TxB₂ oluşumunun, COX-2’yi indükleyen konkanavalin A uygulandığında 1:5,3:160, forbol ester uygulandığında 1:5:130, bakteriyel LPS uygulandığında 1:5,3:200 oranlarında olduğu gösterilmiştir (Pratico ve FitzGerald, 1996; Patrignani, 1996). Yine COX-2 indüksiyonunu inhibe eden dekzametazon ve selektif COX-2 inhibitörü L-745,337’nin doz bağımlı olarak 8-izoPGF₂_αve PGE₂ oluşumunu insan monositlerinde süprese ettiği gösterilmiştir (Pratico ve FitzGerald, 1996; Patrignani, 1996). İzole sıçan glomerülünde LPS ile COX-2 indüksiyonu sonucu 8-

izoPGF₂_α’nın oluşumunu antioksidanların engellemediği ve menadion ve parakuat varlığındaki prooksidatif stresin 8-izoPGF₂_α oluşumunu artırmadığı gösterilmiştir. İzole sıçan glomerülünde izoprostan oluşumunun inhibisyonu için antioksidanlara göre nonsteroid antiinflamatuar ilaçların daha etkili olduğu bildirilmiştir (Klein ve ark.,

2001). COX-2 indüksiyonu olduğu düşünülen inflamasyon ve hücresel proliferasyon durumlarında izoprostan düzeylerinin artabileceğini ileri sürülsede COX-2’lerin izoprostan oluşumuna ne kadar katkıda bulunduğu bilinmemektedir.

F₂izoP’lar lipid peroksidasyonunun göstergesi olarak idrar, kan, safra (Pratico ve ark. 1998; Leo ve ark. 1997), perikardiyal sıvı (Mallat ve ark. 1999) ve beyin-omurilik sıvısı (Pratico ve ark. 1998; Montine ve ark. 1999) gibi çeşitli vücut sıvılarında; beyin ve karaciğer dokusunda ölçülmüştür. Bu ölçümlerde değişik yöntemler kullanılmaktadır.

Gaz kromatografi-kütle spektrometre (GC/MS): Morrow ve Roberts’ın ilk olarak tanımladığı gaz kromatografi (GC)/elektron tutma/negatif kimyasal iyonizasyon kütle spektrometre (MS) yöntemi total serbest ve esterifiye F₂izoP’ları internal standart olarak izotopla işaretli PGF₂_α kullanarak ölçmektedir (Morrow ve ark. 1990). Ölçülen 8- izoPGF₂_αin vivo total F₂izoP’ların bir göstergesidir. COX bağımlı oluşumu buna benzer bir entegre sinyal oluşumuna yol açabilir (Southorn and Powis, 1988). İzoprostanların internal standardının olmayışı ile GC’de ekstraksiyon ve pürifikasyon aşamalarının yetersizliğinden dolayı rezolüsyonunun iyi olmaması gibi bazı sınırlamaları vardı. Bu grup daha sonra internal standart olarak deuterium işaretli 8-izoPGF₂_α kullanmaya başlamıştır (Morrow and Roberts, 1999). Bununla birlikte 8-izoPGF₂_α izomerini diğer izomerlerden ve metabolitlerinden ayırt etmek mümkün değildir.

İmmüno-GC-MS: 8-izoPGF_2αiçin immüno afinite kolonu ile saflaştırma yapıldıktan sonra MS ile kantitasyona dayanan bir yöntemdir. Kolon bütün saflaştırma basamakları yerine geçer fakat kolonun ömrü sınırlıdır ve sabit bir antikor kaynağı gerektirmektedir (Bachi ve ark. 1996).

Bu yöntemlerin en büyük dezavantajı pahalı olması ve özelleşmiş laboratuvarlar gerektirmesidir.

İmmünoassay: 8-izoPGF_2α için hem in vivo hem in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere immünoassay yöntemi kitleri mevcuttur. GC/MS için gerekli olan ön hazırlama işlemleri bu yöntem için de gereklidir. İmmünoassay ile F₂-izoP’ların analizinin doğruluğu GC/MS ile test edilmiştir (Wang ve ark. 1994).

Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda; sigara içiminde, hem tip Ι hem tip II diabetes mellitusta, hiperkolesterolemide, miyokardiyal iskemi reperfüzyon hasarında, kronik obstrüktif akciğer hastalığında, interstisyel akciğer hastalıklarında, yetişkin solunum sıkıntısı sendromunda (ARDS), sirozda, alkole bağlı karaciğer hasarında, hepatorenal sendromda, hepatobiliyer ve pankreatik hastalığı olanlarda, Alzheimer ve Parkinson hastalığında, skleroderma ve sistemik lupus eritematozusda, parasetamol kullanımında izoprostan düzeyinin yükseldiği gösterilmiştir.

Yapılan çok sayıdaki çalışmada serbest radikallerin inflamasyonun önemli bir komponenti olduğu gösterilmiştir. Romatoid artrit, inflamatuar barsak hastalığı, astım, sepsis, ARDS gibi inflamasyon olan durumlarda serbest radikallerin katalizlediği doku hasarının, söz konusu hastalıkların patogenezinde rol oynadığı gösterilmiştir (Yagi,

1987). Serbest radikal oluşumunun ölçümü ile ilgili problemler nedeniyle artık oksidatif stres ve lipid peroksidasyonunun spesifik ve selektif göstergesi olarak 8-izoPGF₂_α‘nın ölçülmesi tercih edilmektedir. Yapılan çalışmalarda romatoid artritte eklem sıvısında

(Basu ve ark., 2001), sistemik lupus eritematozus hastalığında idrarda (Iuliano ve ark.

1997), yetişkin solunum sıkıntısı sendromunda ekspirasyon havasında (Carpenter, 1998)

8-izoPGF₂_α düzeyinin yükseldiği gösterilmiştir.

Deneysel olarak oluşturulan akut inflamasyon modellerinde izoprostanların değerlendirildiği bir çalışmaya literatürde rastlanamamıştır. Bu çalışmada oksidatif hasarın spesifik göstergesi olan izoprostanları, sık kullanılan bir deneysel akut inflamasyon modeli olan sıçanlarda karageninle oluşturulan hava kesesi inflamasyon modelinde kantite ederek akut inflamasyonda oksidatif stresin rolünün araştırılması planlanmıştır. İnflamasyonla ilgili parametrelerin akut inflamasyonun farklı evrelerinde değişiklikler göstermesi nedeniyle ilk aşamada karagenin enjeksiyonundan sonraki belirli zamanlarda 8-izoPGF_2α ve PGE₂ ile diğer inflamasyon parametrelerinin değerlendirilmesi planlanmıştır.

2. ARAÇ GEREÇ VE YÖNTEMLER

2.1. DENEY HAYVANLARI

Çalışmada kısmen kendi olanaklarımızla yetiştirdiğimiz ve kısmen Refik Saydam Merkez Hıfzısıhha Enstitüsü Serum Çiftliği’nden alınan 130-200 g arasında dişi Wistar albino sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar, vitamin E verilen grup haricinde standart yemle beslendi ve herhangi bir diyet kısıtlaması yapılmadı.

2.2. KARAGENİN HAVA KESESİ MODELİ OLUŞTURULMASI

Sıçanlarda karagenin hava kesesi modeli oluşturmak için sırt bölgelerinde interskapular alana 0. gün 20 ml subkutan hava enjekte edildi. Hava kesesinin açıklığını sağlamak üzere aynı bölgeye 3. gün 10 ml, 6. gün 10 ml hava enjekte edildikten sonra 7. günde salin içinde hazırlanmış %1’lik karagenin solüsyonundan 2 ml enjekte edildi ve

12 saat sonra eter anestezisi altında sıçanların hava keseleri açılarak eksuda toplandı

(Sedgwick ve Lees, 1986).

2.3. LPS HAVA KESESİ MODELİ OLUŞTURULMASI

Sıçanların sırt bölgelerinde yukarıda tarif edildiği gibi hava kesesi oluşturuldu ve

7. gün salin içinde 1 µg/ml olacak şekilde 2 ml lipopolisakkarit (LPS, Escherichia coli

0111:β4 türü) kese içine enjekte edildi. LPS uygulandıktan 3 saat sonra 100 µM’lık arakidonik asitten 2 ml kese içine enjekte edildi ve 15 dakika sonra eter anestezisi altında sıçanların hava keseleri açılarak kese içeriği toplandı (Smith ve ark. 1998).

2.4.EKSUDA HACMİ VE EKSUDA LÖKOSİT SAYISININ ÖLÇÜLMESİ

Yapılan ön çalışmaların bulguları ışığında 12 saat sonunda eter anestezisi altında kese içine 10 Ü/ml heparinden 1 ml enjekte edildikten sonra kese açıldı ve eksuda toplandı. Eksuda buzda soğutulmuş tüplere aktarıldı ve ekzojen olarak siklooksijenaz ve

lipooksijenaz ürünlerinin oluşumunu engellemek için son konsantrasyonu 10^–5M olacak şekilde BW 755C (3-amino-1-(3-triflorometilfenil)-2-prazolin hidroklorid) eklendi. Eksuda hacmi dereceli tüp kullanılarak ölçüldü, eksudadaki lökositler ise Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı’nda Beckman-Coulter T890 cihazı kullanılarak sayıldı. Alınan eksudadan 3000xg, 4⁰C’de, 15 dakika santrifügasyonla hücre içermeyen süpernatan elde edildi ve ileride eikosanoidlerin kantitasyonunu yapmak üzere –80⁰C’de saklandı.

2.5. DENEY PROTOKOLLERİ

Çalışmada her grup 8 sıçan olacak şekilde planlandı.

2.5.1. Karagenin kontrol grubu: İlk aşamada karagenin hava kesesi modelinde 8- izoPGF_2α ve PGE₂’nin zaman bağımlı oluşumlarını değerlendirmek için karagenin enjeksiyonundan 6, 12 ve 24 saat sonra hava kesesi açıldı ve eksudada 8-izoPGF_2α ve PGE₂ölçümü ile inflamasyon parametreleri değerlendirildi. Bu verilerin ışığı altında çalışmanın bundan sonraki aşamalarında karagenin enjeksiyonundan 12 saat sonra eksuda toplanmasına karar verildi.

2.5.2. LPS kontrol grubu: LPS hava kesesi modelinde 8-izoPGF_2α ve PGE₂ölçümü ile inflamasyon parametreleri değerlendirildi.

2.5.3. Karagenin tedavi grubu: Çalışmada nonselektif COX inhibitörü indometazin

0,5-5 mg/kg, selektif COX-1 inhibitörü valeril salisilat 20 mg/kg, selektif COX-2 inhibitörü SC58236 10, 20 ve 40 mg/kg dozlarında orogastrik yolla, karagenin enjeksiyonu yapılmadan 1 saat önce verildi ve karagenin enjeksiyonundan 12 saat sonra elde edilen eksudada 8-izoPGF_2α ve PGE₂ ölçümü ile inflamasyon parametreleri değerlendirildi.

2.5.4. LPS tedavi grubu: LPS enjeksiyonundan 1 saat önce SC58236 10, 20 ve 40 mg/kg dozlarında orogastrik yolla verildi ve elde edilen eksudada 8-izoPGF_2α ve PGE₂ölçümü ile inflamasyon parametreleri değerlendirildi.

2.5.5. Antioksidan tedavi grubu: Bu grupta hayvanlar metabolik kafeslere alındıktan sonra 3 hafta süreyle, içerisinde 20 g/kg DL-α-tokoferol hidrojen süksinat olacak şekilde hazırlanan toz haline getirilmiş standart sıçan yemi verildi. Karagenin ve LPS ile hava kesesi oluşturulan gruplarda 8-izoPGF_2α ve PGE₂ ölçümü ile inflamasyon parametreleri değerlendirildi.

2.6. EKSUDADAN 8-izoPGF₂_α VE PGE₂ EKSTRAKSİYONU

Ekstraksiyon için -80°C’de saklanan örnekler çıkarılıp oda ısısında çözdürüldükten sonra 1 ml eksuda alındı ve recovery hesaplanması için 40000 dpm ³H- PGF_2α eklendi. Proteinlerin çöktürülmesi için örnek hacminin 3 katı (3 ml) soğuk etanol eklendi. Örnekler 5 dakika -20°C’de bekletildikten sonra 4500xg’de, +4°C’de, 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatan temiz tüpe alındı ve pH~4,0 olması için 40 µl glasial asetik asit eklendi. Vakum konsantratör (MaxiDry Plus, Heto Holten A/S, Allerod, Danimarka) ile etanol uçuruldu. Örnekler önce SepPak^TM C18 (100 mg) (Waters associates, Milford, Massachusetts) kartuştan geçirilerek ekstrakte edildi. Daha sonra SepPak^TM Silika (100 mg) (Waters associates, Milford, Massachusetts) kartuştan geçirildi. Vakum konsantratör ile organik faz uçurulduktan sonra enzim immünoassay (EİA) tamponu ile sulandırılarak örneklerdeki 8-izo-PGF_2α ve PGE₂düzeyleri EİA yöntemiyle ölçülmek üzere -80°C’de saklandı.

2.7. EİA İLE 8-izoPGF₂_α VE PGE₂ KANTİTASYONU

Örneklerdeki 8-izo-PGF_2α ve PGE₂düzeylerinin ölçümü için asetilkolin esteraz işaretli solid faz Enzim İmmünoassay (EİA) yöntemi kullanıldı (Pradelles ve ark. 1985).

2.8. PLAZMADA VİT E ÖLÇÜMÜ

Plazmalardaki Vitamin E tayini Ankara Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezinde HPLC sistemi kullanılarak yapıldı

2.9. PLAZMA ANTİOKSİDAN AKTİVİTE TAYİNİ

Plazmaların antioksidan aktivite tayini Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı’nda akışa-enjeksiyon analiz luminol kemilüminesans yöntemi kullanılarak yapıldı.

2.11. VERİLERİN ANALİZİ

Tedavi uygulamalarının eikosanoidlerin oluşumunda ve inflamasyon parametrelerinde yaptığı değişiklikler için Schering Biyometrik bölümü tarafından geliştirilmiş modifiye Hemm (inhibisyon) testi kullanılmıştır (Schottelius ve ark. 2002). COX inhibitörü ilaçların ve vitamin E’nin inhibitör etkilerini belirlemek amacıyla, karagenin kontrol gruplarının ortalama değerleri ile salin kontrol gruplarının ortalama değerleri arasındaki fark %100’e ayarlanmış ve yüzde inhibisyon şu formülle tahmin edilmiştir:

% inhibisyon = 100 – [((ortalama değer _{tedavi grubu}– ortalama değer _{kontrol grubu})/(ortalama değer _{karagenin grubu}– ortalama değer _{kontrol grubu})) * 100]

Tedavi grubundaki inhibisyonun 0 (sıfır)’dan farklı olup olmadığı Student’s-t testi ile değerlendirilmiş ve istatiksel bakımdan anlamlılık için p<0,05 değeri esas alınmıştır.Her bir deney için sonuçlar ortalama±standart hata olarak verilmiştir.

3. ANALİZ VE BULGULAR

3.1. KARAGENİN HAVA KESESİ MODELİNDE ZAMAN BAĞIMLI OLARAK

8-izoPGF₂_α VE PGE₂ OLUŞUMU İLE EKSUDA HACMİ VE EKSUDA LÖKOSİT SAYISININ DEĞERLENDİRİLMESİ

Karagenin hava kesesi modelinde sıçanlara salin içinde hazırlanmış %1’lik karagenin solüsyonundan 2 ml enjekte edildikten 6, 12, 24 saat sonra eksuda toplandı ve eksuda hacmi, eksudadaki lökosit sayısı, eksuda 8-izoPGF₂_α ve PGE₂ düzeyleri değerlendirildi.

3.1.1. 8-izoPGF₂_αdüzeyleri:

Karagenin hava kesesi modelinde karagenin enjeksiyonundan 6 saat sonra alınan eksudada 8-izoPGF_2α düzeyi 1511,54±567.35 pg/ml (n=6), 12 saat sonra alınan eksudada 8-izoPGF_2α düzeyi 4340.99±1900.39 pg/ml (n=6), 24 saat sonra alınan eksudada 8-izoPGF_2α düzeyi 570.75±176.92 pg/ml (n=5) bulundu. Her üç gruptaki 8- izoPGF₂_α düzeyleri salin kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak farklıydı (Şekil

3.1.). Ancak 12 saat sonraki alınan eksudada bu düzeyin diğer zamanlara oranla daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu nedenle, takip eden aşamalarda eksuda toplanma zamanı enjeksiyondan 12 saat sonra olarak kararlaştırılmıştır.

3.1.2. PGE₂ düzeyleri

Karagenin hava kesesi modelinde karagenin enjeksiyonundan 6 saat sonra alınan eksudada PGE₂ düzeyi 481.89±86.22 pg/ml (n=6), 12 saat sonra alınan eksudada PGE₂düzeyi 639.85±154.78 pg/ml (n=5), 24 saat sonra alınan eksudada PGE₂ düzeyi

130.99±47.9 pg/ml (n=6) bulundu. Her üç gruptaki PGE₂ düzeyleri salin kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak farklıydı (Şekil 3.2.). PGE₂ düzeyi de 8-izoPGF_2αdüzeyinde olduğu gibi karagenin enjeksiyonundan sonra 12 saat sonra en yüksek bulunmuştur.

₆₀ *

^*salin kontrol

karagenin

6. Saat 12. Saat 24.saat

Şekil 3.4. Karagenin enjeksiyonundan 6, 12 ve 24 saat sonra sıçanların hava keselerinden elde edilen eksudada lökosit sayısı. Sonuçlar aritmetik ortalama ± standart hata olarak verilmiştir.

* P < 0.05 salin kontrol grubuna göre istatiksel anlamlılığı ifade etmektedir.

3.2. LPS HAVA KESESİ MODELİNDE 8-izoPGF₂_α VE PGE₂ OLUŞUMU İLE HAVA KESESİ İÇERİK HACMİ VE LÖKOSİT SAYISININ DEĞERLENDİRİLMESİ

LPS hava kesesi modelinde, salin içinde 1 µg/ml olacak şekilde 2 ml LPS kese içine enjekte edildi. LPS uygulandıktan 3 saat sonra 100 µM’lık arakidonik asitten 2 ml kese içine enjekte edildi ve 15 dakika sonra açılan hava kesesinden alınan içeriğin hacmi, lökosit sayısı, 8-izoPGF₂_α ve PGE₂ düzeyleri değerlendirildi.

3.2.3. Hava kesesi içerik hacmi ve lökosit sayısı

Hava kesesi içerik hacmi salin kontrol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı artış göstermiştir. Lökosit sayısında ise kontrol grubuna göre istatiksel olarak farklılık bulunmamıştır.

3.3. KARAGENİN HAVA KESESİ MODELİNDE COX İNHİBİTÖRLERİNİN

8-izoPGF₂_α VE PGE₂ OLUŞUMU İLE EKSUDA HACMİ VE EKSUDA LÖKOSİT SAYISI ÜZERİNE ETKİLERİ

Sıçanlara, nonselektif COX inhibitörü indometazin 0,5-5 mg/kg, selektif COX-1 inhibitörü valeril salisilat 20 mg/kg, selektif COX-2 inhibitörü SC 58236 10, 20 ve 40 mg/kg dozlarında, orogastrik yolla, karagenin enjeksiyonu yapılmadan 1 saat önce verildi. Karagenin enjeksiyonundan 12 saat sonra elde edilen eksudada 8-izoPGF_2α ve PGE₂ düzeyleri ile eksuda hacmi ve lökosit sayısı değerlendirildi.

3.3.1. 8-izoPGF₂_αdüzeyleri

Karagenin hava kesesi modelinde, 8-izoPGF_2α düzeyi, karagenin kontrol grubuna göre SC 58236 10mg/kg dozunda verildiğinde %70,28±4,42, 20 mg/lkg verildiğinde

%73,47±20,58, 40 mg/kg verildiğinde %89,49±10,7; indometazin 0,5 mg/kg verildiğinde %57,19±18,81 pg/ml, 5 mg/kg dozunda verildiğinde %72,61±9,2; valeril salisilat 20 mg/kg verildiğinde %59,48±22,76, inhibe olmuştur (Şekil 3.7.).

3.3.2. PGE₂ düzeyleri

Karagenin hava kesesi modelinde, PGE₂ düzeyi, karagenin kontrol grubuna göre indometazin 0,5 mg/kg verildiğinde %97,32±2,63, 5 mg/kg dozunda verildiğinde

%98,56±1,73; SC 58236 10mg/kg dozunda verildiğinde %95,03±1,2, 20 mg/lkg verildiğinde %97,61±1,66, 40 mg/kg verildiğinde %99,01±0,93; valeril salisilat 20 mg/kg verildiğinde %66,26±9,1 inhibe olmuştur (Şekil 3.8.).

100 _*^*

_*_*90

80 _{* *}

Şekil 3.7. Karagenin hava kesesi modelinde; SC 58236 (10, 20 ve 40 mg/kg), indometazin (0,5 ve

5 mg/kg), valeril salisilatın (20 mg/kg) eksuda 8-izoPGF_2α düzeylerine etkisi. Sonuçlar % inhibisyonun aritmetik ortalaması ± standart hata olarak verilmiştir.

* P < 0.05

* *₁₀₀* * _*

*80

Şekil 3.8. Karagenin hava kesesi modelinde; SC 58236 (10, 20 ve 40 mg/kg), indometazin (0,5 ve 5

3.3.3. Eksuda hacmi

Karagenin hava kesesi modelinde, SC 58236 tüm dozlarda (10, 20, 40 mg/kg), indometazin ise yüksek dozda (5 mg/kg) eksuda hacmini anlamlı olarak azaltmıştır. İndometazinin düşük dozda (0,5 mg/kg) ve valeril salisilatın eksuda hacmine anlamlı bir etkisi olmamıştır (Tablo 3.1.).

Grup % inhibisyon

SC 58236 10 mg/kg 27,77±5,67*

SC 58236 20 mg/kg 19,75±4,25* SC 58236 40 mg/kg 27,57±7,17 * İndometazin 0,5 mg/kg 12,92±7,78

İndometazin 5 mg/kg 32,27±3,68 *

Valeril salisilat 8,28±11,19

Tablo 3.1. Karagenin hava kesesi modelinde; SC 58236 (10, 20 ve 40 mg/kg), indometazin (0,5 ve

5 mg/kg), valeril salisilatın (20 mg/kg) eksuda hacmine etkisi. Sonuçlar % inhibisyonun aritmetik ortalaması ± standart hata olarak verilmiştir.

* P < 0.05

3.3.4. Lökosit sayısı

Karagenin hava kesesi modelinde, SC 58236 40 mg/kg ve indometazin 5 mg/kg dozunda eksudadaki lökosit sayısını anlamlı olarak azaltmıştır (Şekil 3.2.).

Grup % inhibisyon

SC 58236 10 mg/kg 32,67±18,77

SC 58236 20 mg/kg 40,44±15,99

SC 58236 40 mg/kg 66,63±6,87 *

İndometazin 0,5 mg/kg -5,01±21,44

İndometazin 5 mg/kg 56,99±14,0 *

Valeril salisilat 36,85±13,27

Tablo 3.2. Karagenin hava kesesi modelinde; SC 58236 (10, 20 ve 40 mg/kg), indometazin (0,5 ve

5 mg/kg), valeril salisilatın (20 mg/kg) eksudadaki lökosit sayısına etkisi. Sonuçlar % inhibisyonun aritmetik ortalaması ± standart hata olarak verilmiştir. * P < 0.05

3.4. LPS HAVA KESESİ MODELİNDE COX-2 SELEKTİF İNHİBİTÖRÜN

8- izoPGF₂_α VE PGE₂OLUŞUMU İLE HAVA KESESİ İÇERİK HACMİ VE LÖKOSİT SAYISI ÜZERİNE ETKİLERİ

Sıçanlara selektif COX-2 inhibitörü SC 58236 10, 20 ve 40 mg/kg dozlarında orogastrik yolla verildikten 1 saat sonra, salin içinde 1 µg/ml olacak şekilde 2 ml LPS kese içine enjekte edildi. LPS uygulandıktan 3 saat sonra 100 µM’lık arakidonik asitten

2 ml kese içine enjekte edildi ve 15 dakika sonra açılan hava kesesinden alınan içeriğin hacmi, lökosit sayısı, 8-izoPGF₂_α ve PGE₂ düzeyleri değerlendirildi.

3.4.1. 8-izoPGF₂_αdüzeyleri

LPS hava kesesi modelinde, 8-izoPGF_2α düzeyi, LPS kontrol grubuna göre SC

58236 10 mg/kg verildiğinde %97,32±1,14, 20 mg/lkg verildiğinde % 96,74±1,22, 40 mg/kg verildiğinde %99,48±0,16 inhibe olmuştur. SC 58236 tüm dozlarda 8-izoPGF_2αdüzeyini anlamlı olarak inhibe etmiştir (Şekil 3.9.).

3.4.2. PGE₂ düzeyleri

LPS hava kesesi modelinde, PGE₂ düzeyi, LPS kontrol grubuna göre SC 58236

10mg/kg verildiğinde %99,74±0,07, 20 mg/lkg verildiğinde % 99,6274±0,1 40 mg/kg verildiğinde %99,81±0,04 inhibe olmuştur. SC 58236 tüm dozlarda PGE₂ düzeyini anlamlı olarak inhibe etmiştir (Şekil 3.10.).

3.4.3. Hava kesesi içerik hacmi ve lökosit sayısı

LPS hava kesesi modelinde SC 58236’nın hava kesesi içerik hacmi ve lökosit sayısı

üzerine etkisi olmamıştır.

3.5. KARAGENİN HAVA KESESİ MODELİNDE VİT E’NİN 8-izoPGF₂_α VE PGE₂ OLUŞUMU İLE EKSUDA VOLÜMÜ VE EKSUDA LÖKOSİT SAYISI ÜZERİNE ETKİLERİ

Sıçanlara 3 hafta süreyle içerisinde 20 g/kg DL-α-tokoferol hidrojen süksinat olacak şekilde hazırlanan toz halindeki yem verildi. Vit E verilen grupta plazma vit E düzeylerinin standart yemle beslenen kontrol grubundan farklı olup olmadığını değerlendirmek için plazma vit E düzeyleri HPLC yöntemiyle ölçüldü. Ayrıca vit E verilen gruptaki sıçanların plazmalarının antioksidan aktivitesinde artış olup olmadığını değerlendirmek için plazma antioksidan aktivitesi tayini akışa enjeksiyon analiz-luminol kemilüminesans yöntemiyle değerlendirildi. Üçüncü haftanın sonunda karagenin ile oluşturulan hava kesesinden eksuda toplandı. Elde edilen eksudada 8-izoPGF_2α ve PGE₂ düzeyleri ile eksuda hacmi ve lökosit sayısı değerlendirildi.

3.5.1. Plazma vit E düzeyleri

Kontrol grubu sıçanların plazma vit E düzeyi 2,41±0,1 mg/ml olarak bulunmuşken, üç hafta süreyle içerisinde 20 g/kg DL-α-tokoferol hidrojen süksinat olacak şekilde hazırlanan toz halindeki yem verilen sıçanların plazma vit E düzeyi

3,58±0,09 mg/ml bulunmuştur. Vit E verilen grubun plazma vit E düzeyi kontrol grubuna göre istatiksel olarak yüksekti.

3.5.2. Plazma antioksidan kapasitesi

Standart bir hacimde H₂O₂çözeltisinin luminol ile birleştikten sonra oluşturduğu kemilüminesansın pik noktası 100 kabul edilerek, plazma örneklerinin uygulanmasıyla elde edilen inhibisyonlar; kontrol grubunda %76,19±2,49 iken DL-α-tokoferol hidrojen süksinat içeren yem verilen grupta %82,69±1,4 bulunmuştur. Gruplar arasında antioksidan aktivitede istatiksel olarak anlamlı fark tespit edilmiştir.

3.5.3. 8-izoPGF₂_αdüzeyleri

Karagenin hava kesesi modelinde vit E, 8-izoPGF_2α düzeyini karagenin kontrol grubuna göre %88,81±3,76 inhibe etmiştir (Şekil 3.11).

3.5.4. PGE₂düzeyleri

Karagenin hava kesesi modelinde vit E, PGE₂ düzeyi karagenin kontrol grubuna göre % 18,19±21,92 inhibe olmuştur, ancak bu inhibisyon istatiksel olarak anlamlı değildir (Şekil 3.12).

*100

karagenin + VitE LPS + Vit E

Şekil 3.11. Karagenin hava kesesi modelinde ve LPS hava kesesi modelinde 3 hafta süreyle verilen DL-α-tokoferol hidrojen süksinatın eksuda 8-izoPGF_2α düzeylerine etkisi. Sonuçlar % inhibisyonun aritmetik ortalaması ± standart hata olarak verilmiştir.* P < 0.05.

100

karagenin + Vit E LPS + Vit E

Şekil 3.12. Karagenin hava kesesi modelinde ve LPS hava kesesi modelinde 3 hafta süreyle verilen DL-α-tokoferol hidrojen süksinatın eksuda PGE₂ düzeylerine etkisi. Sonuçlar % inhibisyonun aritmetik ortalaması ± standart hata olarak verilmiştir.

* P < 0.05.

3.5.5. Eksuda hacmi ve lökosit sayısı

Karagenin hava kesesi modelinde eksuda hacminde ve lökosit sayısında; karagenin kontrol grubu ile vit E verilen grup arasında fark görülmemiştir. Vit E’nin karagenin hava kesesi modelinde eksuda hacmine ve lökosit sayısına etkisi yoktur.

3.6. LPS HAVA KESESİ MODELİNDE VİT E’NİN 8-izoPGF₂_α VE PGE₂

OLUŞUMU İLE HAVA KESESİ İÇERİK HACMİ VE LÖKOSİT SAYISI ÜZERİNE ETKİLERİ

Sıçanlara 3 hafta süreyle içerisinde 20 g/kg DL-α-tokoferol hidrojen süksinat olacak şekilde hazırlanan toz halindeki yem verildi. Üçüncü haftanın sonunda LPS hava kesesi modeli oluşturularak elde edilen hava kesesi içeriğinde 8-izoPGF_2α ve PGE₂düzeyleri ile içerik hacmi ve lökosit sayısı değerlendirildi.

4. SONUÇ VE YORUM

Literatürde serbest radikallerin, inflamasyonun önemli komponenti olduğunu

(Winrow ve ark. 1993) ve romatoid artrit (Basu ve ark. 2001), sistemik lupus eritematozus (Iuliano ve ark. 1997), inflamatuvar barsak hastalığı (Cracowski ve ark.

2002) gibi inflamatuvar hastalıklarda oksidatif stres ve lipid peroksidasyonunun spesifik ve selektif göstergesi olan 8-izoPGF₂_α’nın oluştuğunu gösteren çalışmalar olsa da

8-izoPGF₂_α’nın deneysel akut inflamasyon modelinde değerlendirildiği çalışmaya rastlanamamıştır. Yapılan bu çalışmada karagenin hava kesesi modelinde eksudada 8- izoPGF₂_α’nın oluştuğu gösterildi.

Şimdiye kadar yapılan araştırmalar sonucunda kabul edilen 8-izoPGF₂_α’nın arakidonik asitten nonenzimatik peroksidasyon ile oluştuğu ise de bazı çalışmalarda COX aracılı oluştuğu da gösterilmiştir. Oluşturduğumuz karagenin hava kesesi inflamasyon modelinden elde edilen eksudada; PGE₂ düzeyi, lökosit sayısı ve eksuda hacmi inflamasyonda daha önceki çalışmalarda gösterildiği gibi önemli ölçüde yüksek bulunmuştur (Sayar ve Melli, 1999). İlginç olan karagenin hava kesesi inflamasyon modelinde 8-izoPGF₂_α’nın oluşumunun gösterilmesidir. Ancak oluşan 8-izoPGF₂_α’nın inflamasyonun doğal seyrine mi, yoksa inflamasyon esnasında oluştuğu çok iyi bilinen COX-2 indüksiyonuna mı bağlı oluştuğunu kesin olarak söylememiz mümkün değildir. LPS, Gram negatif bakterilerin dış zarlarında bulunan bir endotoksindir ve inflamatuvar uyarı hayvan modellerinde ve in vitro sistemlerde COX-2’nin indüklenmesine neden olarak prostaglandinlerin oluşumuna yol açmaktadır (O’Sullivan,

1992, Masferrer 1990). Bu çalışmada klasik inflamatuvar yanıt oluşmadan sadece COX-

2 indüksiyonun oluştuğu LPS hava kesesi modelinde de arakidonik asitten 8- izoPGF₂_α’nın oluştuğu gösterildi. Oluşan 8-izoPGF₂_α’nın PGE₂’ye oranı Pratico ve FitzGerald’ın buldukları oranla uyumlu olarak 1:5,9 bulundu. LPS ve karagenin hava kesesi modelinde oluşan 8-izoPGF₂_α düzeylerinin birbirine yakın olması bu oluşumdan COX indüksiyonunun önemli ölçüde sorumlu olduğunu düşündürmektedir.

İzoprostanlar sadece lipid peroksidayonun göstergesi olmayıp, biyolojik aktivite de sergilerler. 8-izoPGF₂_α’nın sıçana sistemik infüzyonu, güçlü renal vazokonstrüksiyon ve glomerüler filtrasyon hızında azalma, böbrek kan akımında %40 azalma oluşturmuş ancak sistemik kan basıncında değişiklik oluşturmamıştır; bu olay izoprostanların böbrek damar yatağına selektif etkisini düşündürmüştür (Takahashi, 1992). Ayrıca tavşanlarda ve sıçanlarda güçlü bir şekilde pulmoner arterlerde vazokonstrüksiyon, sıçanlarda ve kobaylarda intratrakeal verildiğinde bronkokonstrüksiyon yaptığı bildirilmiştir (Kang ve ark. 1993, Banerjee ve ark. 1992). İnsan trombositlerinde, 1 nmol/l ile 1 µmol/l arasındaki 8-izoPGF₂_αkonsantrasyonlarının doz bağımlı olarak şekil değişikliği yaptığı, hücre içi depolarda kalsiyum ve inozitol fosfat salınımını sağladığı bildirilmiştir (Pratico ve ark, 1996, Morrow ve ark. 1992). Tüm bu bilgilere rağmen, in vivo lokal izoP konsantrasyonlarının, çeşitli etkiler oluşturmak için yeterli olup olmadığı bilinmemektedir. Bu tez çalışmasında da oluştuğu gösterilen 8-izoPGF₂_α’nın inflamasyondaki etkileri bilinmemekte; sadece oksidatif hasarın göstergesi mi yoksa inflamatuvar yanıta katkısı oluyor mu sorusuna yanıt bulabilecek araştırmalar gerekmektedir.

Sonuçta deneysel inflamasyon modelinde 8-izoPGF₂_α oluşmaktadır ve oluşan bu izoprostanın hem oksidatif stres sonucu hem de COX indüksiyonu ile oluşabileceği sonucuna varılmıştır.

İzoprostan biyosentezinin COX enziminden bağımsız mekanizma ile oluştuğu vurgulanmakla beraber COX bağımlı oluşumu ve COX inhibitörlerinin bu oluşum üzerine etkisi konusunda fikir birliği yoktur.

Stimüle edilmemiş J774 makrofaj hücrelerinin COX-1 eksprese ettiği ve arakidonik asit stimülasyonu ile bu hücrelerden prostaglandin oluştuğu bildirilmiştir. Bu hücrelerle yapılan çalışmada arakidonik asit ile COX-1’in stimülasyonu sonucunda 8- izoPGF_2α oluşmamışken PGE₂ ve 6-ketoPGF_1α oluşumu gösterilmiştir. Bundan sonra LPS ile uyarılması sonucunda COX-2 aracılığıyla 8-izoPGF_2αoluşumu tespit edilmiştir. Yine bu çalışmada deksametazon ve siklohekzimidin COX-2 ekspresyonunu inhibe ederek, selektif COX-2 inhibitörü DFU’nun ise COX-2 ekpresyonunu etkilemeden

aktivitesini inhibe ederek doz bağımlı olarak 8-izoPGF_2α oluşumunu azalttığı

gösterilmiştir (Sautebin, 1999).

Bu tez çalışmasında önceki aşamada karagenin hava kesesi modelinde oluştuğu gösterilen 8-izoPGF_2αve PGE₂üzerine nonselektif COX inhibitörü indometazin, selektif COX-1 inhibitörü valeril salisilat ile selektif COX-2 inhibitörü SC 58236’nın etkisine ve LPS hava kesesi modelinde selektif COX-2 inhibitörü SC 58236’nın etkisine bakılmıştır. Beklenildiği gibi COX bağımlı PGE₂ oluşumu SC 58236, indometazin ve valeril salisilat ile baskılanmıştır. Bundan da önemlisi benzer şekilde 8-izoPGF_2α’nın çeşitli COX inhibitörleri tarafından inhibe edilmesidir. Tüm COX inhibitörleri her iki modelde de 8- izoPGF_2αdüzeyini anlamlı şekilde azaltmıştır. Bu bulgular 8-izoPGF_2α’nın COX aracılı oluşumunu bildiren çalışmaları desteklemektedir.

COX-1 geni silinmiş farelerde arakidonik asitin cilde uygulanması ile inflamatuvar yanıtta azalma görülmüş ve inflamasyonda COX-1’in önemli rolü olduğu ileri sürülmüştür (Langenbach ve ark. 1995). LPS hava kesesi modelinde, yüksek doz SC

560’ın (selektif COX-1 inhibitörü) kese içeriğindeki PGE₂’ye bir etki etmediği; karagenin pençe ödemi modelinde, SC 560’ın hiperaljeziyi ve ödemi düzeltmeden PGE₂düzeyini düşürdüğü bildirilen bir çalışmada inflamasyonda PGE₂’nin doku düzeylerinden sadece COX-2’nin sorumlu olmadığı COX-1’in de olaya karıştığı gösterilmiştir (Smith ve ark. 1998). COX-2 geni silinmiş farelerde karagenin pençe ödemi oluşmuş ve COX-1 inhibisyonu ile ödem azalmış, COX-2 inhibisyonun etkisi olmamıştır. Yine bu ödemde COX-1 inhibisyonu ile PGE₂ düzeyleri anlamlı olarak azalmıştır (Wallace ve ark. 1998). Bizim yaptığımız çalışmada ise inflamasyon sırasında oluşan 8-izoPGF_2α ve PGE₂ düzeyini selektif COX-1 inhibitörü valeril salisilat anlamlı şekilde azaltmıştır. Yine bu çalışmada LPS hava kesesi modelindeki 8-izoPGF_2αazalışının karagenin hava kesesi modelindeki azalıştan daha fazla olduğu görülmüştür. Bu bulgulardan dolayı karagenin hava kesesi modelinde dolayısıyla klasik inflamatuvar yanıtta COX-2 aracılı 8-izoPGF_2α oluşumunun yanında COX-1 aracılı ve serbest radikal hasarı gibi başka mekanizmalarında rol aldığını söyleyebiliriz.

Bu tez çalışmasında ayrıca vit E’nin hem karagenin hava kesesinde hem de LPS

hava kesesinde 8-izoPGF₂_α düzeyini ve LPS hava kesesinde PGE₂düzeyini önemli

ölçüde azalttığını gösterdik. Karagenin hava kesesinde, vit E ile eksudada 8-izoPGF₂_αdüzeyinin azalması beklenen bir bulgudur ve antioksidanların izoprostanlar üzerine etkisini gösteren pek çok çalışmayı desteklemektedir. İlginç olan vit E verilen grupta LPS hava kesesinde 8-izoPGF₂_α ve PGE₂ düzeyinin düşük bulunmasıdır. Bu modelde hava kesesi içeriğinde 8-izoPGF₂_α ve PGE₂ artışı COX-2 indüksiyonuna bağlı olarak oluşmaktadır. Dolayısıyle COX-2 bağımlı sözkonusu artışları vit E’nin hangi mekanizma ile inhibe ettiği gündeme gelmektedir.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda vit E alımının yetersiz olmasının veya serum antioksidan düzeylerinin düşük olmasının romatoid artrit gelişme riskinin artmasına

(Situnayake ve ark., 1991, Heliovaara ve ark. 1994) ve tedaviye vit E eklenmesinin romatoid artritde ağrı gibi bazı semptomların (McAlindon ve ark. 1996, Edmonds ve ark. 1997) ve nonsteroid antiinflamatuvar ilaçlara duyulan ihtiyacın azalmasına neden olduğu gösterilmiştir (Edmonds ve ark. 1997, Sangha ve Stucki, 1998, Wittenborg ve ark. 1998). Bu klinik bulgulardan sonra vit E’nin olabilecek antiinflamatuvar etkisinin, COX aktivasyonu ve PGE₂düzeyine etkisi ile ilişkisi araştırılmıştır. J774.1A mürin makrofaj hücre dizininde tek başına vit E’nin LPS ile indüklenmiş PGE₂ oluşumunu aspirin kadar inhibe ettiği, birlikte kullanıldığında aspirinin %59 olan inhibitör etkisini

% 95’e çıkardığı tespit edilmiştir. Yine bu çalışmada LPS ile stimüle edilmiş hücrelerde uygulanan aspirin ve vit E’nin; western blot analizi ile değerlendirilen COX-2 protein sentezini önemli ölçüde azalttıkları gösterilmişken, nothern blot analizi ile değerlendirilen COX-2 mRNA ekspresyonunu orta dereceli inhibe ettikleri gösterilmiştir. Bu çalışmada, vit E’nin COX-2 ekpresyonunu inhibe etmesinin antioksidan etki ile ilişkili olmadığı çünkü aynı inhibisyonun vit C ile gösterilemediği bildirilmiştir (Abate ve ark., 2000).

Serbest radikal olan nitrik oksitin (NO) COX aktivasyonunun düzenlenmesinde ve eikosanoid metabolizmasında rol aldığı gösterilmiştir (Salvemini ve ark. 1995). Peritoneal makrofajlar LPS ile stimüle edildiğinde NO üretiminin arttığı ve vit E’nin bu üretimi azalttığı gösterilmiştir (Beharka ve ark. 1997). NO süperoksid (SO) varlığında peroksinitrite (ONOO) metabolize olur ve ONOO’nun COX ekspresyonunu etkilemeden aktivasyonuna neden olduğu bildirilmiştir. Böylece vit E’nin NO ve dolayısıyle ONOO

oluşumunu azaltarak COX aktivasyonunda inhibisyona neden olabileceği ileri sürülmüştür (Beharka ve ark. 2000).

Bu çalışmada LPS hava kesesinde vit E, PGE₂’yi önemli düzeyde inhibe etmişken karagenin hava kesesi modelinde inhibisyon anlamlı bulunmamıştır. Bu bulgudan dolayı vit E’nin COX-2 inhibisyonunda rolü olabileceği, COX-1 inhibisyonunda etkili olamadığı düşüncesi akla gelmektedir. Genç ve yaşlı farelerden elde edilmiş peritoneal makrofajlar içerisinde 30 µM arakidonik asit olan endotoksin içermeyen RPMI 1640 besiyerinde inkübe edildiğinde yaşlı farelerin makrofajlarında PGE₂ düzeyleri artmış bulunmuş ve bu şartlarda COX-2 protein ve mRNA’sının yanında az miktarda da olsa COX-1 protein ve mRNA’sı gösterilmiştir. Vit E yaşlı fare makrofajlarındaki artmış PGE₂ düzeyini genç fare makrofajlarındaki düzeyine indirmiş iken COX-1 mRNA ve proteinine etkisi olmamıştır (Wu ve ark. 1998). COX aktivitesi için yeterli enzim düzeyi ve aktivatör olarak oksidan hidroperoksitin varlığının gerektiği biliniyorken (Hemler ve Lands 1980, Kulmacz ve Wang 1995, Smith ve ark. 1992) Kulmacz ve Wang COX-2 aktivitesi için gerekli olan hidroperoksit düzeyinin COX-1 için gerekli olandan daha fazla olduğunu göstermişlerdir (1995). Bu bulgular karagenin hava kesesinde vit E ile inhibe olmayan PGE₂’nin daha çok COX-1 aracılı olduğunu destekler.

Karagenin hava kesesi modelinde klasik inflamatuvar yanıtta ve LPS hava kesesinde COX-2 indüksiyonuyla oksidatif stresin göstergesi olan 8-izoPGF_2α oluşması ve antioksidan olan vit E ile bu oluşumun azalması COX aracılığıyla oluşum sırasında serbest radikallerin de rolünün olduğunu gösterir. Bu bulguları desteklemek için ileriki aşamalarda bu modellerde değişik antioksidanların etkilerine bakılabilir ve COX proteinlerine ve COX mRNA’sına etkileri değerlendirilebilir.

Sonuç olarak; karagenin hava kesesi modelinde ve LPS hava kesesi modelinde serbest radikal hasarının göstergesi kabul edilen 8-izoPGF_2α düzeylerinde artış olduğu gözlenmiştir. Bu gözlem oluşan 8-izoPGF_2α’nın oksidatif stres sonucunun yanında COX indüksiyonu ile oluşabileceğini göstermektedir. Karagenin hava kesesi modelinde ve LPS hava kesesi modelinde görülen 8-izoPGF_2α düzeylerinde artışı çeşitli COX inhibitörlerinin inhibe etmesi, 8-izoPGF_2α’nın COX aracılı oluşumunu desteklemektedir.

5. KAYNAKLAR

ABATE, A., YANG, G., DENNERY, P. A., OBERLE, S., SCHRÖDER, H. (2000). Synergistic inihbition of cyclooxygenase-2 expression by vitamin E and aspirin. Free Radic. Biol. Med. 29(11): 1135-1142.

BACHI, A., ZUCCATO, E., BARALDI, M. FANELLI, R., CHIABRANDO, C. (1996). Measurement of urinary 8-epi-prostaglandin F₂_α, a novel index of lipid peroxidation in vivo, by immunoaffinity extraction/gas chromatography-mass spectrometry. Basal levels in smoker and nonsmokers. Free Radic. Biol. Med. 20:

619-624.

BANERJEE, M., KANG, K. H., MORROW, J. D., NEWMAN, J. H. (1992). Effects of novel prostaglandin, 8-epi-prostaglandin F₂_α, in rabbit lung in situ. Am. J. Physiol.

263: H660-663

BASU, S., WHITEMAN, M., MATTEY, D. L., HALLIWELL, B. (2001). Raised levels of F₂-isoprostanes and prostaglandin F₂ in different rheumatic diseases. Ann. Rheum. Dis. 60: 627-631.

BEHARKA, A. A., HAN, S. N. , ADOLFSSON, O., WU, D., SMITH, D., LIPMAN, R., CAO, G., MEYDANI, M., MEYDANI, S. (2000). Long-term dietary antioxidant supplamentation reduces production of selected inflammatory mediators by murine macrophages. Nutr. Res. 20: 281-296.

BEHARKA, A. A., WU, D., HAN, S. N. , MEYDANI, S. (1997). Macrophage PGE₂production contributes to the age-associated decrease in T-cell function which in reversed by dietary antioxidants. Aging. Dev. 93: 59-77.

CARPENTER C. T., PRICE P. V., CHRISTMAN B. W. (1998). Exhaled breath condansate isoprostanes are elevated in patients with acute lung injury or ARDS. Chest. 114: 1557-1563.

CRACOWSKİ J. L. (2002). Increased urinary F₂-isoprostanes in patients with Crohn’s disease. Am. J. Gastroenterol. 97: 99-103.

EDMONDS, S. E., WINYARD, P. G., GUO, R., KIDD, B., MERRY, P., LANGRISH- SMITH, A., HANSEN, C., RAMM, S., BLAKE, D. R. (1997). Putative analgesic activity of repeated oral doses of vitamin E in the treatment of rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 56: 646-655.

HELIOVAARA, M., KNEKT, P., AHO, K., AARAN, R. K., ALFTHAN, G., AROMAA, A. (1994). Serum antioxidants and risk of rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 53: 51-53.

HEMLER, M. E., LANDS, W. E. M. (1980). Evidence for peroxide-initiated free radical mechanism of prostaglandin biosynthesis. J. Biol. Chem. 255: 6253-6261.

IULIANO, L., PRATICO, D., FERRO, D., PITTONI, V., VALESINI, G., LAWSON, J., FITZGERALD, G., VIOLI, F. (1997). Enhanced lipid peroxidation in patients positive for antiphospholipid antibodies. Blood. 90: 3931-3935.

KANG, H. K., MORROW, J. D., ROBERTS, L. J., NEWMAN, J. H., BANERJEE, M.

(1993). Airway and vascular effects of 8-epi-prostaglandin F₂_α in isolated perfused rat lung. J. Appl. Phsyiol. 74: 460-465.

KLEIN, T., NEUHAUS, K., REUTTER, F., NUSING, R. M. (2001). Generation of 8- epi-prostaglandin F₂_α in isolated rat kidney glomeruli by a radical-independent mechanism. Br. J. Pharmacol. 133: 643-650.

KULMACZ, R. J., WANG, L. H. (1995). Comparison of hydroperoxide initiator requirements for the cyclooxygenase activities of prostaglandin H synthase -1 and

-2. J. Biol. Chem. 270: 24019-24023.

LANGENBACH, R., MORHAM, S. G., TIANO, H. F., LOFTIN, C. D., GHANAYEM, B. I., CHULADA, P. C., MAHLER, J. F., LEE, C. A., GOULDING, E. H., KLUCHMAN, K. D. (1995). Prostaglandin synthase-1 gene disruption in mice reduces arachidonic acid induced inflammation and indomethacin induced gastric ulseration. Cell. 83(3): 483-492.

LEO, A. M., ALEYNIK, S. I., SIEGEL, J. H., KASMIN, F. E., ALEYNIK, M. K., LIEBER, C. S. (1997). F₂-isoprostane and 4-hydroxynonenal excretion in human bile of patients with biliary tract and pancreatic disorders. Am. J. Gastroenterol.

92: 2069-2072.

MALLAT, Z., NAKAMURA, T., OHAN, J., LESECHE, G., TEDGUI, A., MACLOUF, J., MURPHY, R. C. (1999). The relationship of hydroxyeicosatetraenoic acids and F₂-isoprostanes to plaque instability in human carotid atheroslerosis. J. Clin. Invest. 103: 421-427.

MASFERRER, J. L., ZWEIFEL, B. S., SEIBERT, K., NEEDLEMAN, P. (1990). Selective regulation of cellular cyclooxygenase by dexamethasone and endotoxin in mice. J. Clin. Invest. 86: 1375-1379.

McALINDON, T. E., JACQUES, P., ZHANG, Y., HANNAN, M. T., ALIABADI, P., WEISMAN, B., RUSH, D., LEVY, D., FELSON, D. T. (1996). Do antioxidants micronutritients protect against the development and progression of knee osteoarthritis? Arthritis Rheum. 39: 648-656.

MONTINE, T. J., BEAL, M. F., CUDKOWICZ, M. E., O’DONNELL, H., MARGOLIN, R. A., MCFARLAND, L., BACHRACH, A. F., ZACKER W. E.,

ROBERTS, L. J., MORROW, J. D. (1999). Increased CSF F₂-isoprostanes concentration in probable AD. Neurology. 52: 562-565.

MORROW, J. D., AWAD, J. A., BOSS, H. J., BLAIR, I. A., ROBERTS, L. J. (1992). Non-cyclooxygenase derived prostanoids (F₂-isoprostanes) are formed in situ in phospholipids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10721-10725.

MORROW, J. D., AWAD, J. A., WU, A., ZACKERT, W. E., DANIEL, V. C., ROBERTS, L. J. (1996). Free radical generation of thromboxane-like compounds

(isothromboxanes) in vivo. J. Biol. Chem. 271: 23185-23190.

MORROW, J. D., HILL, K. E., BURK, R. F., NAMMOUR, T. M., BADR K. F., ROBERTS, L. J. (1990). A series of prostaglandin F₂-like compounds are produced in vivo in humans by a non-cyclooxygenase, free radical-catalyzed mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 9383-9387.

MORROW, J. D., MINTON, T. A., MUKUNDAN, C. R., CAMPBELL, M. D., ZACKERT, W. E., DANIEL, V. C. (1994). Free radical induced generation of isoprostanes in vivo: Evidence for the formation of D-ring and E-ring isoprostanes. J. Biol. Chem. 269: 4317-4326.

MORROW, J. D., MINTON, T. A., ROBERTS, L. J. (1992). The F₂-isoprostane, 8-epi- prostaglandin F₂_α, a potent agonist of the vascular thromboxane/endoperoxide receptor, is a platelet thromboxane/endoperoxide receptor antagonist. Prostaglandins. 44: 155-163.

MORROW, J. D., ROBERTS, L. J. (1999). Mass spectrometry of F₂-isoprostanes in biological fluids and tissues as measure of oxidant stress. Methods Enzymol. 300:

3-17.

NOUROOZ-ZADEH, J., HALLIWEL, B., ANGGARD, E. E. (1997). Evidence for the formation of F₃-isoprostanes during peroxidation of eicosapentaenoic acid. Biochem. Biophys. Res. Comm. 236: 467-472.

O’SULLIVAN , M. G., HUGGINS, E. M., MEADE, E. A., DEWITT, D. L., McCALL, C. E. (1992). Lipopolysaccharide induce prostaglandin H synthase-2 in alveolar macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1123-1127.

ÖHRVALL, M., TENBLAD, S., VESSBY, B. (1993). Lower tocopherol serum levels in subjects with abdominal adiposity. J. Int. Med. 234: 53-60.

PATRIGNANI P., SANTINI G., PANARA M. R., SCIULLI M. G., GRECO A., ROTONDO M. T., DI GIAMBERARDINO M., MACLOUF J., CIABATTONI G., PATRONO C. (1996). Induction of prostaglandin endoperoxide synthase-2 in human monocytes associated with cyclooxygenase-dependent F₂-isoprostane formation. Br. J. Pharmacol. 118: 1258-1293.

PORTER, N. A., FUNK, M. O. (1975). Peroxyl radical cyclisation as a model for prostaglandin biosynthesis. J. Org. Chem. 40: 3614-3615.

PRADELLES, P., GRASSI, J., MACLOUF, J. (1985). Enzyme immunoassay of eicosaniods using AchE as label: An alternative to RIA. Anal. Biochem. 57: 1170-

1173.

PRATICO, D. (1999). F₂-isoprostanes: sensitive and specific non-invasive indices of lipid peroxidation in vivo. Atherosclerosis. 147: 1-10.

PRATICO, D., BASILI, S., VIERI, M., CORDOVA, C., VIOLI, F., FITZGERALD, G. A. (1998). Chronic obstructive pulmonary disease is associated with an increase in urinary levels of iPF₂_α-III, an index of oxidant stress. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158: 1709-1714.

PRATICO, D., FITZGERALD G. A. (1996). Generation of 8-epi-prostaglandin F₂_α by human monocytes. Discriminate production by reactive oxygen species and PG G/H S-2. J. Biol. Chem. 271: 8919-8924.

PRATICO, D., LAWSON, J. A., FITZGERALD, G. A. (1995). Cyclooxygenase- dependent formation of the isoprostane, 8-epi-PGF₂_α. J. Biol. Chem. 270: 9800-

9808.

PRATICO, D., ROSSI, E., MERLI, M., RIGGIO, O., FITZGERALD, G. A., VIOLI, F.

(1998). Portal levels of the isoprostane iPF₂_α-III, a marker of lipid peroxidation, do not correlate with increased portal pressure in cirrhoric patients. J. Invest. Med. 46:

430-434.

PRATICO, D., SMYTH, E. M., VIOLI, F., FITZGERALD, G. A. (1996). Local amplification of platelet function by 8-epi-PGF₂_α is not mediated by thromboxane receptor isoforms. J. Biol. Chem. 271: 14916- 14924.

PRYOR, W. A., STANLEY, J. P., BLAIR, E. (1976). Auto-oxidation of polyunsaturated fatty acid: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11: 370-379.

REILLY, M., DELANTY, N., ROY, L., ROKACH, J., O’CALLAGHAN, P., CREAN, P., LAWSON, J. A., FITZGERALD, G. A. (1997). Increased formation of the isoprostanes iPF₂_α-I and 8-isoPGF₂_α in acute coronary angioplasty: Evidence for oxidant stress during coronary reperfusion in humans. Circulation. 96: 3314-3320.

ROBERTS, L. J., MONTINE, T. J., MARKESBERRY, W. R., TAPPER, A. R., HARDY, P., CHEMTOB, S., DETTBARN, W. D., MORROW, J. D. (1998). Formation of isoprostane-like compounds (neuroprostanes) in vivo from docosahexaenoic acid. J. Biol. Chem. 273: 13605- 13612.

SALVEMINI, D., SETTLE, S. L., MASFERRER, J. L., SEIBERT, K. CURRIE, M. G., NEEDLEMAN, P. (1995). Regulation of prostaglandin production by nitric oxide; an in vivo analysis. Br. J. Pharmacol. 114: 1171-1178.

SANGHA, O., STUCKI, G. (1998). Vitamin E in the therapy of rheumatic diseases. Z.

Rheumatol. 57: 207-214.

SAUTEBIN, L., IANARO, A., ROMBOLA, L., IALENTI, A., SALA, A., DI ROSA, A.

(1999). Cyclooxygenase-2 dependent generation of 8-epi-prostaglandin F₂_α by lipopolysaccharide-activated J774 macrophages. Inflamm. Res. 48: 503-508.

SAYAR, K. MELLI, M., (1999). Effect of combination misoprostol and indomethacin on eicosanoid production in carrageenan-induced air pouch inflammation in rats. Eur. J. Pharmacol. 369: 365-371.

SCHOTTELIUS, A. J., GIESEN, C., ASADULLAH, K., FIERRO, I. M., COLGAN, S. P., BAUMAN, J., GUILFORD, W., PERES, H. D., PARKINSON, J. F. (2002). An aspirin-trigerred lipoxin A₄ stable analog displays a uniqe topical anti- inflammatory profile. J. Immun.169: 7063-7070.

SEDGWICK, A. D., LEES, P. (1986). Studies of eicosanoid production in the air pouch model synovial inflammation. Agents Actions. 18: 429-438.

SITUNAYAKE, R. D., THURNHEM, D. I., KOOTATHEP, S., CHIRICO, S., LUNEC, J., DAVIS, M., McCONKEY, B. (1991). Chain breaking antioxidant status in rheumatoid arthritis: Clinical and laboratory correlates. Ann. Rheum. Dis. 50: 81-

86.

SMITH, C.J., ZHANG, Y., KOBOLIT, C. M., MUHAMMAD, J., ZWEIFEL, B. S., SHAFFER, A., TALLEY, J. J., MASFERRER, J. L., STEBERT, K., ISAKSON, P. C. (1998). Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13313-13318.

SMITH, W. L., ELING, T. E., KULMACZ, R. J., MARNETT, L. J., TSAI, A. (1992). Trosyl radicals and their roles in hydroperoxide-dependent activition and inactivation of prostaglandin endoperoxide synthase. Biochem. J. 31: 3-7.

SOUTHORN, P. A., POWİS, G. (1988). Free radicals in medicine. II. Involvement in human disease. Mayo Clinic Proc. 63: 390-408.

SOUVIGNET, C., CRACOWSKI, J. L., STANKE-LABESQUE, F., BESSARD, G.

(2000). Are isoprostanes a clinical marker for antioxidant drug investigation?

Fundam. Clin. Pharmacol. 14 : 1-10.

TAKAHASHI, K., NAMMOUR, T.M., FUKUNAGA, M., EBERT, J., MORROW, J. D., ROBERTS, L. J., BADR, K. F., (1992). Glomerular actions of a free radical-

KISALTMALAR

8-izoPG2α

8-izoprostaglandin F2α

TBARS

Tiobarbitürik asit reaktif bileşikleri

Tx

Tromboksan

vit E

Vitamin E

ÖZET

8-izoPG_2α

8-izoprostaglandin F_2α