|
T.C. ANKARA
ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL
ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU POLİSİKLİK
AROMATİK HİDROKARBONLARA
MARUZ
KALAN BİR GRUP İŞÇİDE
HÜCRESEL
İMMÜN FONKSİYONLARIN
İNCELENMESİ
Prof.Dr.Asuman KARAKAYA
98-03-00-07
Proje Başlangıç:
1998
Proje Bitiş: 2003 Rapor Tarihi:
31.03.2003
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - 2003 |
Investigations of
cellular immune functions in a group of workers exposed to polycyclic aromatic
hydrocarbons
Organik
maddelerin pirolizi yada tam yanmaması sonucu oluşan polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH), iyi bilinen insan
karsinojenleri arasında yer almaktadır. Araştırmalar karsinojenik
potansiyellerinin yanısıra immünotoksik etkilerinin de olduğunu ortaya
koymaktadır. İmmünotoksik potansiyelleri hayvan çalışmalarıyla ortaya
konulmakla birlikte insanlardaki etkileri hakkında az şey bilinmektedir.
Bu proje,
mesleksel olarak PAH’lara maruz kalan işçilerde bu maruziyetin olası
immünomodülatör etkilerini araştırmak üzere hazırlanmıştır. Doğal öldürücü
hücre aktiviteleri ve T-lenfositlerinin proliferatif yanıtları incelenmiş, PAH
maruziyeti ise idrarla atılan 1-hidroksi piren (1-OHP) metabolitinin analizi
ile izlenmiştir. Sonuçlar maruz kalmayan sağlıklı kontrol grubundan elde edilen
sonuçlarla kıyaslanmıştır.
Polycyclic
aromatic hydrocarbons (PAHs), formed by pyrolysis or incomplete combustion of
organic materials, are well known human carcinogens. It was suggested that
immunotoxic effects of PAHs contribute to their carcinogenic potential.
Although immunotoxic potential of PAHs has been well documented in animal
studies, little is known about the effects in humans.
This project
was performed in order to investigate possible immunomodulatory effects of PAH
exposure in occupationally exposed workers. Natural killer cell activities and
T- lymphocyte proliferative responses were analyzed. Exposure to PAHs was
monitored by analysis of 1-hydroxy pyrene (1-OHP) metabolite in urine. The
results were compared to those obtained in healthy unexposed controls.
Polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH) çevrede yaygın olarak bulunan
kimyasal bir gruptur. Karbon ve hidrojen içeren organik maddelerin pirolizi
veya tam olmayan yanmalar sonucu oluşan 3 veya daha fazla aromatik
halkalı bileşiklerdir. PAH’lar deney hayvanları ve insanlarda kuvvetli
karsinojenik potensiyele sahip maddelerdir.Son
yıllarda gelişen moleküler biyoloji teknikleri ile PAH’ların karsinojenik
mekanizmalarının anlaşılmasında büyük bir gelişim olmuştur. Özetle PAH’lar
tümör başlatıcı, geliştirici ve ilerletici özellikleri olan potent
karsinojenlerdir. Aynı zamanda deney hayvanlarında yapılan çalışmalarla bu
maddelerin immün sistemi baskılayıcı oldukları gösterilmiştir. Karsinojenik
potensiyellerinin yüksek oluşuda bu immünotoksik etkilerine bağlanmaktadır.
PAH’lar hem hücresel (cell mediated immunity-CMI) ve hemde hümoral immüniteyi
inhibe etmektedirler. Özellikle benzo(a)piren (BaP), 3-metilkolantren (3-MC) ve
7,12-dimetilbenz(a)antrasen (DMBA)’in, in vivo olarak hayvan modellerinde ve
insan periferal kan hücreleri ile yapılan in vitro testlerde çok yüksek
derecede immünotoksik olduğu saptanmıştır (1). Özellikle hücresel immün
fonksiyonlar PAH’lar tarafından modülasyona hassastır ve çeşitli araştırmalar
PAH’ların mitojenlere T hücre yanıtlarını, gecikmiş tip hipersensitivite
reaksiyonlarını, NK ve sitotoksik T hücreleri aktivitelerini, tümör ve
patojenlere konakçı direncini baskıladığını doğrulamaktadırlar (2,3).
Epidemiyolojik
veriler, endüstrileşmiş ülkelerde tüm kanser ölümlerinin %4’ünün nedeninin
mesleksel olarak maruz kalınan kimyasal karsinojenler olduğunu göstermektedir.
Bu karsinojenler içinde PAH’lar etkiledikleri işçi sayısı ve etkinlik yönünden
ilk sıralarda yer alırlar. PAH’lardan 11’i Uluslararası Kanser Araştırma Kurumu
(IARC)’nun sınıflandırmasında karsinojenik olarak tanımlanmaktadır (4).
Mesleksel olarak PAH’lara başlıca; kok kömürü, grafit elektrot, katran ve
ürünleri, karbon siyahı ve bitümenin elde edilmesi ve kullanılması esnasında
maruz kalınmaktadır. Diğer mesleksel maruz gruplar ise baca temizleyicileri ve
araba tamir atölyelerinde çalışanlar ve trafik polisleridir. NIOSH (The
National Institute for Occupational Safety and Health), Amerika Birleşik
Devletlerinde sadece yol yapımı
(asfaltlama), çatı kaplama, boru kaplama,ve
briket yapımında kullanılan bitümene 2 milyon civarında işçinin maruz kaldığını
tahmin etmektedir (5).
Türkiye’de işçi
sağlığı ve güvenliği ile ilgili hizmet ve kontroller son derece yetersizdir.Gerek çalışanların eğitimsiz oluşu, gerekse çok
sayıda küçük iş yerlerinin denetiminin zorluğu bu iş yerlerinde iş hijyeni
kurallarının uygulanamaması sonucunu getirmektedir. Bu yetersiz koşullarda
maruziyet düzeyinin limit değerleri aşmasına ve bu gibi maddelere maruz
kalanların önemli bir risk grubunu oluşturmalarına neden olmaktadır. PAH’lar
ile yapılan immünotoksikolojik çalışmalar hep hayvan modellerinde
yürütülmektedir. İnsanda immünolojik etkileri ile ilgili çok az bilgi
mevcuttur. İnsan sağlığının korunmasında önemli rolü olan immün sistemdeki
değişimlerin yorumlanması ve hayvan çalışmalarından elde edilen sonuçların
insana ekstrapolasyonu son derece zordur. Bu bağlamda direkt maruz gruplarla
çalışabilmemiz doğrudan insan verilerine ulaşabilmemizi sağlamaktadır. Daha
önce Ankara Büyükşehir Belediyesi Asfalt İşleri Şube Müdürlüğünde çalışan
işçilerde gerçekleştirdiğimiz bir çalışmada; PAH’lara maruziyetin göstergesi
olarak 1-OH piren atılımını ve ayrıca PAH’ların beyaz kan hücre
sayıları, serum immunoglobulin düzeyleri ve lenfosit alt grupları üzerine olası
etkilerini inceledik. PAH’ların insan immün sistem üzerine etkilerini
inceleyen söz konusu çalışma
“Toxicology” dergisinde (1999)
yayınlanmıştır(6).
Bu
çalışmamızın bir devamı niteliğinde olan bu projede, PAH’lara yoğun olarak
maruz kalınan kok kömürü üretimi ve asfalt kaplama işlerinde çalışan işçilerde
doğal immünite ve hücresel immün fonksiyonların göstergeleri olan NK hücre
aktiviteleri ve T-lenfositlerinin proliferatif yanıtları incelemiş ve idrar
1-OH piren konsantrasyonları ölçülerek PAH maruziyeti saptanmıştır. Bu proje
kapsamında yer alan değerlendirmeler ülkemizde ilk kez yapılmış olacaktır.
Kaynak taramalarımızda, yurt dışında yapılmış konu ile ilgili, ancak farklı
parametrelerin incelendiği birkaç araştırmaya rastlanmıştır (7-9).
Bu bağlamda proje sonuçları,
sadece hedeflenen immün fonksiyonlar üzerine PAH’ların olası etkilerini ortaya
koymakla kalmayacak, ayrıca incelenen işçi grubunda karşılaşılabilecek
immünotoksisite riskinin değerlendirilmesine de katkıda bulunacaktır.
III- Materyal ve Yöntem
Maruz grup, Ankara Büyükşehir
Belediyesi Asfalt İşleri’nde ve bir kömür işletmesinde çalışan ve PAH’lara maruz kalan
işçilerden, kontrol grubu ise mesleki
olarak PAH’lara maruz kalmayan, ancak yaş, cinsiyet, sigara içme alışkanlığı ve
sosyoekonomik şartlar açısından maruz grupla uyumlu işçilerden seçilmiştir. Bu
gruplardan kan ve idrar örnekleri alınmıştır.
Çalışmamızda
incelenen immünolojik parametrelerden ilki olan hücresel sitotoksisite hücresel
DNA fragmantasyonu esasına dayanan ELİSA yöntemi ile değerlendirilmiştir. 51Cr salınım yöntemine alternatif
olarak geliştirilmiş olan bu yöntem ülkemizde ilk kez tarafımızdan bu projede
kullanılmıştır. Yöntem, hücre kültürü süpernatantları ve hücre
lizatlarının sitoplazmalarındaki BrdU (5-bromo-2’-deoksiüridin)
ile işaretlenmiş DNA parçalarının tayinine dayanan fotometrik bir enzim
immünoassaydir. Yöntemin esası, kantitatif sandviç tip
enzim immünoassay (ELISA) dir. DNA ve BrdU’ya karşı geliştirilmiş iki fare
monoklonal antikoru kullanılmakta bu da BrdU ile işaretlenmiş DNA parçalarının spesifik tayinine ve ölçümüne olanak tanımaktadır. İmmün
sistem hücreleri (sitotoksik T- lenfositleri, NK hücreleri, LAK hücreleri)
hasar görmüş, enfekte ve mutasyona uğramış hedef hücreleri tahrip edebilen
hücrelerdir. Bu hücrelerin sitolitik potansiyellerinin değerlendirilmesinde kullanılan
standard metod 51Cr salınım yöntemidir. Bu yöntem radyoizotopun
canlı hücre sitoplazmasına girmesine ve plazma
hasarına bağlı olarak salınan radyoaktivitenin ölçümüne dayanmaktadır. Bu
yöntemin en büyük dezavantajı radyoaktif madde kullanımı ve işaretli
hücrelerden spontan 51Cr salınımının yüksek oluşudur. Bu da
–inkübasyon süresinin uzatılması gerektiği durumlarda- düşük sitolitik
aktivitelerde sınırlı duyarlığa neden olmaktadır. Metabolik işaretleyici ajan
olarak 51Cr yerine BrdU kullanılması, 51Cr salınım
yöntemi kadar hassas olması, aynı anda çok sayıda örnek ile çalışılabilmesi, background interferasyonunun düşük olması, hücrelerin
yıkanmasının gerekmemesi (bu işlem hücre kaybına ve aktivitede azalmaya yol
açabilmektedir) ve standard metodlarla ilişkili sonuçların elde edilmesi bu
alternatif yönteme üstünlük kazandırmaktadır.
Projemizde incelenen ikinci parametre, T-hücrelerinin bu hücrelere özgül mitojen olan PHA’ya karşı gösterdikleri proliferatif yanıtlardır. T-hücrelerinin proliferasyonu ELISA (BrdU) (kolorimetrik) yöntemiyle tayin edilmiştir. 3H-timidin yöntemine bir seçenek olarak geliştirilen bu yöntem daha önceki projelerimizde de ilk kez tarafımızdan kullanılmıştır. Proliferasyon deneylerinde son yıllarda kullanılmaya başlanan bu yöntem, çeşitli yararları nedeniyle, bu tip çalışmaların klasik yöntemi olan 3H-timidin yöntemine büyük üstünlük sağlamıştır. Yöntem; prolifere olan hücrelerde DNA içine timidin yerine-pirimidin analoğu olan- BrdU’nun katılımı esasına dayanmaktadır. BrdU, DNA içine katılımdan sonra enzim immünoassay ile ölçülmektedir. Hücresel proliferasyon DNA’nın replikasyonunu gerektirdiği için, DNA sentezinin izlenmesi hücre proliferasyonunu gösteren indirekt bir parametre olmuştur. Ancak mitotik olarak aktif hücrelerin DNA’larının 3H-timidin ile işaretlenmesi yolu ile uygulanan klasik yöntemin bir takım dezavantajları bulunmaktadır. Öncelikli sakıncası radyoizotopların kullanılmasıdır. Bu nedenle radyoaktiviteden koruyucu önlemlerin sağlanması yanında, cell harvester ve scintillation counter gibi özel ve pahalı cihazlara gereksinim duyulması da ayrı sorunlar yaratmaktadır. 3H-timidin yerine BrdU’nun kullanılması ile bu konuda önemli bir gelişme olmuştur. Kolay, hızlı ve nonradyoaktif bir yöntem olması yanında ayni zamanda çok sayıda numune ile çalışılabilmesi ve 3H-timidin yöntemi kadar hassas olması metodu üstün kılmaktadır. Değişik rodent ve insan hücre sistemlerinde bu yöntemle 3H-timidin yöntemi arasında iyi bir korelasyonun olduğu ortaya konulmuştur.
İdrarla 1-OH piren atılımı,
Jongeneelen ve arkadaşlarının tekniği kullanılarak ölçülmüştür. Alınan idrar
örneklerinin analize hazırlanması amacıyla, idrarda konjugat halinde bulunan
metabolit, enzimatik hidroliz ile serbest hale geçirilip C18 kolonunda katı faz
ekstraksiyonu uygulanmış ve bu şekilde hazırlanmış olan numuneler,
gradient-HPLC yöntemi ile analiz edilmiştir (10). Analiz sırasında floresan
detektör kullanılmıştır. Bulunan idrar 1-OH piren konsantrasyonları
ise kreatinine göre düzeltilerek saptanmıştır.
Sonuçların hesaplanmasında:
|
|
Maruz Grup (n=23) |
Kontrol Grubu (n= 15) |
|
|
Asfalt işçileri (n=10) |
Kömür işçileri (n=13) |
||
|
Yaş (ortalama) |
38.5 |
44.5 |
40,6 |
|
Çalışma süresi (ortalama, yıl) |
12.9 |
20.1 |
13,9 |
|
Sigara içenlerin sayısı |
9 |
11 |
6 |
B- İdrar 1-OH piren ölçümleri
İdrar 1-hidroksi piren (1-OHP)
ölçümleri, HPLC yöntemi ile tayin edilmiş ve bulunan konsantrasyonlar,
idrar kreatinin ölçümleri ile düzeltilerek verilmiştir. Kontrol ve maruz kalanların
yaş, maruziyet süreleri ve idrar 1-OH piren seviyeleri Tablo 2’te
verilmektedir.
Tablo 2: Kontrol ve
maruz kalanların yaş, maruziyet süreleri ve idrar 1-OH piren seviyeleri
|
|
Kontrol grubu (n=15) |
Asfalt işçileri (n=10) |
Kömür işletmesinde çalışan işçiler (n=13) |
|
Yaş (ortalama, aralık) |
40.66 (33-47) |
38.50 (32-45) |
44.50 (40-48) |
|
Maruziyet süresi (yıl, ortalama, aralık) |
13.9 (4-24) |
12.90 (4-22) |
20.08 (17-25) |
|
İdrar 1-OHP seviyeleri (mean±S.E., mmol/ mol kreatinin) |
0.39±0.19 |
0.54±0.58 |
0.98±0.66* |
*
P<0.05 Kontrole göre anlamlılık seviyesi
C- NK aktiviteleri
Doğal öldürücü hücre fonksiyonları Bölüm III de belirtildiği gibi hücresel DNA fragmantasyonu esasına dayanan ELİSA yöntemi ile değerlendirilmiştir. Farklı alanlarda PAH’lara maruz kalan iki işçi grubu ve kontrol grubundan elde edilen ortalama aktivite sonuçları Tablo 3 de verilmektedir.
|
NK aktivitesi, (ortalama) (efektör hücre/hedef hücre) |
Kontrol grubu (n=15) |
Asfalt işçileri (n=10) |
Kömür işletmesinde çalışan işçiler, (n=13) |
|
10:1 |
0.12±0.031 |
0.15±0.020 |
0.09±0.016 |
|
5:1 |
0.10±0.020 |
0.15±0.015 |
0.08±0.014 |
|
2.5:1 |
0.08±0.014 |
0.14±0.025 |
0.08±0.011 |
Asfalt ve kömür işçilerinde
kontrole göre NK aktivitesi bakımından istatistiksel olarak bir fark
bulunamamıştır.
T-hücrelerinin proliferasyonu ELISA (BrdU) (kolorimetrik) yöntemiyle tayin edilmiştir. 2.5 ve 5 mg/ml fitohemaglutinin’e (mitojen) maruz bırakılan lenfosit kültüründeki ortalama proliferasyon, prolifere olan hücrelerde DNA içine timidin yerine-pirimidin analoğu olan- BrdU’nun katılımı üzerinden Tablo 4’de verilmektedir.
|
Proliferasyon, (ortalama) (BrdU katılımı üzerinden) |
Kontrol Grubu (n=13) |
Asfalt işçileri (n=10) |
Kömür işletmesinde çalışan işçiler (n=13) |
|
Ortalama BrdU katılımı ±SE (Absorbans) |
|||
|
Kontrol |
0.61±0.15 |
0.44±0.14 |
0.51±0.09 |
|
2.5 mg /ml PHA |
1.85±0.49** |
1.50±0.44** |
1.36±0.68** |
|
5 mg /ml PHA |
1.56±0.51* |
1.20±0.43* |
1.18±0.64* |
* P<0.01 2.5 mg /ml PHA ve kontrole göre
anlamlılık seviyesi
** P<0.05 kontrole göre anlamlılık seviyesi
1- DAVILA
DR, MOUNHO BJ, BURCHIEL SW, Toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons to the
human immune system: Models and mechanisms. TEN, 4: 5-9 (1997)
2- WHITE
KL, KAWABATA TT, LADICS GS, Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon
immunotoxicity. In Immunotoxicology and
Immunopharmacology, JH Dean, MI Luster, AE Munson, I Kimber, eds. Raven
Press, New York, pp 123-142 (1994)
3- DAVILA
DR, DAVIS DP, CAMPBELL K, CAMBIER JC, ZIGMOND LA, BURCHIELSW, Role of
alterations in Ca2+ - associated signaling pathways in the immunotoxicity
of polycyclic aromatic hydrocarbons. Journal
of Toxicology and Environmental
Health, 44: 101-126 (1995)
4- International Agency for Research on Cancer:
Polynuclear Aromatic Compounds, Part 1, Chemical Environmental and Experimental
Data. Monographs, 32, Lyon , France (1983)
5- LaDou J, Occupational Medicine,
pp. 349, Appleton & Lange, New Jersey (1990)
6- KARAKAYA
A, YÜCESOY B, TURHAN A, ERDEM O, BURGAZ S, KARAKAYA AE: Investigation of some
immunological functions in a group of asphalt workers exposed to polycyclic
aromatic hydrocarbons. Toxicology, 135:43-47,
1999
7- SZCZEKLIK
A, SZCZEKLIK J, GALUSZKA Z, MUSIAL J, KOLARZYK E, TARGOSZ D, Humoral
immunosuppression in men exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons and
related carcinogens in polluted environment. Environ. Health Perspect.
102: 302-304 (1994)
8- WINKER
N, TUSCHL H, KOVAC R, WEBER E, Immunological investigations in a group of
workers exposed to various levels of polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Appl. Toxicol., 17: 23-29 (1996)
9- WINKER N, TUSCHL H, KOVAC R, WEBER E:
Immunological investigations in a group of workers exposed to various levels of
polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Appl.Toxicol.,
17(1):23-29, 1997.
10- JONGENEELEN
FJ, ANZION RBM, HENDERSON P.Th, Determination of hydoxylated metabolites of Polycyclic
Aromatic Hydrocarbons in urine. Journal of Chromatography 413: 227-232,
1987.
Sunumlar:
Sonuçlar, 13-18
Eylül 2002 tarihleri arasında Macaristan-Budapeşte’de düzenlenmiş olan EUROTOX
2002 kongresinde de bildiri olarak sunulmuştur.
KARAKAYA A., ATEŞ İ.,
YÜCESOY B.,
Effects of Occupational Chronic PAH Exposure on Immune Functions. Abstracts of
EUROTOX 2002, Budapest, Hungary.
Yayınlar:
Sonuçlar, yayın haline
getirilerek Toxicology dergisine gönderilmiştir.