T.C.

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

ARAŞTIRMA FONU PROJESİ

KESİN RAPORU

İNSAN VE KOYUNLARDA HİDATİDOZUN İNDİREKT FLORESAN ANTİKOR TEKNİĞİ İLE TEŞHİSİ

Proje Yürütücüsü : Prof. Dr. Ahmet DOĞANAY

Proje Numarası : 2000-08-10-023

Başlama Tarihi : 03.01.2001

Bitiş Tarihi : 10.09.2001

Rapor Tarihi : 24.09.2001

Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu Müdürlüğü

Ankara-2001

İNSAN VE KOYUNLARDA HİDATİDOZUN İNDİREKT FLORESAN ANTİKOR TEKNİĞİ İLE TEŞHİSİ

The Diagnosis of Hydatidosis in Human and Sheep by Indirect Flourescence Antibody Technique

Ahmet Doğanay Ayşe Burgu Mehmet Tanyüksel

Oğuz Sarımehmetoğlu Bahadır Gönenç Esma Kozan

Alparslan Yıldırım

Özet

Hidatidoz, insan ve hayvan sağlığını yakından ilgilendiren önemli bir paraziter hastalıktır. Dünyada birçok ülkede yaygın olarak görülen bu hastalık, Türkiye'de de gerek halk sağlığı, gerekse ekonomik açıdan önemli bir sorun oluşturmaktadır. Hastalığın teşhisinde radyolojik yöntemlerin yanı sıra serolojik teşhis yöntemlerinden de yararlanılmaktadır.

Bu çalışmada, hidatidozun paraziter hastalıkların teşhisinde oldukça geniş kullanım alanı bulunan IFAT (indirekt floresan antikor tekniği) ile teşhisi araştırılmıştır. Bu amaçla, koyun karaciğerinden elde edilen kist hidatik sıvısından santrifüj edilerek toplanan ve -70⁰C de parafilm rulolar içerisinde dondurulan protoskolekslerden -20⁰C de çalışan kryostat mikrotomu ile 5 mm kalınlığında kesitler alınarak antijen olarak kullanılmıştır.

Serumlar mezbahada kesimi yapılan koyunlardan alınan kanlardan çıkarılmış, ayrıca kanları alınan koyunların gerek kist hidatik gerekse diğer helmint enfeksiyonları yönünden organ muayeneleri yapılmıştır. Ayrıca koyunların dışkıları da paraziter yönden kontrol edilmiştir.

Çalışmada koyunların yanı sıra insan serumları da incelenerek protoskoleks kesit antijenleri ile insanlarda hastalığın teşhisinde IFAT’ın spesifite ve sensitivitesi araştırılmıştır.

Sonuç olarak, IFAT ile hidatidozun insanlarda erken dönemde teşhisinde spesifitenin %80, sensitivitenin %70, koyunlarda ise hem spesifite hem de sensitivitenin %90 olduğu belirlenmiştir.

Anahtar kelimeler: Kist hidatik, IFAT, insan, koyun

Summary

Hydatidosis caused by hydatid cyst is a widespread disease in human and animals in the world. It is very hazardous to human and animal health. This disease is also very common in Turkey, which causes big economic losses.

In the diagnosis of parasitic diseases, there have been important improvements by applying Indirect flourescence antibody technique (IFAT). Therefore, this technique has become an important diagnostic tool in the parasitology laboratories. Protoscolices from sheep liver collected by centrifugating hydatid cyst fluids. Protoscolices rolled in parafilms were frozen at -70 ⁰C and sections in 5mm were taken from these rolls by using cryostat microtome working at -20 ⁰C and used as antigen in this study.

Blood collected from sheep slaughtered at the abattoirs and sera were obtained from these blood samples. Organs of these sheep were examined for hydatid cysts and other helminth infections. Faecal samples from these sheep were also examined in the laboratory.

In this study, the sera from human patients infected with hydatidosis were examined by using same antigens by IFAT in addition to sheep sera to determine specificity and sensitivity of this technique.

Specificity and sensitivity of IFAT by using protoscolex antigens were determined as 80% and 70% respectively in early stage of the disease in humans, while these were determined as 90% in sheep infected with hydatidosis.

Key words: Hydatid cyst, IFAT, human, sheep,

II. Amaç ve Kapsam

Echinococcus granulosusus'un olgunları köpek, kurt, çakal ve diğer kanidelerin ince bağırsaklarında, larvası olan hidatik kist ise koyun, keçi, sığır, domuz ve diğer birçok evcil ve yabani memelide, ayrıca insanda başta karaciğer ve akciğer olmak üzere çeşitli organ ve dokularda bulunmaktadır (2,13,19).

Hidatik kistin meydana getirdiği hidatidoz, insan ve hayvanlarda yaygın olarak görülen bazen de öldürücü olabilen bir hastalıktır. Dünyada birçok ülkede yaygın olarak görülen bu hastalık, Türkiye'de de gerek insan sağlığı, gerek ekonomik açıdan önemli bir sorun oluşturmaktadır (2,13).

Hidatidozun, klinik semptomlarının ve parazitolojik bulgularının spesifik olmamaması teşhis edilmesinde sıkıntılar yaratmaktadır. Özellikle yeni oluşmakta olan kistlerin radyografi ve ultrasonda tespit edilmesi oldukça güç olmaktadır. Hastalığın erken tanısı şüphesiz tedavi şansını artırmaktadır (2,13,19).

Hidatidozun floresan antikor tekniği ile teşhisinde, antijen olarak; dondurulmuş parazitli doku kesitleri, scoleks ve kistik membranın kullanıldığı çalışmalardan olumlu sonuçlar alındığı bildirilmiştir (4,5). Echinococcus granulosus'un larva ve olgun formlarının antijenik karşılaştırılmasının yapıldığı bir başka çalışmada da, larvaların antijenik aktivitesinin daha yüksek olduğu belirtilmiştir (1).

Kist sıvısı ve donmuş skoleks kesitleri antijen olarak kullanılarak üniloküler ve mültiloküler hidatidozun teşhisi amacı ile uygulanan CF(Complement Fikzasyon), IFAT ve IHAT(Indirekt hemaglutinasyon) teknikleriyle üniloküler kistlerde sıra ile %77, %94, %89; multiloküler kistlerde ise, %36, %100 ve %100 oranlarında başarı sağlanmıştır. Bununla birlikte kontrol gruplarında testlerin tümünde bazı yalancı pozitif reaksiyonların olduğu da kaydedilmiştir (15).

Üçyüz koyun serumunu IFAT ve IHAT ile test eden Şenlik (26), 1/128 ve daha yukarı titrelerde IFAT’ın sensitivitesini %78.95, spesifitesini %92.57, yalancı negatif reaksiyonları %21.05, yalancı pozitif reaksiyonları da %7.43; 1/256 ve daha yukarı sulandırmalarda IHAT’ın sensitivitesini %78.29, spesifitesini %77.03, yalancı negatif reaksiyonları %21.71, yalancı pozitif reaksiyonları da %22.97 olarak bildirmiştir.

Gore ve ark. (12), antijen olarak E. granulosus skolekslerinin ekstraktını kullanarak floresan antikor tekniğini uygulamışlar ve E. granulosus antijeni ile E. multilocularis'in teşhisinin mümkün olduğunu belirtmişlerdir. Beggs ve ark. (3), hidatidozun floresan antikor tekniği ile teşhisinde, dondurularak kurutulmuş skoleksleri kullanarak çok iyi sonuçlar aldıklarını bildirmişlerdir. Coudert ve ark. (4), floresan antikor tekniğinin CF tekniğinden daha duyarlı olduğunu kaydetmişlerdir.

Taenia saginata kesitleri antijen olarak kullanılarak, IFAT ile sığır sistiserkozunun teşhisi amacıyla yapılan bir çalışmada (11), enfeksiyondan 2 hafta sonra 1/40 titrede antikor saptanmış olup, 4-6 hafta içinde titrelerin 1/160-1/640’a ulaştığı, 18-23 hafta sonra bile pozitif reaksiyonların görülebildiği kaydedilmiş ve sistiserkozun teşhisinde IFAT’ın diğer serolojik teşhis metodlarından daha üstün bir test olduğu belirtilmiştir.

Domuzlardaki sistiserkozun IFAT ile teşhisi amacı ile yapılan bir çalışmada (17), antijen olarak Cysticercus celulosae'nın skoleks kesitleri ve Taenia solium yumurtaları kullanılmış ve test sonucunda en duyarlı antijenin %90.38’lik sonuç veren T.solium yumurtası ile hazırlanan antijen olduğu saptanmıştır. Çalışmada (17), en iyi sonuçların 1/10 sulandırmada alındığı kaydedilmiştir.

Türkiye'de Tınar tarafından koyunlarda Fasciola gigantica'nın erken teşhisi amacıyla yapılan bir çalışmada (27) 2 aylık genç F. gigantica kesitleri antijen olarak kullanılarak IFAT uygulanmış ve enfeksiyonun 20. gününden itibaren hastalığın teşhisinin mümkün olabileceği saptanmıştır.

Oğuz ve ark. (20), Fasciola hepatica'nın teşhisinde IPT(Immunperosidaz) ve IFAT'ı karşılaştırmalı olarak kullanmışlar ve her iki testin de fasciolosisin teşhisinde başarı ile kullanılabileceğini bildirmişlerdir.

Schistosomosisin IFAT ile serolojik teşhisi amacıyla yapılan bir çalışmada (24), enfekte 50 kan serumundan 48’i pozitif reaksiyon verirken, sağlıklı 36 hastanın hiçbirisinde yalancı pozitif reaksiyona rastlanmamıştır.

Filariosisin IFAT ve IHAT ile teşhisi amacıyla olgun, mikrofiler ve yumurta antijenleri kullanılarak yapılan çalışmalarda (6,9,18,28) olumlu sonuçlar alındığı, ancak kros reaksiyonların da görüldüğü bildirilmiştir.

Trichinellosisin, IFAT ile teşhisi amacıyla yapılan çalışmalarda antijen olarak kaslardaki Trichinella spiralis larvaları, larvaların kesitleri kullanılmış ve larvaların antijenik yerlerinin kütiküla , ağız ve anal kısımlarının olduğu bildirilmiştir (7,8,10,16,22).

Sarımehmetoğlu (23), Toxocara canis ile deneysel enfekte farelerde visceral larva migransın IFAT ve IHAT ile teşhisi konulu çalışmasında; IFAT’ın daha spesifik, IHAT’ın ise daha duyarlı olduğunu bildirmiştir.

III. Materyal ve Yöntem

Antijen Hazırlanması: Koyun karaciğerinden elde edilen kist hidatik sıvısı 1000xg de 30 dakika santrifüj edilerek protoskoleksler çöktürülüp toplanmıştır. Protoskoleksler üzerine formaldehitin damıtık sudaki %10 luk solusyonu konarak tespit edilmiş ve daha sonra 0.5ml sıvıda belli sayıda (4000-6000adet/ml) bulunduracak şekilde sulandırılmıştır. 0.75ml lik ependorf tüplere konulan belirli sayıdaki protoskoleksler -70°C da dondurulmuştur. Donmuş haldeki protoskoleksler ependorf tüplerden alınıp parafilmle sarılarak tekrar -70°C a konulmuş ve kesit gününe kadar muhafaza edilmiştir.

Kesit antijenlerinin hazırlanması için dipfirizden çıkartılan parafilme sarılı protoskolekslerden -20°C da çalışan kryostat mikrotomu ile 5 µm kalınlığında kesitler alınarak lamlara monte edilmiştir. Kesitler Cornay solusyonunda 5 dakika, daha sonra da 3 ayrı kapta bulunan absolut alkolde 1’er dakika bekletilerek tespit edilmiş ve -70 °C lık dipfirizde lam kutularında üstleri alüminyum folye ile ışık almayacak bir şekilde örtülerek saklanmıştır (21,23).

Serumların Elde Edilmesi: Kazan Belediyesi Mezbahası'nda kesimi yapılan koyunların kanları steril tüplere alındıktan sonra kesimleri takip edilerek kist hidatikli olanların ve olmayanların serumları ayrılmıştır. Ayrıca pozitif ve negatif kontrol olarak serumları ayrılan koyunların dışkı ve organ muayeneleri de yapılarak distomatosis, cysticercosis, monieziosis, trichostrongylosis, metastrongylosis gibi enfeksiyonlar yönünden pozitif veya negatif oldukları kaydedilmiştir. Bu serumların yanında, piyasada hazır satılan ve herhangi bir parazit enfeksiyonu taşımayan, tamamen steril olan koyun serumu da kullanılarak negatif serumların doğrulaması yapılmıştır.

Kist hidatikli insan serumları ise, Gülhane Askeri Tıp Akademisi’nde ticari ELISA kiti ile ayrıca radyolojik ve ultrasonografik bulgularla kist hidatikli olduğu kesin teşhis edilen hastalardan sağlanmıştır.

Serumların Sulandırılması: Serumlar, test gününde Coons buffer solusyonu ile 1/2, 1/4, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256’ya kadar sulandırılarak muayeneye hazırlanmıştır.

Testte Kullanılan Solusyonlar:

a-Cornay tespit solüsyonu:

Asetik asit-----20ml

Kloroform-----60ml

Absolut alkol-120ml

b-Coons buffer solüsyonu:

Na₂HPO₄x2H₂O-1.78gr

KH₂PO₄------------0.136gr

Distile su------------1000ml

pH=7.2-7.4

c-Evans blau boya solüsyonu:

Evans blau----100mg

Coons buffer--500ml

Testin yapılışı: Serumların sulandırılmaları, Coons buffer solüsyonu ile yapılmıştır.

Sulandırılan serumlar, önceden numaralandırılmış hazır kesitler üzerine, kesit yüzeyini örtecek kadar damlatılmıştır.

Üzerlerine serum damlatılan kesitler, 37°C da, rutubetli ortamda 30 dakika etüvde tutulmuştur.

Etüvden alınan lamlar, hafifce distile su ile yıkandıktan sonra içinde Coons buffer bulunan 3 kapta sırayla 5 er dakika tutularak tekrar distile sudan geçirilmiştir.

Kesitler havada kurutulduktan sonra üzerlerine Coons buffer ile sulandırılan konjugat damlatılıp, tekrar 37°C da rutubetli ortamda 30 dakika inkubasyona bırakılmıştır.

Etüvden alınan lamlar, içinde Coons buffer bulunan 3 kapta, 5’er dakika yıkandıktan sonra, Evans blau’nun 1/5000‘lik solüsyonunda 10 dakika tutulmuştur.

Evans blau’dan çıkartılan lamlar, içinde Coons buffer bulunan 3 kapta sırasıyla 10’ar dakika tutulup distile suyla hafifçe yıkandıktan sonra havada kurumaları beklenmiştir.

Kuruyan kesitlerin üzerine 1 kısım Coons buffer ve 9 kısım gliserin karışımından bir damla konduktan sonra lamelle kapatılarak floresan mikroskopta incelemeye hazır hale getirilmiştir (23,27).

Muayene için Carl Zeiss’in basınçlı cıva buharı ihtiva eden ışık kaynaklı floresan mikroskobu kullanılmıştır. Muayene karanlık saha kondansörü ile karanlık odada yapılmıştır.

Testte, kist hidatik protoskoleks kesit antijenlerinin parlak sarımsı-yeşil renk verdiği durumlar pozitif (Şekil 1), protoskoleks kesitinin kırmızı renk ve mat-gri renk verdiği durumlar negatif olarak değerlendirilmiştir (Şekil 2).

Spesitivite ve sensitivite oranlarının hesaplanması, ilgili formüllere* göre yapılmıştır (14,25).

Çalışma materyali için Kazan Belediye Mezbahası’ndan alınan ve organ muayenesi sonucu kist hidatik bakımından pozitif ve negatif olarak ayrılan kan serumlarının yanında, distamatosis, trichostrongylosis ve cyticercosis bakımından koyunların dışkı ve organ kontrolleri yapılarak pozitif veya negatif oldukları kaydedilmiştir.

____________________________________________________________

*

Sensitivite= a x 100 Spesifite= d x 100

a+c b+d

a: Enfekte serumlarda pozitif bulunan test sonuçları (gerçek pozitif)

b: Enfekte olmayan serumlarda pozitif bulunan test sonuçları (yalancı pozitif)

c: Enfekte serumlarda negatif bulunan test sonuçları (yalancı negatif)

d: Enfekte olmayan serumlarda negatif bulunan test sonuçları (gerçek negatif)

IV. Analiz ve Bulgular

Koyunların kan serumlarının IFAT ile kontrollerinde şu sonuçlar alınmıştır.

Enfeksiyon grubundaki toplam 10 serumdan 9’u IFAT ile pozitif reaksiyon vermiştir. Organ muayenesi ile kist hidatik bakımından pozitif olduğu belirlenen 1 koyuna ait serum ise, test sonucu yalancı negatif reaksiyon vermiştir. Pozitif reaksiyon veren 9 enfekte grubu serumdan, 1 serum (%11.1’i) 1/16 sulandırmaya, 1 serum (%11.1’i) 1/32 sulandırmaya, 1 serum (%11.1’i) 1/64 sulandırmaya, 5 serum (%55.5’i) 1/128 sulandırmaya, 1 serum da (%11.1’i) 1/256 sulandırmaya kadar pozitif reaksiyon vermiştir. Genel olarak pozitif kontrol olarak ayrılan serumların IFAT ile kontrollerinde %90’ı pozitif sonuç vermiş, böylece organ muayenesi ile pozitif oldukları belirlenen hayvanların kist hidatik bakımından enfekte oldukları testçe de doğrulanmıştır.

Negatif kontrol grubundaki toplam 10 serumdan 9’u IFAT ile negatif reaksiyon verirken, 1 serum (%10’u) yalancı pozitif reaksiyon vermiştir. Negatif kontrol grubu olarak ayrılan ancak pozitif reaksiyon veren koyuna ait serum 1/128 sulandırmaya kadar reaksiyon verirken, 1/128 ve 1/256 sulandırmalarda negatif reaksiyon verdiği gözlenmiştir. Genel olarak negatif kontrol olarak ayrılan koyun serumlarının IFAT ile kontrollerinde %90’ı negatif sonuç verirken %10’u yalancı pozitif reaksiyon vermiştir.

İnsanların kan serumlarının IFAT ile kontrollerinde ise şu sonuçlar alınmıştır.

Enfeksiyon grubundaki toplam 10 serumdan 7’si IFAT ile pozitif reaksiyon vermiştir. Radyolojik ve ticari ELISA kiti ile pozitif olduğu teşhis edilen 3 hastanın serumu IFAT ile yalancı negatif reaksiyon vermiştir. Pozitif reaksiyon veren 7 enfekte grubu serumdan; 2 serum (%28.5’i) 1/8 sulandırmaya, 1 serum (%14.2’si) 1/32 sulandırmaya, 1 serum (%14.2’ si) 1/128 sulandırmaya, 2 serum (%28.5’i) 1/256 sulandırmaya kadar, 1 serum da (%14.2’si) 1/256 sulandırma da dahil olmak üzere pozitif reaksiyon vermiştir. Genel olarak pozitif kontrol olarak ayrılan insan serumlarının IFAT ile kontrollerinde %80 pozitif sonuç alınmıştır.

Negatif kontrol grubundaki toplam 10 serumdan 8’i IFAT ile negatif reaksiyon verirken, 2 serum yalancı pozitif reaksiyon vermiştir. Negatif kontrol grubu olarak ayrılan ancak pozitif reaksiyon veren insan serumlarından 1’i, 1/128 sulandırmaya kadar, diğeri ise 1/256 sulandırma dahil olmak üzere pozitif reaksiyon vermiştir. Genel olarak negatif kontrol olarak ayrılan serumların IFAT ile kontrollerinde %70’i negatif sonuç verirken, negatif kontrol olarak ayrılan serumların %30’u pozitif sonuç vermiştir.

Sonuç olarak; Koyun kan serumlarının serolojik muayenelerinde IFAT’ın sensitivitesi %90, spesifitesi %90 olarak hesaplanmıştır*.

İnsan kan serumlarının serolojik muayenelerinde ise IFAT’ın sensitivitesi %70, spesifitesi %80 olarak saptanmıştır*.

Piyasadan hazır satın alınan non-enfekte koyun serumunun IFAT ile serolojik muayenesinde, tüm sulandırmalarda negatif reaksiyon verdiği gözlenmiştir.

Koyunların organ ve dışkı muayenelerinde;

Pozitif kontrol grubu olarak ayrılan toplam 10 koyunun organ muayenesinde; 2 koyunda (%20’si) Cysticercus tenuicollis’e, 1’inde (%10’u) Fasciola hepatica’ya rastlanmıştır. Pozitif kontrol grubu koyunların dışkı muayenesinde ise, 1 koyunda (%10’u) Paramphistomum sp.’ye, 2’sinde (%20’si) Trichuris sp.’ye, 8’inde (%80’i) Trichostrongylus sp.’ye rastlanırken, 2 koyunun (%20’si) organ ve dışkı muayenesinde herhangi bir helmint enfeksiyonu saptanamamıştır (Tablo 2).

Negatif kontrol grubu olarak ayrılan toplam 10 koyunun organ muayenesinde; 1 koyunda (%10’u) Dicrocoelium dendriticum’a, 1’inde de (%10’u) Cyticercus tenuicollis’e rastlanmıştır. Negatif kontrol grubu hayvanların dışkı muayenesinde ise, 1 koyunda (%10’u) Trichuris sp., 2’sinde (%20’si) Paramphistomum sp. ve 6’sında (%60’ı) Trichostrongylus sp. yumurtası saptanmıştır. Üç koyunun organ ve dışkı muayenesinde herhangi bir helmint enfeksiyonuna rastlanmamıştır.

Tablo 1. Kist hidatik yönünden pozitif ve negatif koyunların serumlarının IFAT ile çeşitli sulandırmalarda vermiş olduğu reaksiyonlar.

Serum no	Serum Sulandırmaları
Pozitif	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256
1	+	+	+	+	+	+	-	-
2	+	+	+	+	+	+	+	-
3	+	+	+	-	-	-	-	-
4	+	+	+	+	-	-	-	-
5	+	+	+	+	+	+	-	-
6	+	+	+	+	+	+	-	-
7	+	+	+	+	+	-	-	-
8	+	+	+	+	+	+	-	-
9	+	+	+	+	+	+	-	-
10	-	-	-	-	-	-	-	-
Negatif	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256
1	-	-	-	-	-	-	-	-
2	-	-	-	-	-	-	-	-
3	-	-	-	-	-	-	-	-
4	-	-	-	-	-	-	-	-
5	-	-	-	-	-	-	-	-
6	+	+	+	+	+	+	-	-
7	-	-	-	-	-	-	-	-
8	-	-	-	-	-	-	-	-
9	-	-	-	-	-	-	-	-
10	-	-	-	-	-	-	-	-

Tablo 2. Koyunların diğer helmint enfeksiyonları bakımından durumu

Hayvan no	Kist hidatik lokalizasyon yeri	Diğer helmint enfeksiyonları*
Pozitif
1	Karaciğer	Trc., Paramph.
2	Karaciğer, Akciğer	-
3	Karaciğer	Trc.
4	Karaciğer	Trc., Cyst.
5	Karaciğer, Akciğer	Trc., Trich.
6	Karaciğer, Akciğer	Trc., Cyst.
7	Karaciğer	Trc., Fas.
8	Karaciğer, Akciğer	-
9	Karaciğer	Trc.
10	Karaciğer	Trc., Trich.
Negatif
1	-	Trc., Dic., Paramph.
2	-	-
3	-	-
4	-	Tric., Trich.
5	-	Trc.
6	-	Cyst.
7	-	-
8	-	Trc., Paramph.
9	-	Trc.
10	-	Trc.

*Diğer helmint enfeksiyonları; Trc.:Trichostrongylidae, Paramph.: Paramphistomum sp.,

Trich.: Trichuris sp., Fas.: Fasciola sp., Dic.: Dicrocoelium dendriticum,

Cyst.: Cysticercus tenuicollis

Tablo 3. Kist hidatik yönünden pozitif ve negatif insan serumlarının IFAT ile çeşitli sulandırmalarda vermiş olduğu reaksiyonlar.

Serum no	Serum Sulandırmaları
Pozitif	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256
1	+	+	-	-	-	-	-	-
2	-	-	-	-	-	-	-	-
3	-	-	-	-	-	-	-	-
4	+	+	+	+	+	+	+	-
5	+	+	+	+	+	+	+	-
6	+	+	+	+	-	-	-	-
7	+	+	+	+	+	+	+	+
8	+	+	-	-	-	-	-	-
9	-	-	-	-	-	-	-	-
10	+	+	+	+	+	+	-	-
Negatif	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256
1	-	-	-	-	-	-	-	-
2	-	-	-	-	-	-	-	-
3	-	-	-	-	-	-	-	-
4	-	-	-	-	-	-	-	-
5	-	-	-	-	-	-	-	-
6	+	+	+	+	+	+	-	-
7	-	-	-	-	-	-	-	-
8	+	+	+	+	+	+	+	+
9	-	-	-	-	-	-	-	-
10	-	-	-	-	-	-	-	-

V. Sonuç ve Öneriler

Pozitif kontrol olarak ayrılan 2, 5, 6 ve 8 nolu koyunların organ muayenelerinde kist hidatiklere hem karaciğer, hemde akciğerlerinde rastlanmıştır. Bu koyunların kan serumlarının IFAT ile muayenesinde ise 2 nolu koyunun serum örneği 1/256 sulandırmaya kadar pozitif reaksiyon verirken, 5, 6 ve 8 nolu koyunların serum örnekleri 1/128 sulandırmaya kadar pozitif reaksiyon vermiştir. Bunun yanında sadece karaciğerinde kist hidatik bulunan 1 ve 9 nolu koyunların serum örnekleri 1/128 sulandırmaya kadar pozitif reaksiyon verirken, 1 koyunun serum örneği (no.3) 1/16 sulandırmaya, 1 serum örneği (no.4) 1/32 sulandırmaya kadar pozitif reaksiyon vermiş, 1 serum örneğinde (no.10) hiç pozitiflik görülmemiştir. Bu sonuçlar hem karaciğer, hem de akciğerlerde kist hidatik bulunan koyunlardaki antikor düzeyinin sadece karaciğerinde kist bulunan hayvanlardakinden daha yüksek olduğunu göstermektedir. Şenlik (26) de yaptığı çalışmada aynı sonuca varmıştır.

Negatif kontrol olarak ayrılan koyunlarda 6 numaralı koyunun organ muayenesinde C. tenuicollis’e rastlanmış ve negatif olarak ayrılan koyunların kan serumlarından sadece bu koyun IFAT ile pozitif reaksiyon vermiştir. Bu sonuç da, bir cestod larvası olan C. tenuicollis ile, kist hidatik arasında kros reaksiyon olabileceği düşüncesini akla getirmektedir. Aynı durum bazı araştırıcılar (17,25) tarafından da belirtilmiştir.

Koyunların dışkı muayenesi ile yapılan bakılarından elde edilen sonuçlarla, antikor düzeyleri, yalancı pozitflik veya yalancı negatiflik reaksiyonları arasında dikkati çeker bir ilişki kurulamamıştır.

Radyolojik olarak kist hidatikli olup olmadıkları belirlenip, ticari ELISA kiti ile de bu sonuçların desteklendiği pozitif ve negatif hastaların, dışkı muayenesi sonuçlarının olmadığı gibi, radyolojik muayene sonucu kist hidatik bakımından pozitif olduğu belirlenen hastalardan bu kistlerin hangi organlarda bulunduğuna dair bir kayıt da bulunamamıştır. Bu sebeble antikor titre düzeylerinin hangi durumda arttığı ve azaldığı veya bir değişimin olup olmadığına ilgili bir yorum getirilememiştir.

Hidatidozun, floresan antikor tekniği ile teşhisinde antijen olarak, dondurulmuş parazitli doku kesitleri (4), skoleks ve kistik membranın kullanıldığı çalışmalardan (5) olumlu sonuçlar alındığı bildirilmiştir. Echinococcus granulosus’un larva ve olgun formlarının antijenik karşılaştırılmasının yapıldığı bir çalışmada da (1), larvalardan elde edilen antijenin aktivitesinin daha yüksek olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada da antijen olarak protoskoleks kesit antijenleri kullanılmış olup sonuçlar ilgili literatürlerle (1,4,5) benzerlik göstermektedir.

Hidatik sıvısı ve donmuş skoleks kesitleri antijen olarak kullanılarak insanlarda üniloküler ve mültiloküler hidatidozun teşhisi amacı ile uygulanan bir çalışmada (14) IFAT ile üniloküler hidatik de %94, multiloküler hidatidozda ise %100 başarı sağlandığı, ancak kontrol grubu testlerde bazı yalancı pozitif reaksiyonların olduğu kaydedilmiştir. Bu çalışmada ise insanlarda kan serumlarının serolojik muayenelerinde IFAT’ın sensitivitesi %70, spesifitesi %80 olarak hesaplanırken, koyun kan serumların aynı test ile serolojik muayenesinde bu oran spesifite ve sensitivitede %90 oranında bulunmuştur. Ayrıca kontrol grubu serumlarda yalancı pozitif reaksiyonlar görülmüştür. Bu sonuçlar Hıess ve ark. (15) yaptığı çalışmada alınan sonuçlarla benzerlik göstermektedir.

Beggs ve ark. (3), hidatidozun, floresan antikor tekniği ile teşhisinde, dondurularak kurutulmuş skoleksleri kullanmışlar ve olumlu sonuçlar aldıklarını bildirmişlerdir. Bu çalışmada da benzer antijen kullanılmış ve özellikle koyunlarda olmak üzere yüksek sayılabilecek oranlarda spesifite ve sensitivite değerleri bulunmuştur.

Şenlik (26), hidatidozun teşhisi amacıyla 300 koyunun serumlarını IFAT ve IHAT ile test etmiş ve 1/128 ve daha yukarı titrelerde IFAT’ın sensitivitesini %78.95, spesifitesini %92.57 olarak bildirmiştir. Bu çalışmada ise, spesifite ve sensitivite %90 olarak belirlenmiştir.

Sonuç olarak; daha önce yapılan bazı çalışmalarda (3-5,15,26) alınan sonuçlara benzer şekilde IFAT’ın spesifite ve sensitivitesi koyunlarda %90 gibi yüksek bir oranda görülürken, insanlarda bu oran sırasıyla %80 ve %70 olarak saptanmıştır. Bu da koyun kökenli protoskolekslerle hazırlanan antijenlerden, koyunlardaki kist hidatik enfeksiyonlarının erken dönemde teşhisinde daha iyi sonuçlar alındığını göstermektedir. Yine de daha spesifik antijenlerle spesifite ve sensitivite oranları daha da arttırılabilir. İnsanlarda ise bu antijen (koyun protoskoleks antijeni) ile alınan sonuçlar yetersiz olmuştur.

VI. Kaynaklar

1. Ambroise-Thomas,P., Kien-Truong,T., Cardosa de Chio,M. et Ghiobaldomir, C.A. (1970). Comparasion antigenique des et de formes larvaires fluorescece indirecte. J. Parasit.,56:5

2. Barış,İ.,Şahin,A.,Bilir,N.,Kalyoncu,A.F.,Emri,A.S.,Akhan,O.,Barış,B.,Çopur,A.S. ve Selçuk,Z.T. (1989). Hidatik Kist Hastalığı ve Türkiye'deki Konumu. Türkiye Akciğer Hastalıkları Vakfı Yayını No:1,Ankara.

3. Beggs,W.A. and Fischman,A. (1970). A preserved antigen for the hydatid fluorescent-antibody and other tests utilizing scolies. Bull. Wld. Hlth. Org.,42:331-332.

4. Coudert,J., Ambroise-Thomas,P., Despeignes,J., Cadi-Soussi,M. et Kien-Truong,T. (1966). Diagnostic serologique de 12 echinococcuse alveolaire par immuno-fluorescence. Bull. Soc. Path. exot., 59:859-865.

5. Coudert,J., Ambroise-Thomas,P., Kien-Truong,T. et Pothier,M.A. (1967). Premiers resultats concernant le diagnostic serologique du Kyst hydatique par une nouvelle technique d'immuno-fluorescence sur lames. Bull. Soc. Path. exot., 60:555-563.

6. Chen,X.X.,Gao,C.L.,Chen,J.T.,W.C.,Lu,Y. and Gong,M.Q. (1992). Comparativee studies on detecting serum antibodies in filariasis patients by IEST and IFAT. Chin. J. Parasit. Dis. Cont., 2:99-101,(Ref:Helminth.Abst.,1992,61,3090).

7. Chroust,K. and Dubansky,V. (1967). Flourescent-antibody studies on muscle larvae Trichinella spiralis(Owen,1835).II.The indirect flourescent-antibody method. Acta Univ. Agric. Fac.vet. Brne.,36:299-305.

8. Chroust,K. and Dubansky,V. (1970). The indirect flourescent antibody method in experimental trichinosis diagnostics. Acta vet. Brno., 39:157-163.

9. Duxbury,R.E. and Sadun,E.H. (1967). Soluble antigen flourescent antibody test (SAFA) for human filariasis. Expl. Parasit.,20:77-82.

10.Fateanu,A.,Negru,D. et Popescu,S. (1971). [Direct and indirect immuno-flourescence in the diagnosis of experimental trichinosis (in rats and Pigs).] Technica directa si indirecta a anticorpilor flourescenti in diagnosticul trichinelozei experimentale. Revta Zooteh. Med. vet., 21:56-64. (Ref:Vet.Bull.,1972,42,4712).

11.Flentje,B.,Buchwalder,R. and Hıepe,T. (1978). Diognosis of bovine cysticercosis by means of the immunofluorescent antibody technique. Arch. Exp. Vet Med.,32:205-212.

12.Gore,R.W., Sadun,E.H. and Hoff,R. (1970). Echinococcus granulosus and E.multilo-cularis soluble antigen fluorescent antibody test. Expl. Parasit.,28:272-279.

13. Güralp,N.(1981). Helmintoloji. Ankara Üniv. Vet. Fak.Yayınları. 368.İkinci baskı.

14. Hardy, W.D. (1991). General principles of retrovirus immuno-detection tests. Javma, 190:1282-1286.

15. Hıess,U.,Eckert,J. and Fröhlıch,A. (1974).Comprasion of serological methods for the diagnosis by hydatid (Echinococcus granulosus and E.multilocularis) in man. Schiweiz. Med. Wschr.,104:853-859.

16. Jackson,G.J. (1959). Flourescent antibody studies of Trichinella spiralis infections. J. Infect. Dis.,105:97-118.

17. Kumar,D.,Gaur,S.N.S. and Varshney,K.C. (1987). Indirect fluorescent antibody test in the diagnosis of porcine cysticercosis. Indian J. vet. Sci.,57:1204-1206.

18. Lucosse,C. and Hoeppli,R. (1963). Immunofluorescence in onchocercosis. Z. tropenmed. Parasit.,14:262-269.

19. Morris,D.L. and Richards,K.S.(1992). Hydadid Disease. Butterworth-Heinemann Ltd. Linacre House, Jardon Hill, Oxford OX2 8DP.

20. Oğuz, T., Tınar, R., Burgu, A. ve Alabay, M. (1971). Deneysel olarak enfekte edilen koyunlarda Fasciola hepatica’ nın immunperoksidaz ve immunfloresan teknikleri ile mukayeseli teşhisleri. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg., 18: 209-213.

21. Özcel,M.A. (1978). İmmunofloresans ve Parazitolojide uygulanması. Ege Üniv. Tıp Fak. Yayınları No:108.

22. Sadun E.H.,Anderson,R.I. and Wıllıams,J.S. (1962). Fluorescent antibody test for the serological diagnosis of trichinosis. Expl. Parasit.,12:423-433.

23. Sarımehmetoğlu,O. (1995). Toxocara canis ile Deneysel Enfekte Farelerde Visceral Larva Migransın İndirekt Hemaglutinasyon ve İndirekt Floresan Antikor Testleri ile Teşhisi. Ankara Üniv. Sağlık Bil. Enst. Doktora Tezi.1995.

24. Sato,S. (1968). Immunological studies on schistosomiasis japonica.VII.Diagnostic aspect of the indirect fluorescent antibody test for schistosimiasis. Jap. J. Parasit., 14:217-219. (Ref:Helminth.Abst.,1968,37,1899).

25. Sekara, M., Rao, V.N.A., Ramadass, P., Raghavan, N. (1989). Comparative study of serological diagnostic test in hydatidosis in sheep. Cheiron, 18:10-14.

26. Şenlik,B. (2000). Koyunlarda hidatidozun teşhisinde indirekt floresan antikor (IFA) ve indirekt hemaglütinasyon (IHA) testlerinin kullanımı. T Parazitol. Derg.,24:408-413

27. Tınar,R. (1976). Floresan Antikor Tekniği ile Koyunlarda Fasciola gigantica' nın Erken Teşhisi Üzerine Araştırmalar. Ankara Üniv. Vet. Fak. Doçentlik Tezi. Ankara,1976.

28. Woodruff,A.W. and Wıeseman,R.A. (1968). Indirect fluorescent antibody test for the serodiagnosis of onchocercosis. Expl Parasit., 22:295-298.

VII. Ekler

a) Mali Bilanço ve Açıklamaları:

Projede 1. Sarf malzeme olarak kimyasal maddeler için 250. 000. 000 TL.

2. Demirbaş malzeme olarak -86ºC lık dondurucu için 8.052.000.000 TL. kullanılmıştır.

b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar:

Bu projede alınan -86ºC lık derin dondurucu halen kürsümüzde yapılan Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu, TÜBİTAK ve Erciyes Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenen projelerde ve diğer kürsü çalışmalarında antijenik özellikteki malzemelerin saklanmasında kullanılmaktadır. Bu demirbaş malzeme geleceğe yönelik tasarlanan proje ve diğer çalışmalar için katkı sağlayacaktır.