T.C.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
SIĞIRLARDA THEİLERİA TÜRLERİNİN REVERSE LİNE BLOTTİNG (RLB) VE İNDİREK FLORESAN ANTİKOR (IFAT) TESTİ İLE KARŞILAŞTIRMALI TANISI ÜZERİNE ARAŞTIRMALAR.
Proje Yürütücüsü
Prof.Dr. Zafer KARAER
Proje Numarası:
2001-08-10-035
07.07.2001
07.07.2002
2003
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara-2003
SIĞIRLARDA THEİLERIA TÜRLERİNİN REVERSE LINE BLOTTING (RLB) VE İNDİREKT FLORESAN ANTİKOR TESTİ (IFAT) İLE KARŞILAŞTIRMALI TANISI ÜZERİNE
ARAŞTIRMALAR
Özet
Bu çalışmada, sığırlarda Theileria türlerinin (T.annulata, T.sergenti/buffeli/orientalis) Türkiye’de ilk defa Reverse Line Blotting (RLB) tekniği ile eşzamanlı teşhisi, Mikroskobik bakı ve IFA (İndirekt Floresan Antikor) testi ile karşılaştırılarak Ankara bölgesindeki epidemiyolojisinin ortaya konması amaçlanmıştır. Sahadan toplanan 250 sığır kanından elde edilen DNA örnekleri Theileria türlerinin 18S ssrRNA genlerinin V4 değişken bölgelerini amplifiye eden biotin ile işaretlenmiş genel primerler ile PZR’a tabi tutulmuştur. Elde edilen PZR ürünleri, sıralar halinde her türe özgü probların tutturulmuş olduğu membrana 90° açı ile dökülerek hibridize edilmiştir. Hibridizasyon işlemini takiben yıkanan mebran üzerine peroksidaz ile işaretlenmiş straptavidin dökülerek pozitif örneklere bağlanması sağlanmış, ECL solusyonu ile muamele edilmiş ve radyolojik olarak görüntülenmiştir.
RLB sonucunda, incelenen toplam 250 kan örneğinden 119 (%47.6)’unda Theileria türünün varlığı tespit edilmiştir. Hayvanlardan 85 (%36)’inin T.annulata, 16 (%6.4)’sının T.buffeli ve 18 (%7.2)’inin iki tür ile enfekte olduğu ortaya konmuştur.
Toplanan serumların IFA testi sonucunda 250 örnekten 70 (%28)’i seropozitif bulunurken, sürme frotilerin mikroskobik bakısında 74 (%29.6) örnekte piroplasmik formlar görülmüştür.
Bu çalışma ile Türkiye’de ilk
defa T.buffeli (T.buffeli/orientalis)’nin varlığı ortaya konmuştur.
Ayrıca testler arasındaki sonuçların farklılığı istatistik olarak karşılaştırılmış ve RLB tekniğinin diğer iki teşhis yöntemine göre daha duyarlı ve özgül olduğu anlaşılmıştır.
Bu çalışma ile, Türkiye’de ilk defa kullanılan RLB testinin, aynı anda birden fazla etkeni ortaya koyabilmesi nedeniyle diğer tanı yöntemlerine göre daha duyarlı olduğu ve yapılacak epidemiyolojik çalışmalarda kullanılabileceği kanısına varılmıştır.
Anahtar sözcükler: Theileria, PZR, RLB, IFAT, Epidemiyoloji
COMPARATIVE STUDIES ON DETECTION OF
BOVINE THEILERIA SPECIES BY REVERSE LINE BLOTTING (RLB) AND INDIRECT
FLUORESCENT ANTIBODY TEST (IFAT).
Abstract
In this study, the aim was to bring to light the epidemiology of theileria species (Theileria annulata, T.sergenti/buffeli/orientalis) in Ankara regionby means of comparison of the results of different diagnostic techniques including the Reverse Line Blotting technique which was used for the first time in Turkey, microscopic examination and IFA. DNA samples obtained from the blood samples collected from 250 cattle in the field were tested by PCR by using the primers which amplified V4 variable regions of 18s ssrRNA genes of theileria species the collected PCR products were poured on the membrane where the probes of theileria species were covalently linked and hybridized. Straptavidin marked by peroksidase was poured on the membrane which was washed following the hybridizasion in order to label the positive samples, then the membrane was treated with ECL detection liquid and visualised radiologically.
According to the results of RLB, theileria species were detected in 119 out of 250 blood samples. It was observed that 85 (36%) animals were infected by T.annulata, 16 (6.4%) by T.buffeli and 18 (7.2%) by both of these species. By using IFA, 70 (28%) out of 250 sera were found to be positive and by microscopic examination proplasmic forms were detected in 74 (29.6%) sample smears.
This is the first study indicating the presence of T.buffeli in Turkey.
The differences observed in the results of the tests were statistically compared and the RLB technique was detected to be sensitive and specific compared to the other two diagnosis methods.
In this study, it has been concluded that due to the ability to detect more than one parasite at a time, the RLB test is more sensitive compared with the other diagnosis tests and can spesifically be used in epidemiologic studies.
Key words: Theileria, PCR, RLB, IFA, epidemiology
II. AMAÇ VE KAPSAM
Kenelerle nakledilen
hastalıklardan theileriosis, Türkiye’nin de içinde bulunduğu tropik ve
subtropik ülkelerde hayvancılığı tehdit eden başlıca hastalıklardandır. Theileria
annulata tarafından oluşturulan tropikal theileriosis, ülkemizde her
bölgede görülmekte ve her yıl büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bunun
yanında, az patojen sayılan ve gerek serolojik gerekse mikroskopik teşhiste
yanılgılara neden olabilecek olan T.orientalis’in ülkemizde
bulunabileceği konusunda kuşkular ifade edilmiş olsa da, bugüne kadar bu konuda
herhangi bir çalışma yapılmamıştır.
Hyalomma soyuna bağlı keneler tarafından nakledilen ve sığırlarda tropikal theileriosis etkeni olan Theileria annulata, Akdeniz havzası (Güney Avrupa, Kuzey Afrika, Anadolu yarımadası), Ortadoğu, Orta ve Güney Asya’da yaygın olarak görülmekte (Neitz,1957; Norval ve ark.,1992) ve yaklaşık 250 milyon sığırı tehtid etmektedir (Tait ve Hall,1990). Hastalık, Türkiye’de de çok yaygın olup (Dincer ve ark.,1991; Eren ve ark.,1995; Hoffman ve ark.,1971; Mimioğlu ve ark.,1971; Sayin ve ark.,1997; Tüzer,1981), tedavi edilmediği durumlarda yüksek verimli ırklarda ölümle sonuçlanmaktadır. Haemaphysalis soyuna bağlı keneler tarafından nakledilen T.buffeli/orientalis grubu parazitler de, T.annulata gibi aynı coğrafik yayılıma sahip olsalar da, az patojen tür/türler olarak kabul edilmetedirler (Uilenberg ve ark.,1994).
Hastalık tedavi
edilmediği durumlarda yüksek verimli ırklarda ölümle sonuçlanmaktadır. Tropikal
theileriosis’in kontrolü konusunda yapılacak çalışmalar büyük ölçüde etkenin
vektör kene ve sığırlarda güvenilir şekilde teşhis edilmesine bağlıdır (Brown 1990). Günümüzde hastalığın klinik teşhisi Giemsa ile
boyanmış lenf yumrusu biyopsileri veya kan frotilerinin mikroskopik bakısı ile
yapılmaktadır. Hastalığı atlatıp portör haline gelen hayvanlar, keneler için en
önemli enfeksiyon kaynağını oluştururlar, ayrıca bu gibi portör hayvanların tüm
sığır populasyonu içindeki oranı hastalığın endemik stabilite ve instabilitesi
için belirleyicidir. Bu nedenle bir bölgede portör hayvanların belirlenmesi
hastalığın epidemiyolojisinde en önemli kriterlerden biridir. Diğer taraftan
portör hayvanların Giemsa ile boyanmış kan frotilerinde etkenin piroplazmik
formlarını görerek belirlemek zaman ve deneyim gerektirdiği gibi Theileria
türleri arasında ayırım yapmak neredeyse olanaksızdır. Bunun yanında
dolaşımdaki antikorları ortaya koymak amacıyla Indirek Floresan Antikor testi
(IFA) gibi serolojik testler kullanılmaktadır (Gremmel, 1983; Çakmak, 1987;
Pipano, 1969). Ancak çeşitli Theileria türleri arasında çapraz reaksiyonların
görülmesi bu testlerin yeterince duyarlı olmadığını göstermektedir (Burridge ve ark.,1974; Papadopoulos
ve ark.,1996). Yine bunun yanında uzun süreli
portörlük durumlarında kanda piroplazmik formlar bulunmasına rağmen antikorlar
IFAT ile her zaman tespit edilememektedir (Pipano, 1974; Sayın ve ark., 2001).
Son yıllarda moleküler
biyolojideki gelişmelerle birlikte, hastalıkların etkenlerinin DNA’sını ortaya
koymaya yönelik yöntemler (DNA Hybridisation, PCR=Polymerase Chain Reaction,
Polimeraz Zincir Reaksiyonu) de ortaya çıkmış ve kullanılmaya başlanmıştır.
Günümüzde bu yöntemler hastalık etkenlerinin teşhisinde vazgeçilmez birer araç
olmuşlardır. Bu gelişmelere paralel olarak sığırlarda görülen kan
parazitlerinin teşhisi için her türe özgü bir çok primer tasarlanmış ve
kullanılmıştır. Parazit DNA’sının ortaya konması ilkesine dayanan Polimeraz
Zinci Reaksiyonu (PZR) testi, çeşitli Theileria ve Babesia
türlerinin duyarlı ve özgül biçimde teşhisini olanaklı kılmıştır (Calder ve ark.,1996; d'Oliveira ve
ark.,1995; d'Oliveira ve ark.,1997; de Kok ve ark.,1993; Fahrimal ve ark.,1992;
Figueroa ve ark.,1992; Kawazu ve ark.,1992; Martin-Sanchez ve ark.,1999;
Sparagano ve ark.,1999). Yapılan karşılaştırmalı
çalışmalarda, PZR’un gerek mikroskopik bakı, gerekse IFAT’ne göre portör
hayvanların belirlenmesinde çok daha duyarlı ve özgül olduğu gösterilmiştir. (d'Oliveira ve ark.,1995; Kirvar ve
ark.,2000; Martin-Sanchez ve ark.,1999; Tanyuksel ve ark.,2002; Vatansever ve
Nalbantoglu,2002).
Yukarıda bildirilen
çalışmaların yaygınlaşan kullanımının yanısıra, hayvanlarda bulunabilecek bütün
kan parazitlerini bir defada ortaya koyabilecek kombine bir testin arayışları
devam etmiştir. Birden fazla türün PZR ile aynı anda teşhis edilebilmesini
sağlayan ilk çalışmalar (Multiplex PCR) Figueroa ve ark.,1993 tarafından B.bovis, B.bigemina
ve Anaplasma marginale’ye yönelik olarak yapılmıştır, ancak gerçek
anlamda ilk gelişme RLB (Reverse Line Blotting) tekniğinin ortaya çıkması ile
sağlanmıştır. Reverse Line Blotting tekniği ilk defa aynı kenede bulunabilen 4 Borrelia
türünün ayrılması için kullanılmıştır(Rijpkema ve ark.,1995). Bu test PCR ürünlerinin bir membranda
ayrı sıralara bağlanmış özgün problara hibridizasyonu esasına dayanmaktadır.
Teknik, bir çok etkenin aynı anda bir çok prob ile karşılaştırılmasına olanak
sağladığından, oldukça pratik ve kullanışlıdır. Nitekim bir gurup araştırıcı(Gubbels ve ark.,1999), bu tekniği sığırlardaki T.annulata,
T.parva, T.mutans, T.taurotragi, T.velifera, B.bovis,
B.bigemina ve B.divergens’in aynı anda spesifik olarak teşhis
edilebileceğini göstermişlerdir. Günümüzde RLB kullanımı gittikçe artmakta ve
hayvanlarda bulunan bütün kene kökenli hastalıkların teşhisinde kullanılan bir
standart haline gelmektedir(Bekker ve ark.,2002; Georges ve
ark.,2001; Lunemann ve ark.,2001; Sparagano ve ark.,1999a; Sparagano ve
Jongejan,1999; Sparagano ve ark.,2002)
Türkiye’de ise, T. annulata’nın teşhisine ve epidemiyolojisinin açıklanmasına yönelik çalışmalarda, günümüze kadar kullanılan mikroskopik bakı ve IFAT gibi yöntemlere (Eren ve ark.,1995b) ek olarak, yakın zamanlı üç çalışmada PZR da kullanılmıştır (Aktas ve ark.,2002; Tanyuksel ve ark.,2002; Vatansever ve Nalbantoglu,2002).
Bu çalışma Ankara bölgesinde RLB (Reverse Line Blotting), IFA (Indirek Floresan Antikor testi) testleri ve mikroskobik bakı ile sığırlarda Theileria türlerinin eşzamanlı tanısını yapmak, iki testin karşılaştırmalı geçerliliğini tespit etmek, RLB’nin rutin olarak laboratuvarlarda ve özellikle epidemiyolojik çalışmalarda kullanılabilirliğini ortaya koymak amacıyla yapılmıştır.
III. MATERYAL
VE YÖNTEM
a) Saha çalışmaları
Çalışmanın materyalini
Ankara bölgesinde değişik yerleşim merkezlerinden seçilen sağlıklı sığırlardan
toplanan kanlar oluşturmuştur. Materyal
toplamak amcıyla Temmuz-2001 ile Temmuz-2002 tarihleri arasında Ankara İl’ine
bağlı Merkez, Polatlı, Beypazarı, Elmadağ, Gölbaşı, Haymana, Kızılcahamam, Çubuk
ve Bala İlçe’lerinin farklı köylerine gidilerek toplam 250 sığır klinik olarak
muayene edilmiş ve her birinden EDTA’lı ve Serum tüplerine kan alınmıştır. Ayrıca
her sığırın kuyruk ucundan yayma froti yapılmıştır. Steril serum tüplerine
alınan kanlar 2500 devirde 10 dakika santrifüj edilerek çıkan serumlar 1,5
ml’lik mikro tüplere konmuş, IFA testinde kullanılıncaya kadar -20oC’de
saklanmıştır. Elde edilen EDTA’lı kanlar soğutmalı kaplarda laboratuvara
getirilerek ya hemen işlenmiş ya da daha sonra işlenmek üzere -20°C’de
saklanmıştır.
b)
Laboratuvar
çalışmaları
i)
DNA
ekstraksyonu
DNA ekstraksyonu genel olarak (d' Oliveira ve
ark.,1995)
ile (Gubbels ve ark.,1999)’nın bildirdiği şekilde
yapılmıştır. Kısaca 200μl kan 500μl Lysis buffer (0.22% NaCl, 1mM
EDTA ve 0.015% saponin) ile 4 defa (3300rpm’de 5 dak.) yıkanmış ve elde edilen
çökelti üzerine 500μl PCR buffer (50mM KCl, 10mM Tris pH 8.0, 0.5% Tween
20, 100 mg/ml
Proteinase K) ilave edilerek 55°C’de 12 saat tutulmuştur. Bunu takiben örnekler
90°C’de 10 dk. tutulmuş ve sonra da 13000rpm’de 2dak. çevrilip üste kalan sıvı
PZR reaksiyonunda kullanılmak üzere +4°C’de saklanmıştır.
ii)
PZR
(Polimeraz Zincir Reaksiyonu)
Polimeraz
Zincir Reaksiyonu için Biometra TGradient (Whatmann, Biometra) PZR makinesinde
kullanılmıştır. Reaksiyonda primer olarak Theileria soylarındaki
parazitlerin 18S ssu rRNA (Small subunit ribosomal RNA) geninin V4 değişken
bölgesinden büyüklüğü 460 ile 520 bp (base pairs=baz çifti) arasında deiğşen
bir parça amplifiye eden genel primerler (RLB-F2 5’ GAC ACA GGG AGG TAG TGA CAA
G’3 ve RLB-R2 5’-biotin- CTA AGA ATT TCA CCT CTG ACA GT’3) kullanılmıştır (Georges ve ark.,2001; Gubbels ve
ark.,1999). Primerler, özel modifikasyonlar
yapabilen, Isogen (Hollanda), Genset (Fransa) ve MWG (Almanya) firmalarına
sentezlettirilmiştir. Reaksiyon, toplam 100ml reaksiyon sıvısında (1x PCR buffer
(Sigma ve Fermentas), 1.5mM MgCl2 (Sigma ve Fermentas) , her
deoksinükleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)’den 200mM (Sigma ve Fermentas), 2.5U Taq DNA
polymerase (Sigma ve Fermentas), 100pmol primer ve 10ml DNA
örneği) 200 µl’ik PZR tüplerinde (TrefLab) yapılmıştır. PZR reaksiyonu, 94°C’de
5 dakikalık bir denatürasyonu takiben, 94°C’de 1dk, 57°C’de 1dk ve 72°C’de 1dk
olamak üzere toplam 35 döngü üzerinden yapılmıştır. Son döngüyü takiben 72°C’de
10 dk.’lık bir ek bekleme yapılmıştır Elde edilen ürünlerin bir kısmı (20µl)
%1.7’lik agaroz jelde yürütülerek, UVP Jel Dökümentasyon sistemi ve LabWorks
imaj analiz programı (UVP Inc. Upland, CA) kullanılarak görüntülenip analiz
edilmiş, geri kalanı ise (30µl) RLB’de kullanılmak üzere 4°C’de saklanmıştır.
Testin
bilinen Theileria türlerinin DNA’larını amplifiye ettiğini göstermek
amacıyla pozitif kontrol olarak T.annulata (Ankara, Hissar ve AKSA
izolatları), T.buffeli (ILRI, Kenya), T.parva (ILRI, Kenya), T.mutans
(ILRI, Kenya) ve negatif kontrol olarak da sığır DNA’sı kullanılmıştır.
iii) RLB (Reverse Line
Blotting)
(1)
RLB mebranın hazırlanması
Bu aşamada kullanılan
probların tamamı (Tablo 1), negetif yüklü Biodyne C membrana (Pall
Biosupport group, Ann Arbor, MI) kovalent olarak bağlanabilmeleri amacıyla, 5’-terminallerinde
amino grubu (N-terminal N-(trifluoracetamidohexyl-cyanoethyl,N,N-diisopropyl
phosphoramidite [TFA])-C6 amino linker) ihtiva edecek şekilde Genset (Fransa), Isogen (Hollanda) ve
MWG (Almanya) firmalarına sentezlettirilmiştir.
Membran
Georges ve ark. (2001) ile Gubbels ve
ark.(1999)’nın bildirdiği şekilde
hazırlanmıştır. Problar 500mM NaHCO3 (pH 8.4) içinde 50-800 pmol/150ml
konsantrasyonlarda sulandırılmıştır (Tablo 2.). Kullanılacak olan Biodyne C
membran oda ısısında 10 dk %16 EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide
) (Sigma) solusyonu ile
aktive edilmiş, su ile yıkanmış ve MN45 miniblottera (Immunetics,
Cambridge, Mass.)
yerleştirimiştir. Membran üzerindeki kalıntı sıvılar iyice aspire edildikten
sonar, her bir probtan 150 ml
miniblotterin ayrı kanallarına dökülmüştür ve oda ısısında 1-2 dk inkübe
edilmiştir. Kanallarda bulunan prob solusyonları aspire edilerek membran
miniblotterdan çıkarılmış ve 100mM NaOH içinde 10dk inkübe edilerek inaktive
edilmiştir. Son olarak membran 2x SSPE/0.15 SDS karışımı ile 60°C’de 5 dk
yıkanarak kullanıma hazır hale getirilmiştir.
(2)
Reverse Line Blot Hibridizasyonu
Hibridizasyon
Georges ve ark. (2001) ile Gubbels ve
ark. (1999)’na göre yapılmıştır. Önceden elde
edilmiş olan PZR ürünlerinden 30’ar ml alınıp 2xSSPE/%0.1 SDS karışımı ile
150 ml’ye tamamlanarak 100°C’de 10 dk denatüre edilmiştir.
Membran bu defa önceden dökülen prob sıraları ile miniblotterin kanalları 90°
açı yapacak şekilde miniblottera yerleştirilmiştir. Ddenatüre edilen PZR
ürünleri ayrı sıralara dökülmüş ve 42 °C’ 1 saat boyunca inkübe edilerek
(çalkalama olmaksızın) problar ile hibridize olmaları sağlanmıştır. Bu sürenin
sonunda kanallar aspire edilmiş ve membran alınarak 52°C’de 10 dk 2xSSPE/%0.5
SDS (Sigma) ile yıkanmıştır. Bu işlemi takiben membran 42°C’de 30 dk 10 ml
Horseradish Peroksidaz ile işaretlenmiş streptavidin solusyonunda (Serotec) (2xSSPE/%0.0
SDS ile 1:4000 oranında sulandırılmış) bekletilmiştir. İnkübasyonu takiben
membran 2x SSPE/%0.5 SDS ile 42°C’de 10 dk daha sonra da 2xSSPE ile oda
ısısında 5 dk yıkanmıştır. Son olarak membran 1 dk 10ml ECL tespit sıvısında
(Amersham Biotech) bekletilmiştir. Bütün bu işlemleri takiben, membran karanlık
odada ECL hyperfilm (Amersham Biotech) altında 30 sn ile 1 saat arasında
tutulmuştur. Daha sonra film banyo edilerek geliştirilmiştir. Filmler üzerinde
prob ve PZR sıralarının kesiştiği yerlerde siyah lekeler pozitif olarak kabul
edilmiştir.
iiii) Indirek Floresan Antikor Testi
1.Antijen Preparatları
Indirek floresan antikor (IFA) testi
için gerekli T.annulata piroplasm ve şizont antijenleri Ankara
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Protozooloji ve Entomoloji Bilim Dalından
temin edilmiştir. T.annulata piroplasm antijeni için 1:20, Şizont
antijeni için ise 1:40 temel titre olarak kabul edilmiştir (Çakmak, 1987).
2.Konjugat
Indirek
floresan antikor testinde konjugat olarak FITC (Fluorescent Isothiocyanate) ile
işaretlenmiş rabbit anti-bovine IgG (Sigma,
F-7887) kullanılmıştır. Derin dondurucuda (-20oC) 20µl’lik
porsiyonlar halinde tutulan konjugat, en iyi floresan veren titreyi elde etmek
için, her testten önce PBS (Phosphat Buffered Saline) ve Evans Blue (1 kısım
Evans Blue+3 kısım PBS) ile 1:32 oranında sulandırılmıştır.
3.IFA
testinin yapılışı
İşlenecek
serumlar bir gün önceden derin dondurucudan çıkarılarak +4oC’lik
buzdolabına alınmıştır. Önceden hazırlanan antijen preparatları derin
dondurucudan çıkarılarak içinde nem çekici olarak CaCI2 bulunan
kapalı kaba alınmış ve 2 saat oda ısısında bekletilmiştir. Serumlar
mikrotitrasyon kaplarında 1:10 ile 1:80 arasında PBS ile sulandırılmıştır. Nem
Çekici kapta 2 saat duran preparatlar, içinde ıslatılmış kurutma kağıdı bulunan
geniş tabanlı rutubetli kaplara yerleştirilmiş, numaralanmış ve üzerlerine
çeşitli sulandırma basamaklarındaki serumlar damlatılmıştır. Rutubetli kaplar
kapatılarak 37oC’lik etüvde 30 dakika tutulmuştur. Etüvden çıkarılan
preparatlar bir defa elde, iki defa da 5 dakika süre ile magnetik karıştırıcıda
PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra distile suda 2-3 dakika yıkanıp sıcak hava
akımında kurutulmuşlardır. Kurutulan preparatlar yeniden rutubetli ortama
konmuş ve üzerlerine konjugat damlatılarak tekrar 37oC’lik etüvde 30
dakika tutulmuştur. Bu süre sonunda PBS ve distile su ile yıkama işlemi
tekrarlanmıştır. Kurutulan preparatlar üzerine gliserinli buffer damlatılarak
lamel ile kapatılmıştır. Bir saat bekletildikten sonra preparatlar karanlık
odada Zeiss floresan mikroskobunda x40 Neofluar objektifle incelenmiştir.
iv)
Kan Frotilerinin Tespiti, Boyanması ve Muayenesi
Her
bir hayvandan yapılan ince frotiler laboratuvarda Methanol’de 5 dakika tespit
edildikten sonra %5’lik Giemsa boya solusyonu (PBS ile %5 oranında
sulandırılmış Giemsa boyası, pH 7.2) ile boyanmışlardır. Daha sonra preparatlar
mikroskopta incelenmiş ve her preparatta 200 mikroskop sahası içinde bulunan
piroplazmalı eritrositler sayılmış, bulunan sayı 200 sahadaki enfekte eritrosit
sayısı (n/200) olarak kaydedilmiştir.
v)
İstatistik Analiz
RLB,
IFA testi ve mikroskobik bakı sonuçlarının istatistiksel analizleri için Kappa
testi kullanılmıştır.
IV. BULGULAR
Bu çalışmada Ankara
yöresinde RLB, IFA ve mikroskobik bakı ile sığırlarda Theileria türlerinin
çalışma merkezlerine dağılımı Tablo 3’de gösterilmiştir. Buna göre muayene
edilen 250 sığırdan RLB ile 119 (%47.6)’unun, IFA ile 70 (%28)’nin sürme
frotilerin mikroskobik bakısı ile 74 (%29.6)’nün pozitif olduğu saptanmış,
ayrıca RLB ile pozitif bulunan 119 örnekten85 (%34)’inin T.annulata, 16
(%6.4)’sının T.buffeli, 18 (%7.2)’nin ise iki türle enfekte olduğu
tespit edilmiştir.
Yapılan istatistiksel
analizler sonucunda RLB ile IFA testinin uyumluluğu %46.9, RLB ile mikroskobik
bakı uyumluluğu %63.3 ve mikroskobik bakı ile IFA testinin uyumluluğu %53.2
olduğu görülmüştür. RLB, T.annulata ve T.buffeli’nin ortaya
konması açısından en duyarlı test olurken her üç testin sonuçları arasındaki
fark istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). Testler kendi
aralarında karşılaştırıldığında RLB ile IFAT 62 (%52.1), RLB ile mikroskobik
bakı 74 (%62.2) ve mikroskobik bakı ile IFAT 48 (%64.8) örnekte uyumlu sonuç
vermiştir (Tablo 4). RLB testi temel alındığında mikroskobik bakının duyarlılığı
%62.2 özgüllüğü %100[*], IFA
testinin duyarlılığı %52.1 özgüllüğü ise %93.9 olduğu görülmüştür.
Testlerden herhangi biri
ile pozitif bulunan hayvan sayısı göz önüne alındığında, Ankara bölgesinde
sığırlarda bulunan Theileria türlerinin prevalansı %50,8 (127/250)
olarak hesaplanmıştır.
V. SONUÇ VE ÖNERİLER
c)
Bulguların
değerlendirilmesi
Bu çalışma ile Türkiye’de ilk defa T.buffeli
(T.buffeli/orientalis)’nin varlığı ortaya konmuştur.
Türkiye’de
ilk defa kullanılan RLB testi ile elde edilen veriler ışığında, Ankara
bölgesinde sığırlarda kan parazitlerinin prevalansı 0,478 olarak bulunmuştur.
Kenelerle bulaşan hastalıkların epidemiyolojisi göz önüne alındığında, bu
oaranın çok yüksek olduğu ve geri kalan duyarlı hayvan populasyonunun büyük
risk altında olduğunu göstermektedir.
Sonuçlar
tür bazında değerlendirildiğinde, en yaygın tür T.annulata (0.34)
olurken, bunu T.buffeli (0.064) izlemiştir. Bunun yanında iki türün bir
arada bulunduğu 18 miks enfeksiyon olgusu gözlenmiştir. Bugüne kadar Türkiye’de
Theileria (Aktas ve ark.,2002; Vatansever ve
Nalbantoglu,2002) türlerinin PZR testi ile tanısına yönelik 2
çalışma yapılmıştır. Vatansever ve Nalbantoglu (2002), Ankara yöresinde T.annulata’nın
30 kDa merozoit antijenini kodlayan bölgeyi amplifiye eden primerlerle
yaptıkları nested-PZR’da, T.annulata’nın yaygınlığını %61.2 olarak bildirmişlerdir.
Bu çalışmada ise bu oran %34 olarak bulunmuştur. Bu çalışmada elde edilen
sonuçlar, diğer çalışmalarla karşılaştırıldığında oldukça düşük düzeyde
kalmaktadır. Bu durum bölgede hakim olan epidemiyolojik durumun zamanla
değiştiği ve yapılan çalışmaların Ankara’nın farklı endemik özelliklere sahip
yerleşim birimlerinde yürütülmüş olması şeklinde yorumlanabilir.
Geçmişte
yapılan çalışmalarda PZR testinin mikroskobik bakı ve IFA testine göre daha
duyarlı ve özgün olduğunu gösterilmiştir (Martin-Sanchez ve ark.,1999;
d’Oliveira ve ark.,1995). Bu çalışmada PZR testine ek olarak özgül problarla
hibridizasyon yapılarak RLB testinin de uygulanması hem PZR testinin
duyarlılığını arttırmış hem de farklı türlerin eşzamanlı tanısını sağlamıştır. Bu
durum da, RLB testinin diğer testlere göre daha avantajlı olabileceğini
göstermektedir.
Sonuç
olarak bu çalışmada, sığırlarda Theileria türlerinin teşhisi için
Türkiye’de ilk defa kullanılan RLB testinin, mikroskobik bakı ve IFA testine
göre daha duyarlı ve özgül bir yöntem olduğu ve saha çalışmalarında
kullanılmasının yarar sağlayacağı kanısına varılmıştır.
d)
Bilimsel
katkılar
Bu
çalışma ile, Türkiye’de ilk defa PZR testini hibridizasyon ile kombine eden RLB
testi uygulanmış ve rutin uygulanır hale getirilmiştir. Testin sağladığı pratik
yararlar yanında, Ankara bölgesinde Theileria türlerinin yayılışı ile
ilgili güncel veriler elde edilmiş, T.buffeli/orientalis grubu
parazitlerin varlığı ilk defa ortaya konmuştur.
Çalışmanın
çeşitli evrelerinde yabancı bilim adamlarının deneyim ve bilgilerine
başvurulmuştur. Bunun sonucunda çalışmalarımızdan haberdar olan ve büyük ilgi
gösteren Fransa, İngiltere ve Hollanda’daki çeşitli araştırma merkezlerinden,
Avrupa Birliği 6. Çerçeve Programında yer almak üzere, ortak proje hazırlama
teklifleri alınmış ve bu konuda da çalışmalara başlanmıştır.
e)
Ekonomik
katkılar
Bu
çalışma ile, RLB testinin kullanılması durumunda, incelenen bir örnekte bir çok
hastalık etkeninin aynı anda yoklanabileceği gösterilmiştir. Oysa ki, serelojik
yöntemler veya türe özgü PZR kullanılması durumunda, her hastalık etkeni için
ayrı ayrı testlerin yapılması gerekmektedir. Bunun yanında kullanılan
miniblotterin 45 kanaldan oluştuğu göz önüne alınırsa her bir testte potansiyel
olarak 42 farklı türe bakılabime olasılığı vardır. Membrana Babesia, Theileria,
Ehrlichia, Borrelia ve Anaplasma türlerine özgü farklı
problar yüklenebilir ve böylece kenelerle bulaşan enfeksiyonların tanısına
yönelik kombine bir test oluşturulmuş olur. Bu bakımdan çalışma, zaman ve
ekonomik kazanç yönünden bilinen diğer tanı yöntemlerine göre çok daha yararlı
bulunmuştur.
f)
Karşılaşılan
sorunlar ve öneriler
Çalışmada
karşılaşılan en büyük sorun amolinkerli problarla ilgili olmuştur. Öncelikle Türkiye’de
hizmet veren oligo üreticisi firmalar bu tip modifiye oligoların üretimine
yanaşmamıştır. Bu nedenle söz konusu problar Fransa (Genset), Hollanda (Isogen)
ve Almanya (MWG)’da bulunan 3 değişik firmaya sentezlettirilmiştir. Ancak bu
firmaların ürünleri arasında oldukça büyük farklılıklar bulunmuştur. Özellikle
Genset firması tarafından sentezlenen problar çok kalitesiz olmuş, ya hiç
çalışmamış, ya da yanlış çapraz reaksiyonlar vermiştir. MWG firması tarafından
sentezlenenler ise oldukça özgül çalışmış, ancak onların da yüksek yoğunlukta
kullanılması gerekmiştir. Isogen firmasının probları en iyi sonuçları
vermiştir, bu nedenle çalışmada kullanılmışlardır. Söz konusu durum, gelecekte
RLB kullanılarak yapılacak çalışmalarda oligo sentezleyen firmaları dikkatli
seçilmesi gerektiğini göstermektedir.
Çalışmalar
sırasında PZR ve RLB testinde kullanılan sarf malzemelerinin (özellikle Taq DNA
polymerase, dNTP ve SDS) kalitesinin reaksiyonu oldukça etkilediği
gözlenmiştir. Bu durumun önüne geçebilmek için, pahalı olmasına rağmen, bilinen
üreticilerin ürünlerinin kullanılması gerektiği kanısındayız.
VI.
KAYNAKLAR
AKTAS, M., Dumanli, N., Cetinkaya, B., Cakmak, A., Field evaluation of PCR in detecting Theileria annulata infection in cattle in eastern Turkey, Vet.Rec., 150:548-549, (2002).
BEKKER, C., de Vos, S., Taoufik, A., Sparagano, O., Jongejan, F., Simultaneous detection of Anaplasma and Ehrlichia species in ruminants and detection of Ehrlichia ruminantium in Amblyomma variegatum ticks by reverse line blot hybridization, Vet.Microbiol., 89:223-, (2002).
BROWN, C. G., Control of tropical theileriosis (Theileria annulata infection) of cattle, Parassitologia, 32:23-31, (1990).
BURRIDGE, M. J., Brown, C. G., Kimber, C. D., Theileria annulata: cross-reactions between a cell culture schizont antigen and antigens of East African species in the indirect fluorescent antibody test, Exp.Parasitol., 35:374-380, (1974).
CALDER, J. A., Reddy, G. R., Chieves, L., Courtney, C. H., Littell, R., Livengood, J. R., Norval, R. A., Smith, C., Dame, J. B., Monitoring Babesia bovis infections in cattle by using PCR-based tests, Journal of Clinical Microbiology, 34:2748-2755, (1996).
ÇAKMAK, A. Untersuchungen zur ınzidenz von Hamoparasiten in einer Rinderherde in der Provinz Ankara. Hannover, Tieraerztl Hochsch, Diss. 133p, (1987).
D'OLIVEIRA, C., van der, W. M., Habela, M. A., Jacquiet, P., Jongejan, F., Detection of Theileria annulata in blood samples of carrier cattle by PCR, Journal of Clinical Microbiology, 33:2665-2669, (1995).
D'OLIVEIRA, C., van der, W. M., Jacquiet, P., Jongejan, F. , Detection of Theileria annulata by the PCR in ticks (Acari:Ixodidae) collected from cattle in Mauritania, Exp.Appl.Acarol., 21:279-291, (1997) .
DE KOK, J. B., d'Oliveira, C., Jongejan, F., Detection of the protozoan parasite Theileria annulata in Hyalomma ticks by the polymerase chain reaction, Exp.Appl.Acarol., 17:839-846, (1993).
DINCER, S., Sayin, F., Karaer, Z., Cakmak, A., Friedhoff, K. T., Muller, I., Inci, A., Yukari, B. A., Eren, H., Serological studies on the prevalence of blood parasites in cattle in the Black Sea region of Turkey, Ankara Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 38:206-226, (1991) .
EREN, H., Cakmak, A., Yukari, B. A., Serological prevalence of Theileria annulata in various regions of Turkey, Veteriner Fakultesi Dergisi, Ankara Universitesi, 42:57-60, (1995).
FAHRIMAL, Y., Goff, W. L., Jasmer, D. P., Detection of Babesia bovis carrier cattle by using polymerase chain reaction amplification of parasite DNA, Journal of Clinical Microbiology, 30:1374-1379, (1992).
FIGUEROA, J. V., Chieves, L. P., Johnson, G. S., Buening, G. M., Detection of Babesia bigemina-infected carriers by polymerase chain reaction amplification, Journal of Clinical Microbiology, 30:2576-2582, (1992).
FIGUEROA, J. V., Chieves, L. P., Johnson, G. S., Buening, G. M., Multiplex polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood, Vet.Parasitol., 50:69-81, (1993).
GEORGES, K., Loria, G. R., Riili, S., Greco, A., Caracappa, S., Jongejan, F., Sparagano, O., Detection of haemoparasites in cattle by reverse line blot hybridisation with a note on the distribution of ticks in Sicily, Vet.Parasitol., 99:273-286, (2001).
GREMMEL, H.D. Invitro Infection von Bovine Lymphoziten Mit Theileria Sporozoiten. Hannover, Tieraerztl Med Hochsch, Diss. (1983).
GUBBELS, J. M., De Vos, A. P., van der, W. M., Viseras, J., Schouls, L. M., de Vries, E., Jongejan, F., Simultaneous detection of bovine Theileria and Babesia species by reverse line blot hybridization, Journal of Clinical Microbiology, 37:1782-1789, (1999).
HOFFMAN, G., Hörchner, F., Schein, E., Gerber, H., Saisonale auftretten von Zecken und Piroplasmen bei Haustieren in der Asiatischen Provinzen der Türkei, Berl.Münch.Tier.Wochschr, 94:152-156, (1971).
KAWAZU, S., Sugimoto, C., Kamio, T., Fujisaki, K., Analysis of the genes encoding immunodominant piroplasm surface proteins of Theileria sergenti and Theileria buffeli by nucleotide sequencing and polymerase chain reaction, Mol.Biochem.Parasitol., 56 :169-175, (1992).
KIRVAR, E., Ilhan, T., Katzer, F., Hooshmand-Rad, P., Zweygarth, E., Gerstenberg, C., Phipps, P., Brown, C. G., Detection of Theileria annulata in cattle and vector ticks by PCR using the Tams1 gene sequences, Parasitology, 120:245-254, (2000).
LUNEMANN, J. D., Zarmas, S., Priem, S., Franz, J., Zschenderlein, R., Aberer, E., Klein, R., Schouls, L., Burmester, G. R., Krause, A., Rapid typing of Borrelia burgdorferi sensu lato species in specimens from patients with different manifestations of Lyme borreliosis, J Clin.Microbiol., 39:1130-1133, (2001).
MARTIN-SANCHEZ, J., Viseras, J., Adroher, F. J., Garcia-Fernandez, P., Nested polymerase chain reaction for detection of Theileria annulata and comparison with conventional diagnostic techniques: its use in epidemiology studies, Parasitol.Res., 85:243-245, (1999).
MIMIOĞLU, M., Ulutaş, M., Güler, S., Yurdumuz Sığırlarında Theileriosis Etkenleri ve Diger Kan Parazitleri, (1971).
NEITZ, W. O., Theileriosis, Gonderioses and Cytauxzoonoses: A Review, Onderstepoort J.Vet.Res., 27:275-381, (1957).
NORVAL, R. A., Perry, B. D., Young, A. S., The Epidemiology of Theileriosis in Africa1-481, (1992).
PAPADOPOULOS, B., Perie, N. M., Uilenberg, G., Piroplasms of domestic animals in the Macedonia region of Greece. 1. Serological cross-reactions, Vet.Parasitol., 63:41-56, (1996).
PIPANO, E., Immunological apects of Theileria annulata infection, Bull.Off Int.Epizoot., 81:139-159, (1974).
PIPANO, E., Cahana, M., Fluroescent antibody test for the serodiagnosis of Theileria annulata, J.Parasitol., 55:765- , (1969).
RIJPKEMA, S. G., Molkenboer, M. J., Schouls, L. M., Jongejan, F., Schellekens, J. F., Simultaneous detection and genotyping of three genomic groups of Borrelia burgdorferi sensu lato in Dutch Ixodes ricinus ticks by characterization of the amplified intergenic spacer region between 5S and 23S rRNA genes, Journal of Clinical Microbiology, 33:3091-3095, (1995).
RISTIC, M., Lewis, G., Babesia in man and wild and laboratory-adapted mammals 53-76, (1977).
SAYIN, F., Dincer, S., Cakmak, A., Inci, A., Yukari, B. A., Vatanserver, Z., Nalbantoglu, S., Deniz, A., Tick-borne diseases in Turkey, Proceedings of the European Union International Symposium on ticks and tickborne diseases, September 2 6, 1996, Xi'an, China, 29:53S-, (1997).
SONENSHINE, D., Biology of Ticks , vol 2 (1993).
SPARAGANO, O., Jongejan, F., Molecular characterization of ticks and tick-borne pathogens, Parassitologia, 41 Suppl 1:101-5.:101-105, (1999).
SPARAGANO, O. A., Allsopp, M. T., Mank, R. A., Rijpkema, S. G., Figueroa, J. V., Jongejan, F., Molecular detection of pathogen DNA in ticks (Acari: Ixodidae): a review, Exp.Appl.Acarol., 23:929-960, (1999b).
SPARAGANO, O. A., Carelli, G., Ceci, L., Shkap, V., Molad, T., Vitale, F., Loria, G. R., Reale, S., Caracappa, S., Bouattour, A., Almeria, S., Castella, J., Corchero, E., Habela, M., Pan-Mediterranean comparison for the molecular detection of Theileria annulata, Ann.N.Y.Acad.Sci, 969:73-7.:73-77, (2002).
TAIT, A., Hall, F. R., Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines, Rev.Sci.Tech., 9:387-403, (1990).
TANYUKSEL, M., Vatansever, Z., Karaer, Z., Araz, E., Haznedaroglu, T., Yukari, B. A., Acici, M., Epidemiology of bovine babesiosis and its zoonotic importance, Turkiye Parazitoloji Dergisi, 26:42-47, (2002).
TÜZER, E., İstanbul ili ve çevresinde sığırlarda görülen Babesia, Theileria ve Anaplasma türleri ile bunlardan kaynaklanan infeksiyonların yayılışı üzerinde araştırmalar, Ist Üniv Vet Fak Derg., 8:97-110, (1981).
UILENBERG, G., G., Permin, A., Hansen, J. W., Significance of tick-borne haemoparasitic diseases to animal health in the tropics, Use of applicable biotechnological methods for diagnosing haemoparasites: Proceedings of the Expert Consultation, Merida, Mexico, 4 6 October 1993, 7-28; 61 ref.: (1994).
VATANSEVER, Z., Nalbantoglu, S., Detection of Cattle Infected with Theileria annulata in Fields by Nested PCR, IFAT and Microscopic Examination of Blood Smears, Turk J Vet Anim Sci, 26:1465-1469, (2002).
VII. Ekler
Tablo 1. Biodyne C membrana tutturulan aminolinkerli probların 5’-3’ dizilişleri a.
|
Özgün
olduğu tür |
Diziliş (5’-3’) |
Kaynak |
|
Theileria ve Babesia türleri (CatchAll) |
TAATGGTTAATAGGARCRGTTG |
Gubbels et
al. (1999) |
|
T.
annulata |
CCTCTGGGGTCTGTGCA |
Georges ve ark. (2001) |
|
T. buffeli/orientalis |
GGCTTATTTCGGWTTGATTTT |
Gubbels et
al. (1999) |
|
T. mutans |
CTTGCGTCTCCGAATGTT |
Gubbels et al. (1999) |
|
T. taurotragi |
TCTTGGCACGTGGCTTTT |
Gubbels et al. (1999) |
|
T. velifera |
CCTATTCTCCTTTACGAGT |
Gubbels et al. (1999) |
a T: thymine; A: adenine; C: cytosine; G:
guanine; W: A veya T; R: A veya G.
Tablo 2. Çalışmada kullanılan probların mebranlara tutturuluş sırası ve konsantrasyonları
|
Miniblotter |
Prob |
Konsantrasyon pmol/150µl |
|
1 |
%2 çini mürekkebi |
|
|
2 |
NaHCO3 buffer |
|
|
3 |
Babesia + Theileria (CathAll) |
100 |
|
4 |
T.
annulata |
200 |
|
5 |
T. buffeli/orientalis |
200 |
|
6 |
T. mutans |
800 |
|
7 |
T. taurotragi |
400 |
|
8 |
T. velifera |
400 |
|
9 |
NaHCO3
buffer |
|
|
10 |
NaHCO3 buffer |
|
|
11 |
NaHCO3 buffer |
|
|
12 |
NaHCO3 buffer |
|
|
13 |
NaHCO3 buffer |
|
|
14 |
NaHCO3 buffer |
|
|
15 |
NaHCO3 buffer |
|
|
16 |
NaHCO3 buffer |
|
|
17 |
NaHCO3 buffer |
|
|
18 |
NaHCO3 buffer |
|
|
19 |
NaHCO3 buffer |
|
|
20 |
NaHCO3 buffer |
|
|
21 |
NaHCO3 buffer |
|
|
22 |
NaHCO3 buffer |
|
|
23 |
NaHCO3 buffer |
|
|
24 |
NaHCO3 buffer |
|
|
25 |
NaHCO3 buffer |
|
|
26 |
NaHCO3 buffer |
|
|
27 |
NaHCO3 buffer |
|
|
28 |
NaHCO3 buffer |
|
|
29 |
NaHCO3 buffer |
|
|
30 |
NaHCO3 buffer |
|
|
31 |
NaHCO3 buffer |
|
|
32 |
NaHCO3 buffer |
|
|
33 |
NaHCO3 buffer |
|
|
34 |
NaHCO3 buffer |
|
|
35 |
NaHCO3 buffer |
|
|
36 |
NaHCO3 buffer |
|
|
37 |
NaHCO3 buffer |
|
|
38 |
NaHCO3 buffer |
|
|
39 |
NaHCO3 buffer |
|
|
40 |
NaHCO3 buffer |
|
|
41 |
NaHCO3 buffer |
|
|
42 |
NaHCO3 buffer |
|
|
43 |
NaHCO3 buffer |
|
|
44 |
NaHCO3 buffer |
|
|
45 |
%2 çini mürekkebi |
|
Tablo 3. Ankara yöresinde RLB, IFA ve Mikroskobik bakı ile Theileria türlerinin çalışma merkezlerine göre dağılımı
|
|
Örneklenen (n) |
Mik. Bakı pozitif (n) |
IFA pozitif (n) |
RLB pozitif (n) |
T. annulata |
T.buffeli |
Miks olgu |
||
|
|
|
|
|
T |
M |
T |
M |
|
|
|
Ankara Merkez |
48 |
4 |
0 |
11 |
4 |
0 |
7 |
0 |
0 |
|
Bala |
31 |
14 |
17 |
18 |
17 |
1 |
0 |
1 |
1 |
|
Beypazarı |
9 |
7 |
6 |
7 |
3 |
4 |
0 |
4 |
4 |
|
Çubuk |
45 |
19 |
24 |
28 |
25 |
3 |
0 |
3 |
3 |
|
Elmadağ |
44 |
2 |
6 |
17 |
13 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
Gölbaşı |
2 |
2 |
0 |
2 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Haymana |
22 |
9 |
2 |
9 |
6 |
2 |
1 |
2 |
2 |
|
Kızılcahamam |
10 |
0 |
0 |
6 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
Polatlı |
39 |
17 |
15 |
21 |
13 |
4 |
4 |
4 |
4 |
|
Toplam |
250 |
74 |
70 |
119 |
85 |
18 |
16 |
18 |
|
|
|
|
|
103 |
34 |
18 |
||||
|
Prevalans |
|
0.296 |
0.280 |
0.476 |
0.340 |
0.064 |
0,072 |
||
T: Tek başına gözlendiği olgu sayısı
M: Miks olgu sayısı
Tablo 4. RLB, Mikroskobik bakı ve
IFAT sonuçlarının karşılaştırılması
|
|
RLB |
Toplam |
|
|
|
+ |
- |
|
|
MB+;IFAT+ |
48 |
0 |
48 |
|
MB+;IFAT- |
26 |
0 |
26 |
|
MB-;IFAT+ |
14 |
8 |
22 |
|
MB-;IFAT- |
31 |
123 |
154 |
|
Toplam |
119 |
131 |
250 |
MB:Mikroskobik bakı
Şekil 1. RLB testi sonuçları. Sıralar 1-43 Saahadan elde edilen
örneklerin PZR ürünleri (30 negatif kontrol). Sütünlar: Özgün problar 1- Catch
all, 2- T.annulata, 3- T.buffeli/orientalis, 4- T.mutans, 5- T.velifera, 6-
T.taurotragi, 7- NaHCO3 buffer.