PROJE

Sıçanlarda (Rattus norvegicus) Alloksan Diyabetin İskelet Kas Hücrelerine Etkisi

Proje No: 2000.07.05031

Proje Yürütücüsü: Dr. Nursel GÜL

Yardımcı Araştırmacılar: Prof. Dr. Cevat AYVALI

Dr. Suna CEBESOY

Dr. Nesrin ÖZSOY

ANKARA ÜNİVERSİTESİ ARAŞTIRMA FONU,

ANKARA, 2000-2003

I- PROJE ADI: Alloksan Diyabetin Sıçanlarda (Rattus norvegicus) İskelet Kas Hücrelerine Etkisi

PROJE ÖZETİ

Diyabet etkeni olarak bilinen Alloksan, sıçanlara intravenöz yolla enjekte edildi. Otuz gün sonra kontrollü ve diyabetli sıçanlardan kas dokuları alındı. Diyabetli ve kontrol sıçanların extensor digitorum longus(EDL) ve soleus kaslarının tip I, tip II a ve tip II b fibrillerinin ince yapıları geçirmeli elektron mikroskobunda (TEM) incelendi. Diyabetik sıçanların tip I ve tip II a fibrillerinin sitoplazmalarında mitokondri krista erimeleri, çekirdek ve mitokondri yakınlarında çok sayıda lipit damlacıkları tespit edildi. Tip II a fibrillerinde çekirdeklerin etrafında sitoplazma kayıpları gözlendi. Diyabetik sıçanların tip II b fibrillerin miyofibrillerinde ve Z çizgilerinde oryantasyon bozuklukları gözlenmiştir. Yine bu fibrillerin sitoplazmalarında lipit damlacıklarında artış olduğu ve mitokondri sayılarında azalma olduğu ancak mitokondrilerin morfolojik yapılarında herhangi bir değişiklik olmadığı gözlenmiştir.

Öte yandan soleus kasları kontrol ve diyabetik sıçanlardan alındı ve çeşitli biyotinli lektinlerle boyandı. Boyamada avidin-peroksidaz kompleksi biyotinli lektinlere bağlandı. Normal ve diyabetli kas hücre zarlarına çeşitli lektinlerin değişik derecelerde bağlandığı gözlenmiştir. En kuvvetli bağlanma GS-I lektini ile olmuştur. GS-I lektini sadece hücre zarına değil aynı zamanda hücre sitoplazmasındaki miyofibrillere de bağlanmıştır. Kullanılan lektinlerden WGA ve UEA-I diyabetli hücre zarlarına zayıf şiddette bağlanmıştır.

Sonuç olarak, normal hücre zarlarına göre diyabetik hücre zarları farklı derecede boyanmıştır. Elde edilen bulgular, diyabetik sıçanların soleus kası hücre zarlarında meydana gelmesi mümkün olan karbohidratların yapısal değişimini karşılaştırmada temel destek sağlamaktadır.

ANAHTAR SÖZCÜKLER

Diabetes mellitus, sıçan, alloksan, lektin, soleus ve extensor digitorum longus(EDL) iskelet kası.

PROJENİN İNGİLİZCE ADI: Effects of Alloxan-Diabetes on Skeletal Muscle Cell of Rats (Rattus norvegicus)

PROJENİN İNGİLİZCE ÖZETİ:

Alloxan, as known agent of diabetes was injected by intravenously into rats. After thirthy days, skeletal muscles were obtained from diabetic and controll rats. Ultrastructures of type I, type II a and type II b fibrills of soleus and extensor digitorum longus (EDL) muscles of diabetic and controll rats were observed by transmission electron microscopy (TEM). It was detemined that there were the melting cristae of mitochondria, numerous lipid droplets around the nucleus and mitochondria in the cytoplasm of type I and type II a fibrills of diabetic rats. The loss of the cytoplasm around the nuclei of type II a fibrills were also observed in diabetic rats. Myofibrills and Z lines of type II b fibrills of diabetic rats were found disorder on orientiation. Also, cytoplasms of type II b fibrills of diabetic rats were increase of lipid droplets and decrease of mitochondria but no changes morphological structure of these mitochondria.

On the other hand, soleus muscles were obtained from controll and diabetic rats and stained by several biotin-labelled lectins. The avidin-peroxidase complex were bounded to biotin-labelled lectins in the staining. Several lectins were stained cell membranes of soleus muscles of normal and diabetic rats. GS-I lectin was bounded more strongly to cell membrane of diabetic rats than other lectins. Not only cell membranes but also miyofibrills of cytoplasms were stained by GS-I lectin. WGA and UEA-I of the used lectins were weakly bounded to cell membranes of soleus muscles of diabetic rats.

As a result, cell membranes of soleus muscles of diabetic rats were differently stained by biotin-labelled lectins than those of controll rats. These results provide a basis for the comparison of possible changes in carbohydrates which may occur cell membranes of soleus muscles diabetic rats.

II. PROJENİN AMACI ve KAPSAMI

Diabetes mellitus (şeker hastalığı ) insulin hormonunun eksikliği ile organizmada oluşan bir hastalıktır. Bilindiği gibi şeker hastalığı organizmada birçok dokuya hasar vermektedir. İnsuline bağlı diyabetin metabolik düzensizliklere neden olduğu bilinmektedir. Klinik bulgular diyabetin daha çok gözler, böbrekler, kalp ve bacaklar üzerinde etkili olduğunu ortaya koymuştur.İnsülin ile tedavi edildikleri halde diyabet hastalarının organ ve dokularında hasar oluşmaktadır. Alloksan-diyabetin sıçanların soleus ve extensor digitorum longus(EDL) kas fibrilleri üzerine etkisi önceki çalışmamızda histokimyasal yönden incelenmiştir (Cebesoy ve ark., 1999). Çalışmada hızlı kasılan fibril populasyonunda oksidatif enzim kaybının yavaş kasılan fibrillerden daha fazla olduğu gözlenmiştir. Işık mikroskobunda histokimyasal yönden görülen bozulmaların bu iki kas tipinde gerçekte nerelerde olduğunu gözlemek amacıyla projede kaslar elektron mikroskobu düzeyinde incelenmiştir. Alloxan ve streptozotosin verilerek diyabet oluşturulan ratlarda kasın morfolojisinde, biyokimyasal özelliklerinde ve kasın kasılmasında değişikliklerin meydana geldiği araştırıcılar tarafından ortaya konmuştur (Grossie, 1982; Paulus ve Grossie, 1983; Cotter ve ark., 1989). Diyabetin insanlarda ve ratlarda dişeti hastalıklarına neden olduğu yapılan araştırmalar sonucu tesbit edilmiştir (Hugoson ve ark., 1989; Shlossman ve ark., 1990; Taylor ve ark., 1996). Hawthorne ve arkadaşları (1986), deneysel olarak diyabet oluşturdukları ratlarda, diyabetin damar endotellerinin membran aktivitesinde değişiklikler meydana getirdiğini gözlemişlerdir.

Lektinler, şeker bağlayan protein veya glikoprotein yapısındaki moleküllerdir (Sharon, 1977; Vierbüchen , 1991). Lektinlerin, hücre-hücre tanımasında ve hücre adhezyonunda görev aldığı bildirilmiştir (Sharon, 1977; Nichols and Nakamura, 1986) .

Bitkilerdeki lektinlerin şeker taşınmasında ve depolanmasında rol oynayabileceği açıklanmıştır (Lis ve Sharon, 1986 ; McKenzie ve Preston, 1992 a,b ). İşaretli lektin kullanılarak çeşitli metabolik faaliyetler ve hastalık teşhis edilmektedir. Örneğin kanser teşhisinde lektin reseptörlerinin normal hücrelerde dağınık halde bulunduğu, kanserli hücrelerde ise birarada bulunduğu bilinmektedir (Vierbuchen,1991). Anadolu ve arkadaşları (1992), deri kanserinin teşhisinde işaretli lektin kullanmışlardır. Canlı türlerinin teşhisinde örneğin malaria hastalığına neden olan sivri sinek türlerinin (Mohamed ve ark., 1991), ve enfeksiyona neden olan bakteri türlerinin teşhisi, (Sharon, 1977; Vierbuchen, 1991) lektinin hücre yüzeylerine bağlanma durumuna göre yapılmaktadır. İnsanlardaki kas hastalıkları , kas fibrillerinin hücre yüzey değişiklikleri lektin kullanılarak teşhis edilmeye çalışılmıştır (Pena ve ark.,1981; Dunn ve ark., 1982 ; Capaldi ve ark., 1984; Helliwell, 1988 ; Helliwell ve ark., 1989). Derideki keratinosit hücrelerinin subpopulasyonu lektin kullanılarak teşhis edilmiştir (Desantis ve ark., 2003).

Şeker hastalığının günümüzde hala önemini koruması ve lektinlerin birçok araştırmada kullanılması dikkate alınarak, alloksan ile diyabet oluşturulan rat kas fibrilerinin yüzeyinde ne gibi bir değişiklik oluşturduğunu gözlemek amacıyla proje çalışması yapılmıştır. Hücrelerin yüzeyindeki değişiklik kullanılan lektinlerin hücre yüzeyine bağlanması veya bağlanmaması durumuna göre tesbit edilmiştir.

3. MATERYAL VE YÖNTEM

Araştırmada deney materyali olarak rat (sıçan) kullanıldı. Ratlara alloksan maddesi kuyruktan intravenöz yolla 55 mg/ml enjekte edildi. Diyabetin oluşup oluşmadığı 24 saat sonra idrarda şeker konsantrasyonu tesbit edildi. Diyabet oluşturulan ratlar, dört hafta boyunca kontrol altında tutuldu ve bu süre sonunda hayvan ağırlığına ve kandaki glukoz konsantrasyonuna bakıldı. Kan şekeri 250-400 mg/dlise orta derece, 400 mg/dl’ den büyük ise şiddetli diyabet olarak belirlendi (Reuterving ve ark., 1987). Belirlenen diyabet durumuna göre hayvanların iskelet kaslarından soleus kası alındı. Kas materyallerinden kriyomikrotomda 5-6 mm kalınlığında kesitleri alındı. Kriyomikrotomla alınan dondurulmuş ve fikse edilmemiş kesitler, oda sıcaklığında 60 dakika lektinlerle (Tablo I) ve daha sonra 45 dakika avidin –biotin – peroksidazla işlem yapıldı. Bu iki işlem sonrasında kesitler, fosfatlı tuz çözeltisinde (PBS, pH 7.4) iki kez yıkandı. Kesitler, 3ml hidrojen peroksit içeren 0.6 mg/ml diaminobenzidin’de 5 dakika tutuldu ve zıt boya olarak Hematoksilin ile boyanıp, kanada balsamı ile kapatıldı. Boyamanın spesifikliği, boyama işleminden lektin kullanılmadan ve aşağıda verilen uygun lektin inhibitörleri (0.1 M) ile lektinlerin preinkübasyonu kontrol edildi (Helliwell ve ark., 1989) .

Tablo 1 . Kullanılan lektinler ve inhibitör karbohidratlar

Lektin Adı İnhibitör Karbohidratlar

Con A (Concavalin A) D- Mannoz , D- Glukoz

WGA (Triticum vulgaris ) N-Asetil Glukozamin

PNA (Arachis hypogaea) b-D- Galaktoz

BPA (Bauhinio purpurea) 2-Asetamido-2-deoksi-D-galaktoz(Nas-D-Galaktozamin)

UEA (Ulex europaeus) L-Fukoz

DBA (Dolichos biflorus) N-Asetil –D- Galaktozamin

GS 1 (BS-I) Griffonia (Banderaea) simplici D-Galaktoz

IV. ANALİZ ve BULGULAR

V. SONUÇ ve ÖNERİLER

Yapılan araştırmada kontrol sıçanlardan alınan soleus ve EDL kasları TEM ile incelendiğinde Z çizgilerinin kalınlığı, sarkotubuler sistemin gelişmesi ,mitokondrilerin lokalizasyonu ve sıklığına göre tipI, tip II a ve tip II b olmak üzere üç farklı fibril tipi ayırt edilmiştir.

Tip I fibrillerinin daha koyu sarkoplazmalı olduğu, daha kalın bir Z çizgisine sahip oldukları ve diğer fibril tiplerinden daha az mitokondri içerdikleri gözlenmiştir. Ayrıca tip I fibrillerde Z çizgilerinin düzensiz oldukları da dikkat çekmiştir (Şekil 1). Tip II fibrillerde ise daha ince bir Z çizgisi, daha fazla mitokondri olmasına rağmen iyi gelişmiş sarkoplazmik retikulumlarının varlığı tespit edilmiştir (Şekil 2).

Şekil 1. Tip I fibrillerinin genel yapısı. è Düzensiz Z çizgisi . X 4800

Şekil 2. Tip II fibrillerinin ince yapısı. M. Mitokondri. X. 7200

Diabetik sıçanlarda tip I ve tip II a fibrillerinin mitokondrilerinde krista erimelerine ve mitokondri kayıplarına rastlanmıştır ( Şekil 3).

Şekil 3. Alloksan-diyabetik sıçanların Tip I fibrillerinde görülen mitokondriyal krista erimeleri. M. Kristası erimiş mitokondri. X. 4800

Bu iki fibril tipinde de sarkolemma aralarında ve özellikle mitokondri ve çekirdek yakınlarında lipit damlacıklarının arttığı dikkat çekmektedir ( Şekil 4).

Şekil 4. Alloksan-diyabetik tip II a fibrili. L. Lipit damlacığı. X 7200

Tip II a fibrillerinde ayrıca çekirdeğin, etrafındaki sitoplazmadan ayrıldığı tespit edilmiştir Yine bu fibrillerde çekirdekde aşırı heterokromatinleşme ( Şekil 5) ve şekil bozuklukları, çekirdeğin girintili- çıkıntılı bir şekil aldığı görülmüştür ( Şekil 6).

Şekil 5. Diyabetik tip II a fibrilindeki nukleus durumu. H. Heterokromatinleşme. X.10000

Şekil 6. Diyabetik tip II a fibriline ait çekirdeğin morfolojik bozukluğu. X. 5800

Tip II b fibrillerinde ise A ve I bandları ile Z çizgilerinde yön bozuklukları ve bu bölgelerde özellikle A bandında materyal kaybı tesbit edilmiştir ( Şekil 7).

Şekil 7. Diyabetik tip II b fibrili. A ve I bandlarında yön bozukluğu (è); A ve I bandlarında materyal kaybı (I). X 5800

Diabetik sıçanların tip II b fibrillerinde mitokondri sayılarında azalma olduğu gözlenmiş fakat morfolojik yapılarında değişikliğe rastlanmamıştır. Tip II b fibrillerinde lipit damlacıkları gözlenmiştir( Şekil 8).

Şekil 8. Diyabetik tip II b fibrilindeki mitokondriler (M) ve lipit damlacığı (L). X. 14000

Araştırmada alloksan-diyabetin soleus kas hücrelerine etkisini tespit etmek için biotinli lektinler kullanılmıştır. Bunlar sırasıyla BPA, Con A, WGA, PNA, UEA, DBA ve GS-I lektinleridir. Bu lektinlerin kas hücrelerine bağlanmaları hücre zarındaki glikoproteinlerin karbohidrat bölgeleriyle olmaktadır. Kullanılan lektinlerden BPA normal kas hücresi zarlarını orta şiddette boyamıştır. Buna karşılık diyabetli kas hücrelerinin zarlarını kuvvetli boyamıştır (Şekil 9a ,9b).

(a) (b)

Şekil 9. a) BPA ile boyanan kontrol solues kas hücreleri. X. 370

b) BPA ile boyanan alloksan-diyabetik soleus kas hücrelerinin zarları. X. 370

Araştırmada kullanılan biotinli lektinlerden Con A, PNA ve DBA lektinleri kontrol grubu hücre zarlarını orta şiddette boyarken, diyabetli hücre zarlarını zayıf şiddette boyamıştır (Şekil 10-12).

(a) (b)

Şekil 10 . a) Con A ile boyanan kontrol grubu soleus kas hücrelerinin zarları. X. 370

b) Con A ile zayıf boyanan alloksan diyabetik soleus kas hücre zarları. X. 370

(a) (b)

Şekil 11 . a) PNA ile boyanan normal soleus kas hücrelerinin zarları. X. 370

b) PNA ile zayıf boyanan alloksan diyabetik soleus kas hücre zarları. X. 370

(a) (b)

Şekil 12 . a) DBA ile boyanan kontrol soleus kas hücrelerinin zarları. X. 370

b) DBA ile zayıf boyanan alloksan diyabetik soleus kas hücre zarları. X. 370

Araştırmalarda yaygın olarak kullanılan ve buğdaydan elde edilen WGA lektini ile UEA-I lektini kontrol soleus kası hücre zarlarını zayıf şiddette boyadığı halde alloksan diyabetli soleus kası hücre zarlarını orta şiddette boyamıştır(Şekil 13-14).

(a) (b)

Şekil 13 . a) WGA ile zayıf boyanan kontrol soleus kas hücrelerinin zarları. X. 370

b) WGA ile orta boyanan alloksan diyabetik soleus kas hücre zarları. X. 370

(a) (b)

Şekil 14 . a) UEA-I ile boyanan kontrol soleus kas hücrelerinin zarları. X. 370

b) UEA-I ile zayıf boyanan alloksan diyabetik soleus kas hücre zarları. X. 370

Çalışmada alloksanla oluşturulan diyabetin etkisi en iyi şekilde GS-I lektini ile tespit edilmiştir. GS-I lektini hücre zarlarındaki glikoproteinlerin D-Galaktoz’u ile bağlanmaktadır. Yapılan boyamada GS-I lektininin kontrol hücre zarlarını orta şiddette boyarken, diyabetli soleus kası hücre zarlarını çok kuvvetli olarak boyamıştır. Hatta hücre içindeki miyofibrillerin de GS-I lektini ile boyandığı dikkati çekmiştir (Şekil 15).

Biotinli lektinlerle yapılan çalışmada sonuçlar dikkate alındığı zaman lektinlerin kontrol hücre zarlarını diyabetli hücre zarlarına göre farklı boyadığı tespit edilmiştir. Her lektinin hücre zarındaki glikoproteinlerin farklı karbohidratlarına bağlandığı bilinmektedir (Bakınız Tablo I ). Diyabetli hücre zarlarının normal hücre zarlarına göre farklı boyanması hücre zarındaki glikoprotein yapısının değiştiğini göstermektedir. Lektinlerle yapılan bu çalışmanın, diyabetin hücre zarlarına yapısal etkisinin belirlenmesinde temel olacağı düşünülmektedir.

(a) (b)

Şekil 15 . a) GS-I ile kuvvetli boyanan kontrol soleus kas hücrelerinin zarları. X. 370

b) GS-I ile çok kuvvetli boyanan alloksan diyabetik soleus kas hücre zarları. Hücredeki miyofibriller ( ¢). X. 720

VI. KAYNAKLAR

1. CEBESOY,S., ÖZSOY, N., GÜL, N., AYVALI, C., 1999. Alloksan diabetik sıçanlarda iskelet kaslarının histokimyasal incelenmesi. Gazi Ün. Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisinde işleme alınmıştır.

2. GROSSIE, J., 1982. Contractile and electrical characteristic of extensor muscle from alloxan –diabetic rats. An in vitro study. Diabetes, 31:194-202.

3. PAULUS, S.F., and GROSSIE, J., 1983. Skeletal muscle in alloxan-diabetes . A comparison of isometric contractions in fast and slow muscles. Diabetes, 32:1035-1039.

4. COTTER, M.A., CAMERON, N.E., LEAN, D.R., ROBERTSON, S., 1989. Effect of long-term streptozotocin diabetes on the contractile and histochemical properties of rat muscles. J. Exper. Physiol., 74:65-74.

5. HUGOSON, A., THORSTENSSON, H., FALK, H., and KUYLENSTIERNA, J., 1989. Periodontal conditions in insulin-dependent diabetics. J. Clin. Periodontol. 16:215-223.

6. SHLOSSMAN, M., KNOWLER, W.C., PETTITT, D.J., and GENCO, R.J., 1990. Type 2 diabetes mellitus and periodontal disease. JADA, 121:532-536.

7. TAYLOR, G.W., BURT,B.A., BECKER, M.P. , GENCO, R.J., SHLOSSMAN, M., KNOWLER, W.C., and PETTITT, D.J., 1996. Severe periodontitis and risk for poor glycemic control in patients with non-insulin –dependent diabetes mellitus. J. Periodontol., 67:1085-1093.

8. HAWTHHORNE, G.C., MacLELLAN, J.R., MYTHEN, M., ALBERTI, K.G.M.M., and TURNER, G.A., 1986. Studies on glomerular basement membrane in experimental diabetes using lectin histochemistry in Wistar rats. Diabetologia , 29:495-499.

9. SHARON, N., 1977. Lectin. Sci. Amer. , 236(6): 108-119.

10. VIERBUCHEN, M., 1991. Lectin receptors. In Current Topics in Pathology. (Ed. Seifert, G.) 83:1-522. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona.

11. NICHOLS, W.S., and NAKAMURA, R.M., 1986. Agglutination and agglutination inhibition assays. In Manual of Clinical Laboratory Immunology. (Ed. Rose, N.R., Friedman, H., Fahey, J.L.) Third Ed. Pp: 49-56. American Soc. For Mikrobiol., Washington D.C.

12. LIS, H., and SHARON, N., 1986. Lectins as molecules and as tools. Ann. Rev. Biochem., 55:35-67.

13. McKENZIE, A.N.J., and PRESTON, T.M., 1992 a . Purification and characterization of a galactose –spesific agglutinin from the haemolymph of the larval stages of the insect, Calliphora vomitoria. Dev. Comp. Immunol., 16:31-39.

14. McKENZIE, A.N.J., and PRESTON, T.M., 1992 b. Biological characteristics of the Calliphora vomitoria agglutinin. Dev. Comp. Immunol., 16:85-93.

15. ANADOLU, R., ERDEM, C., ERDİ, H., and TAŞPINAR, A., 1992. Skuamöz hücreli karsinoma tanısında peanut agglutinin. Türk J. Dermatopathol. 1: 46-50.

16. MOHAMED, H.A., INGRAM, G.A., MOLYNEUX, D.H., and SAWYER, B.A., 1991. Use of fluorescein-labelled lectin binding of salivary glands to distinquish between Anopheles stephensi and An. Albimanus species and strains. Insect Biochem. 21(7): 767-773.

17. PENA, S.D.J., GORDON, B.B., KARPATI, G., and CARPENTER, S., 1981. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. J. Histochem. Cytochem., 29(4): 542-546.

18. DUNN, M.J., SEWRY, C.A., and DUBOWITZ, V., 1982. Cytochemical studies of lectin binding by diseased human muscle. J. Neurol. Sci., 55:147-159.

19. CAPALDI, M.J., DUNN, M.J., SEWRY, C.A., and DUBAWITZ, V., 1984. Binding of Ricinus communis 1 lectin to the muscle cell plasma membrane in diseased muscle. J. Neurol. Sci., 64: 315-324

20. HELLIWELL, T.R., 1988. Lectin binding and desmin staining during bupivicaine-induced necrosis and regeneration in rat skeletal muscle. J. Pathol., 155:317-326.

21. HELLIWELL,T.R., GUNHAN, O., and EDWARDS, R.H., 1989. Lectin binding and desmin expression during necrosis, regeneration, and neurogenic atrophy of human skeletal muscle. J. Path. , 159:43-51.

22. DESANTIS, S., CORRIERO, A., ACONE, F., ZUBANI, D., CIRILLO, F., PALMIERI, G., and De METRIO, G., 2003. Lectin histochemistry on the dorsal epidermis of the Breton dog. Acta Histochem. 105(1): 73-79.

23. REUTERWİNG, C.O., HOGG, E., and HOLM, J. , 1987. Salivary glands in long-term alloxan-diabetic rats. A quantitative light and electron microscopic study. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. A , 95:131-136.

VII. EKLER

A) MALİ BİLANÇO ve AÇIKLAMALARI:

Çalışmada diyabetin etkisini hücre yüzeyinde görmek için aşağıda kullanılan lektin ve diğer maddeler proje desteği ile alınmıştır (liste halinde aşağıda verilmiştir). Bu madde ve malzemeler (28 kalem) İNTERLAB Firmasından 3 Ocak 2001 tarihinde 4.563.000.000 TL (Dörtmilyar beşyüzaltmışüçmilyon TL) karşılığı Proje kapsamında alınmıştır. Bunun yanı sıra elektron mikroskobu incelemelerinde kullanılan madde ve malzemeler de 2.237.040.000 TL (İkimilyar ikiyüzotuzyedibinkırk TL) karşılığında proje desteği ile TEKSER Firmasından 18 Nisan 2001 tarihinde alınmıştır. Çalışmaların yazım aşamasında kullanılan kırtasiye malzemeleri ZEKİ KIRTASİYE ŞTD.’den 100.000.000 TL (Yüz milyon TL) karşılığı 2.11.2000 tarihinde Proje desteği ile alınmıştır. Kalan para ile ilk önce dört kalemden oluşan lektinler istenmiştir. Ancak istenen lektinlerden SL2641 (Sigma) kodlu RCA lektini ile SL3396(Sigma) kodlu SBA lektini üretimden kaldırıldığı için temin edilememiştir. Bunun yerine bir kutu elektron mikroskobu filmi alınarak Proje harcamaları tamamlanmıştır.

B) MAKİNA ve TEÇHİZAT: Proje çalışmalarında makine ve teçhizat teklifinde bulunulmamıştır.

C) TEKNİK ve BİLİMSEL AYRINTILAR: Materyal ve Yöntem kısmında açıklama yapılmıştır.

D) SUNUMLAR: Yok

E) YAYINLAR: Hazırlanma aşamasında