İnfeksiyöz
bursal hastalığın immunoperoksidaz tekniği ile tanısı ve B lenfositlerde apoptozisin incelenmesi
Özet: İnfeksiyöz bursal hastalığın saha olguları ile virusun aşı suşu D-78 ile deneysel enfeksiyonunda in-situ apoptosis karşılaştırıldı. Çalışmada, 30 adet doğal enfekte 21 günlük civciv, 30 adet 21 günlük D-78 aşı şuşu ile inokule SPF civciv ve 30 adet enfekte olmayan kontrol grubu SPF civciv kullanıldı. Bursa Fabricius örneklerinde hastalığın histopatolojik lezyonları incelendi, immunoperoksidaz yöntemi ile antijen tespit edildi ve TUNEL metodu ile in-situ apoptosis değerlendirildi. One-way ANOVA ve Duncan testi tüm gruplarda istatistiksel farklılıkların değerlendirilmesi için kullanıldı. Makroskobik olarak başlıca bulgu bursa Fabricius ağırlıklarındaki hafif artıştı. Mikroskobik olarak temel patolojik değişiklik lenfositlerdeki dejeneratif ve multifokal nekrotik lezyonlardı. İmmuno-histokimyasal olarak antijen lenfoid folliküllerin korteks ve medullasında bulunan lenfositlerde saptandı. Buna karşılık D-78 inokule edilen grupta çok az sayıda pozitif hücre görüldü. Diğer organ ve kontrol grubunda antijene rastlanmadı. Ortalama apoptotik lenfosit sayıları infeksiyöz bursal hastalığın saha olgularında 51.76, D-78 inokule edilen grupta 36.36 ve kontrol grubunda 34.63 olarak saptandı. Saha olguları ile diğer grupların apoptotik indeksleri arasındaki farklılık istatiksel olarak önemli bulundu (P<0.01). Ancak kontrol grubu ile D-78 inokule edilen grup arasında apoptotik indekslerde istatiksel bir farklılık saptanamadı (P>0.5).
Diagnosis of infectious bursal disease by immunoperoxidase technique and detection of apoptosis in the B lymphocytes.
Abstract: In situ-apoptosis was compared between the field cases of
infectious bursal disease and experimentally infected with infectious bursal
disease virus vaccine strain D-78.In this study, thirty naturally infected 21
day old chickens, thirty 21 days old SPF chickens inoculated with D-78 vaccine
strain and thirty 21 days old uninfected control group SPF chicken were used.
Bursa of Fabricius samples were examined for the evaluation of
histopathological lesions, detection of the infectious bursal disease virus
antigens by immunoperoxidase technique and observation of the in-situ apoptosis by TUNEL method.
One-way ANOVA and
AMAÇ VE
KAPSAM
İnfeksiyöz
bursal hastalık (Gumboro, İBH) civciv ve piliçlerin ekonomik kayıplara yol
açan, çok bulaşıcı akut viral bir hastalığıdır (6). Etken tüm dünyada yaygındır
ve çift sarmallı RNA içeren Birnaviridae familyasından bir virustur (2,3,6).
Hastalığın morbidite oranı %80’e, mortalite oranı ise %5 ve bazı olgularda
%30’a ulaşabilir (6). Virusun bursa Fabricius’taki (bF) lenfoid folliküllerde
yıkımlanmaya neden olduğu ve B lenfositlerin virusun hedef hücreleri olduğu iyi
bilinmektedir (2,3,6,10). Son zamanlarda yapılan çalışmalarda bF dışında timus,
dalak, sekal tonsiller ve kemik iliği gibi diğer lenfoid organlarda da viral
antijenler tespit edilmiştir (2,3,6,9,10).
Hastalığın inkubasyon süresi 2-3 gündür.
Klinik olarak sulu beyaz renkte ishal, halsizlik ve piliçlerin birbirlerinin
arka kısımlarını gagalama gözlenir (6,8). Hastalığın tipik makroskobik bulgusu
bF’un atrofisidir. Akut dönemde bF hiperemi ve ödeme bağlı olarak büyürken,
enfeksiyonu takip eden 5. günde atrofi şekillenmeye başlar ve 8. günde normal
boyutunun 1/3’ne kadar küçülür (6). Mikroskobik olarak, virus bF, dalak, timus,
sekal tonsiller gibi lenfoid organları etkiler. Bursa Fabricius’ta lenfoid foliküllerin substansiya kortikalis
ve medullaris bölgelerinde lenfositlerin ortadan kalktığı, interfolliküler
bölgede ve tunika muskularis’te heterofil infiltrasyonlarının bulunduğu
bildirilmiştir (6,8). Ancak bazı infeksiyöz bursal hastalık virus (İBHV)
suşlarının bu karakteristik değişikliklere neden olmaması sonucunda tanının
güçleştiği ve immunohistokimyasal yöntemlere de gereksinim duyulduğu
kaydedilmiştir (4,5). Ayrıca, diğer enfeksiyonların ve enfeksiyöz olmayan
ajanlarında bF’ta atrofiye neden olabileceği ve bu nedenle İBH histopatolojik
bulgular ile tanısının konmasının her zaman gerçekçi olamayacağı,
immunohistokimyasal yöntemlerin ayırıcı tanıda kullanışlı olacağını
bildirilmiştir (9). Cruz-Coy ve ark. (1993) ise İBH’ta immunoperoksidaz
tekniğinin, immunofloresans tekniğine göre daha duyarlı ve kullanışlı olduğunu
saptamışlardır.
Apoptozis (programlanmış hücre ölümü),
doğal koşullarda yaşlı ve yıpranmış hücrelerin yıkımlanarak organizmadan
uzaklaştırılmasıdır ve hücre DNA’sının
180-200 bazlık parçalara bölünmesi sonucu oluşmaktadır (11). Fizyolojik olarak hücrenin kendini
yıkımlaması yanında, insanlarda AIDS, infeksiyöz civciv anemisi, Newcastle
hastalığı ve kedi lösemi virus enfeksiyonu gibi patolojik olgularda da
şekillendiği kaydedilmiştir (7,12). Inoue ve ark. (1999) , İBHV’nun yüksek
virulant HPS-2 suşu ve GBF-1 referans suşunun patolojik bulgularını ve kemik
iliğinde myelositlerde oluşan apopotik değişiklikleri incelemiştir. HPS-2 suşu
ile enfekte edilen 21 SPF civcivin 6 tanesinin öldüğünü, klinik belirtilerin
belirgin olduğunu, bF’un histopatolojik incelemesinde lenfoid folliküllerin
kortikal kısımlarında lenfositlerde şiddetli boşalma gözlendiğini
kaydetmişlerdir. Diğer taraftan GBF-1 suşu ile enfekte grupta ölüm
şekillenmediği, klinik belirtilerin ve bF’taki lenfoid follikülerde boşalmanın
hafif olduğunu belirtmişlerdir. Kemik iliğinde ise myelositlerde HPS-2 suşunda
%65 oranında apoptozis tespit edilirken, GBF-1 suşunda bu oran %18 olarak
bulunmuştur. Vascocelos ve Lam (1995), virusun etkisini olgun B lenfositler
üzerinde gösterdiğini, hastalıkta gözlenen immun baskılanmanın, virusun B
lenfositler üzerindeki apoptotik etkisi sonucu bu hücrelerin ortadan kalkmasına
bağlı olabileceğini vurgulamıştır. Bir diğer çalışmada, İBHV’nun klasik virulant
suşu (IM-IBDV), antijenik variant E suşu (VE-IBDV) ve attenüe aşı suşu
(B2-IBDV) ile yapılmış, patojen suşların aşı suşuna oranla bF’ta daha hızlı
replike olarak apoptotik B lenfositlerin sayısında belirgin artışa neden
oldukları kaydedilmiştir (10). Ancak araştırıcılar timustaki antijenin
varlığını ortaya koyamamışlar ve bu organdaki apoptozisin bilinmeyen patolojik
mekanizmalar özellikle de sitotoksik T lenfositlerin etkisi ile oluşabileceğini
savunmuşlardır. Ayrıca civcivlerde doğal İBHV enfeksiyonunda, spesifik viral
proteinler tarafından oluşturulan apoptozis ve yangısal olayların hala
bilinmediğini vurgulamışlardır. B lenfositlerdeki apoptozisin hastalığın
patogenezinde ve immun baskılanmada önemli rol oynadığı, virusun apoptozis için
başlangıç faktörü olabileceği değişik araştırıcılar tarafından kaydedilmiştir
(7,10-12).
İmmunoperoksidaz tekniğinin bu çalışma
kapsamında klinik ve histopatolojik olarak İBH tanısı konan doğal enfekte
hayvanlarda denenmesi; B lenfositlerde apoptozisin, doğal enfeksiyonlarda,
virüsün D-78 aşı suşu ile enfekte ve aşısız SPF civcivler ile karşılaştırılmalı
olarak incelenmesi bu projenin amacını oluşturmaktadır.
Araştırmanın materyalini 30 adet 21 günlük doğal enfekte, 30 adet 21 günlük
İBHV D-78 suşu ile aşılı SPF ve 30 adet 21 günlük SPF civciv (kontrol grubu)
olmak üzere toplam 90 adet civciv oluşturdu. Doğal enfekte civcivler Ankara ve
yöresindeki broiler kümeslerinden temin edildi. SPF civcivler 30'ar hayvanlık 2
gruba ayrılarak, 1. Grup 17 günlük iken İBHV'nun D-78 (intervet) aşı suşu ile
aşılandı, diğer grup kontrol olarak tutuldu. Bütün hayvanlara 21 günlük iken
ötenazi uygulandı. Her üç grupta yer alan
hayvanların sistematik
nekropsileri yapılarak başta bF, sekal tonsiller, dalak ve timus olmak üzere
tüm organlar incelendi. Bursa Fabricius’ların ağırlıkları, civciv ağırlıkları
ile karşılaştırıldı. Alınan doku örnekleri %10’luk formaldehitte tespit
edilerek, alkol ve ksilol serilerinden geçirildikten sonra, parafinde bloklandı
ve mikrotom ile her bloktan 5-6 mikron kalınlığında 3 adet kesit alındı.
Histopatolojik incelemede rutin
hematoksilen eozin boyama yöntemi ile boyanan kesitler ışık mikroskobunda
değerlendirildi.
İmmunoperoksidaz boyamada 3
(triethoxysilyl) propylamine (APES) (Merck) ile hazırlanan adhesiv lamlara
alınan kesitler, alkol ve ksilol serilerinden geçirildikten sonra metanol
içerisinde hazırlanan %3 hidrojen peroksit solusyonu ile endojen peroksidaz
aktivitesi ortadan kaldırıldı. Normal keçi serumu ile nonspesifik boyanma
engellendi, poliklonal anti İBHV antiserumu (1/100 Manisa Tavuk Hastalıkları
Araştırma ve Aşı Üretim Enstitüsü, Manisa) ile dokuda var olan antijen
bağlandı, HRP ile işaretli anti-civciv IgG (1/1000 Sigma) ve DAB (Sigma) ile
ortaya konan boyanmalar ışık mikroskopta değerlendirildi
Apoptozisin ortaya konulması için doku
kesitleri in-situ apoptosis tespit kiti ile terminal desoxynucleotidyl
transferase-mediated dUTP nick and labelling (TUNEL) yöntemine göre boyandı
(Apoptacs, R&D systems). Deparafinize ve rehidre edilen kesitler 20 dakika
cytonin (D&R systems) ile muamele edildi. Deionize su ile 2 kez yıkandıktan sonra %3’lük hidrojen
peroksitte 5 dakika tutularak endojen peroksidaz aktivitesi ortadan kaldırıldı.
PBS ile yıkanan kesitler TdT işaretleme buffer’da 5 dakika tutuldu. Daha sonra
Skorlama ve
istatistik için, bütün kesitler 40’lık objektifte incelendi. TUNEL boyamalarda
her histolojik kesitte gelişi güzel belirlenen 10 sahada toplam 1000 hücre
sayıldı. Boyanan her çekirdek, boyanmanın yoğunluğu dikkate alınmaksızın
pozitif kabul edildi. One-way ANOVA ve Duncan testi istatiksel farklılıkların
belirlenmesinde kullanıldı. P<0.01 istatiksel olarak önemli kabul edildi.
Makroskobik
ve Mikroskobik Bulgular: Bursa Fabricius dışındaki organlarda makroskobik
lezyon gözlenmedi. Temel bulgu bF ağırlıklarındaki hafif artıştı. Ortalama bF
ağırlıkları doğal enfekte hayvanlarda 3.1 gr., D-78 inokule grupta 2.9 gr. ve
kontrol grubunda 2.8 gr. olarak saptandı. Çalışmada kullanılan civcivlerin
ortalama canlı ağırlıkları, doğal enfeksiyonlarda 417,14 gr., D-78 inokule
edilen grupta 430,6 gr., kontrol grubunda ise 428,19 du. Mikroskobik olarak
patolojik bulgu bF'un medulla bölgesinde bulunan lenfositlerde multifokal
nekrotik değişiklikler ve dejenerasyondu. İntersitisyel dokuda heterofil
infiltrasyonu ve ödemle karakterize akut yangı gözlendi. Bazı lenfoid
folliküllerin medullasında kistik boşluklar dikkati çekti.
İmmunohistokimyasal
Bulgular: İBHV antijeni lenfoid folliküllerin korteks ve medullasında bulunan
lenfositlerde tespit edildi. Çok sayıda pozitif hücre gözlendi (Şekil 1). Bu
bulgulara ek olarak intersitisyumda bulunan makrofajlarda da antijen saptandı.
Buna karşılık D-78 inokule edilen grupta çok az sayıda ve hafif boyanan pozitif
hücre gözlendi. Diğer organlarda ve kontrol grubunda antijen gözlenemedi.
Şekil 1.
BF’daki lenf follikülünde İBHV’u pozitif hücreler (oklar). Avidin-biotin
peroksidaz, Mayer’in hematoksileni karşıt boyama, X 120.
TUNEL
metodu: Kontrol grubu ve D-78 inokule edilen grupta çok az sayıda apoptotik
hücre lenfoid follikülerin kortikomedullar sınırında gözlendi (Şekil 2). Buna
karşılık, doğal olarak enfekte grupta çok sayıda apoptotik hücre hem kortekste
hem de medullada dikkati çekti (Şekil 3). Gruplardaki ortalama apoptotik hücre
sayıları tablo 1 de özetlenmiştir.
Şekil 2.
D-78 inokule edilen grup. BF lenf follikülünün kortiko (C) medullar (M-kalın
ok) sınırında apoptotik hücreler (ince oklar). TUNEL boyama, methy green karşıt
boyama, X 260.
Şekil 3.
Doğal enfeksiyon. BF lenf follikülünde yaygın apoptotik hücreler (oklar). TUNEL
boyama, methy green karşıt boyama, X 80.
|
N |
Ortalama |
Standart sapma |
Minimum |
Maksimum |
IBDV |
30 |
51,7667 |
1,3794 |
41,00 |
71,00 |
D-78 |
30 |
36,3667 |
,6669 |
28,00 |
44,00 |
KONTROL |
30 |
34,6333 |
,7119 |
27,00 |
43,00 |
Tablo 1.
Gruplarda gözlenen ortalama apoptotik hücre sayıları.
İstatiksel
analizler: İstatistiksel sonuçlar grafik 1 de gösterilmiştir. BF
ağırlıklarının istatistiksel incelenmesinde gruplar arasında önemli fark yoktu
(P>0.5). Aynı zamanda, kontrol grubu ve D-78 inokule grup arasında da
apoptotik indekslerde önemli farklılık saptanamadı (P>0.5). Buna karşılık
doğal enfekte hayvanlar ile diğer gruplar arasında apoptotik indekslerde
istatistiksel olarak önemli fark gözlendi (P<0.01).
Grafik
1. Apoptotik hücrelerin dağılımı
İBHV enfeksiyonları, bF lenfoid hücrelerin şiddetli azalması ve yüksek
ölümle karakterizedir (6,8). İBH’nın histopatolojik tanısı, diğer
enfeksiyonların ve enfeksiyöz olmayan hastalıkların bursal atrofiye neden
olabileceğinden dolayı her zaman geçerli olmamaktadır. Bundan dolayı, ayırıcı
tanıda viral etkenin immunohistokimyasal olarak ortaya konması gerekmektedir.
Deneysel çalışmalarda, İBHV antijenleri immunoperoksidaz tekniği ile bF'daki
lenfositlerde ve intersitisyumdaki makrofajlarda tespit edilmiştir (1,4,5,9).
Antijen lokalizasyonu bu çalışma ile doğal enfeksiyonlarda da ispatlanmıştır.
İBHV antijenleri dalak ve sekal tonsiller lenfositlerde de rapor edilmiştir
(9). Ancak çalışmada, bu organlarda antijen gözlenmemiştir. Bu durum olasılıkla İBHV saha enfeksiyonlarının
akut olmasından ve etkenin yüksek virulansından
kaynaklanmış olabilir. Aynı şekilde D-78 inokule edilen grupta ise etkenin
düşük virulansı nedeniyle bu organlara yerleşim göstermediği düşünülebilir. Bu
çalışmadaki gözlemlere göre, çalışmada kullanılan yöntem hızlı sonuç vermekte,
çok sayıda örnek hızla değerlendirilebilmekte ve diğer yöntemlere oranla daha
ucuz olduğu dikkati çekmektedir.
TUNEL metodunda, lenfositlerde pozitif reaksiyon gözlenmiştir. TUNEL
metodu apoptotik süreçte parçalanan DNA'yı tek hücre seviyesinde
gösterebilmektedir. Bursin 2 inokule edilen 21 günlük civcivlerde bursal
lenfoid folliküllerin hem kortekste hem de medullasında bulunan lenfositlerde
apoptosis rapor edilmiştir (10). Ancak mevcut çalışmada kontrol grubu ve D-78
inokule edilen grupta apoptotik lenfositler kortikomedullar sınırda
gözlenmiştir. Olasılıkla bunlar olgun B lenfositlere dönüşüm sırasında oluşan
apoptotik yapılardır. D-78 inokule edilen grup ile kontrol grubu arasında
apoptotik lenfosit sayılarında yakınlık gözlenmiştir. Bu durumun, aşı suşunun
düşük virulansından ve replikasyon gücünden kaynaklanmış olabileceği
düşünülmektedir. Bu bulgu hastalıkta lenfositlerde gözlenen apoptozisin,
virusun replikasyon süreci ile direkt ilişkili olduğunu bildiren diğer
raporları doğrular niteliktedir (2). Diğer yandan, immunoperoksidaz pozitif
saha olgularında lenfositlerde şiddetli TUNEL pozitif reaksiyon gözlenmiştir.
Apoptotik lenfositler hem kortekste hem de medullada saptanmıştır. Bu
lokalizasyon daha önce bildirilen raporlar ile uyumludur (10).
Sonuçta, replikasyon sürecine bağlı olarak IBHV’sunun bF lenfositlerinde
apoptozisi başlattığı ve hastalığın patogenezisinde apoptotik değişiklikler
ile yıkımlanan lenfositlerin önemli bir yer tuttuğu ortaya konmuştur.
KAYNAKLAR
1.
Cruz-Coy JS, Giambrone JJ, Hoerr FJ (1993). İmmunohistochemical detection of
infectious bursal disease virus in formalin-fixed, paraffin-embedded chicken
tissues using monoclonal antibody. Avian Dis. 37:577-581.
2. Inoue
M, Fujita A, Maeda K. (1999). Lysis of myelocytes in chickens infected with
infectious bursal disease virus. Vet. Pathol., 36:146-151.
3. Inoue
M; Fukuda M; Miyano K (1994). Thymic lesions in chicken infected with
infectious bursal disease virus. Avian Dis, 38:839-846.
4. Jonson
L, Engstrom B (1986). Immunocytochemical detection of infectious bursal
disease and infectious bronchitis viral antigens in fixed, paraffin embedded
chicken tsissues. Avian Pathol. 15:385-393.
5.
Kovacevic SA, Gagic M, Lazic S, Kovacevic M (1999). Immunohistochemical
detection of infectious bursal disease virus antigen in the bursa of fabricius
of experimentally infected chickens. Acta Veterinaria (Beograd), 49 : 13-20.
6. Lukert
PD, Saif YM (1997). Infectious bursal disease. 10th ed. Calnek BW, Barnes HJ,
Beard CW, McDougald LR, Saif MY Eds. In: Disease of Poultry. Iowa State
University Press, Ames, Iowa, pp. 721-738
7. Ojeda
F; Skardova I; Guarda MI; Ulloa J; Folch H (1997).Proliferation and apoptosis
in infection with infectious bursal disease
virus: a flow cytometric study. Avian Dis, 41:312-316.
8. Özkul İ
A (1980). Piliçlerin deneysel Gumboro hastalığında (İnfeksiyöz bursal hastalık) oluşan
bulguların histopatolojik ve elektronmikroskobik olarak incelenmesi. Doçentlik
tezi, Ankara.
9.
Tanimura N, Tsukamoto K, Nakamura, K, Narita M, Maeda M (1995). Association
between pathogenicity of infectious bursal disease virus and viral antigen
distribution detected by immunohistochemistry. Avian Dis. 39:9-20.
10.
Tanimura N; Sharma JM (1998). In-situ apoptosis in chickens infected with
infectious bursal disease virus. J. Comp. Pathol, 118:15-27.
11. Tham
KM; Moon CD (1996). Apoptosis in cell cultures induced by infectious bursal
disease virus following in vitro infection. Avian Dis, 40:109-113.
12.
Vasconcelos AC; Lam KM (1995). Apoptosis in chicken embryos induced by the
infectious bursal disease virus. J. Comp. Pathol, 112:327-338.
EKLER
A) Mali
Bilanço ve Açıklamaları:
Tüm
kalemler sarf malzemesi olmak üzere:
Apoptosis
tespit kiti 3 adet 3.227.445.000
Doku
kesitlerinin hazırlanması için (Formaldehit, parafin,
ksilol,lamilamel,aseton,hidrojen peroksit, methanol) 188.000.000
İmmunoperoksidaz
tekniği için (Anti-chicken IgG, normal keçi serumu, DAB, PBS tablet)
371.500.000
Isopropil
alkol 204.000.000
SPF civciv
87.600.000
Toplam:
4.078.545.000
B) Yayınlar:
Projeden
hazırlanan “Comparison of apoptotic changes in naturally and experimentally
infected chickens with Infectious Bursal Disease Virus” ve “İnfeksiyöz Bursal
Hastalığın immunoperoksidaz tekniği ile tanısı” başlıklı makaleler yayıma
hazırlanmaktadır.
T.C.
BİLİMSEL
ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN
RAPORU
İnfeksiyöz
bursal hastalığın immunoperoksidaz tekniği ile tanısı ve B lenfositlerde apoptozisin incelenmesi
Dr.Tolga
Güvenç
2000-08-10-021
5.12.2000
5.12.2002
12.2002
Ankara
Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara-2002