İnfeksiyöz bursal hastalığın immunoperoksidaz tekniği ile tanısı ve B lenfositlerde  apoptozisin incelenmesi

 

Özet: İnfeksiyöz bursal hastalığın saha olguları ile virusun aşı suşu D-78 ile deneysel  enfeksiyonunda in-situ apoptosis karşılaştırıldı. Çalışmada, 30 adet doğal enfekte 21 günlük civciv, 30 adet 21 günlük D-78 aşı şuşu ile inokule SPF civciv ve 30 adet enfekte olmayan kontrol grubu SPF civciv kullanıldı. Bursa Fabricius örneklerinde hastalığın histopatolojik lezyonları incelendi, immunoperoksidaz yöntemi ile antijen tespit edildi ve TUNEL metodu ile in-situ apoptosis değerlendirildi. One-way ANOVA ve Duncan testi tüm gruplarda istatistiksel farklılıkların değerlendirilmesi için kullanıldı. Makroskobik olarak başlıca bulgu bursa Fabricius ağırlıklarındaki hafif artıştı. Mikroskobik olarak temel patolojik değişiklik lenfositlerdeki dejeneratif ve multifokal nekrotik lezyonlardı. İmmuno-histokimyasal olarak antijen lenfoid folliküllerin korteks ve medullasında bulunan lenfositlerde saptandı. Buna karşılık D-78 inokule edilen grupta çok az sayıda pozitif hücre görüldü. Diğer organ ve kontrol grubunda antijene rastlanmadı. Ortalama apoptotik lenfosit sayıları infeksiyöz bursal hastalığın saha olgularında 51.76, D-78 inokule edilen grupta 36.36  ve kontrol grubunda 34.63 olarak saptandı. Saha olguları ile diğer grupların apoptotik indeksleri arasındaki farklılık istatiksel olarak önemli bulundu (P<0.01). Ancak kontrol grubu ile D-78 inokule edilen grup arasında apoptotik indekslerde istatiksel bir farklılık saptanamadı (P>0.5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Diagnosis of infectious bursal disease by immunoperoxidase technique and detection of apoptosis in the B lymphocytes.

Abstract: In situ-apoptosis was compared between the field cases of infectious bursal disease and experimentally infected with infectious bursal disease virus vaccine strain D-78.In this study, thirty naturally infected 21 day old chickens, thirty 21 days old SPF chickens inoculated with D-78 vaccine strain and thirty 21 days old uninfected control group SPF chicken were used. Bursa of Fabricius samples were examined for the evaluation of histopathological lesions, detection of the infectious bursal disease virus antigens by immunoperoxidase technique and observation of the in-situ apoptosis by TUNEL method. One-way ANOVA and Duncan test  were employed to determine statistical differences in all groups. Macroscopically, the basic finding was a slight increase in the weight of bursa of Fabricius. Microscopically, the main pathological alterations were degenerative and multifocal necrotic changes in the lymphocytes. Immunohistochemically, infectious bursal disease virus antigens were  detected lymphoid cells in the cortex and medulla of lymphoid follicles In contrast, a few positive cells were seen in D-78 inoculated group. Antigens were not found in the other organs and control  group. Mean number of apoptotic lymphocytes were 51.76, 36.36 and 34.63,  in field cases of infectious bursal disease, D-78 inoculated experimental group and the control group, respectively. The statistical analysis of apoptotic indices were found significant between the field cases of infectious bursal disease and the other groups (P<0.01). No statistical difference of apoptotic indices were detected between the D-78 inoculated vaccine group and  uninoculated control group (P>0.5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AMAÇ VE KAPSAM

 

İnfeksiyöz bursal hastalık (Gumboro, İBH) civciv ve piliçlerin ekonomik kayıplara yol açan, çok bulaşıcı akut viral bir hastalığıdır (6). Etken tüm dünyada yaygındır ve çift sarmallı RNA içeren Birnaviridae familyasından bir virustur (2,3,6). Hastalığın morbidite oranı %80’e, mortalite oranı ise %5 ve bazı olgularda %30’a ulaşabilir (6). Virusun bursa Fabricius’taki (bF) lenfoid folliküllerde yıkımlanmaya neden olduğu ve B lenfositlerin virusun hedef hücreleri olduğu iyi bilinmektedir (2,3,6,10). Son zamanlarda yapılan çalışmalarda bF dışında timus, dalak, sekal tonsiller ve kemik iliği gibi diğer lenfoid organlarda da viral antijenler tespit edilmiştir (2,3,6,9,10).

     Hastalığın inkubasyon süresi 2-3 gündür. Klinik olarak sulu beyaz renkte ishal, halsizlik ve piliçlerin birbirlerinin arka kısımlarını gagalama gözlenir (6,8). Hastalığın tipik makroskobik bulgusu bF’un atrofisidir. Akut dönemde bF hiperemi ve ödeme bağlı olarak büyürken, enfeksiyonu takip eden 5. günde atrofi şekillenmeye başlar ve 8. günde normal boyutunun 1/3’ne kadar küçülür (6). Mikroskobik olarak, virus bF, dalak, timus, sekal tonsiller gibi lenfoid organları etkiler. Bursa Fabricius’ta  lenfoid foliküllerin substansiya kortikalis ve medullaris bölgelerinde lenfositlerin ortadan kalktığı, interfolliküler bölgede ve tunika muskularis’te heterofil infiltrasyonlarının bulunduğu bildirilmiştir (6,8). Ancak bazı infeksiyöz bursal hastalık virus (İBHV) suşlarının bu karakteristik değişikliklere neden olmaması sonucunda tanının güçleştiği ve immunohistokimyasal yöntemlere de gereksinim duyulduğu kaydedilmiştir (4,5). Ayrıca, diğer enfeksiyonların ve enfeksiyöz olmayan ajanlarında bF’ta atrofiye neden olabileceği ve bu nedenle İBH histopatolojik bulgular ile tanısının konmasının her zaman gerçekçi olamayacağı, immunohistokimyasal yöntemlerin ayırıcı tanıda kullanışlı olacağını bildirilmiştir (9). Cruz-Coy ve ark. (1993) ise İBH’ta immunoperoksidaz tekniğinin, immunofloresans tekniğine göre daha duyarlı ve kullanışlı olduğunu saptamışlardır. 

       Apoptozis (programlanmış hücre ölümü), doğal koşullarda yaşlı ve yıpranmış hücrelerin yıkımlanarak organizmadan uzaklaştırılmasıdır ve  hücre DNA’sının 180-200 bazlık parçalara bölünmesi sonucu oluşmaktadır (11).  Fizyolojik olarak hücrenin kendini yıkımlaması yanında, insanlarda AIDS, infeksiyöz civciv anemisi, Newcastle hastalığı ve kedi lösemi virus enfeksiyonu gibi patolojik olgularda da şekillendiği kaydedilmiştir (7,12). Inoue ve ark. (1999) , İBHV’nun yüksek virulant HPS-2 suşu ve GBF-1 referans suşunun patolojik bulgularını ve kemik iliğinde myelositlerde oluşan apopotik değişiklikleri incelemiştir. HPS-2 suşu ile enfekte edilen 21 SPF civcivin 6 tanesinin öldüğünü, klinik belirtilerin belirgin olduğunu, bF’un histopatolojik incelemesinde lenfoid folliküllerin kortikal kısımlarında lenfositlerde şiddetli boşalma gözlendiğini kaydetmişlerdir. Diğer taraftan GBF-1 suşu ile enfekte grupta ölüm şekillenmediği, klinik belirtilerin ve bF’taki lenfoid follikülerde boşalmanın hafif olduğunu belirtmişlerdir. Kemik iliğinde ise myelositlerde HPS-2 suşunda %65 oranında apoptozis tespit edilirken, GBF-1 suşunda bu oran %18 olarak bulunmuştur. Vascocelos ve Lam (1995), virusun etkisini olgun B lenfositler üzerinde gösterdiğini, hastalıkta gözlenen immun baskılanmanın, virusun B lenfositler üzerindeki apoptotik etkisi sonucu bu hücrelerin ortadan kalkmasına bağlı olabileceğini vurgulamıştır. Bir diğer çalışmada, İBHV’nun klasik virulant suşu (IM-IBDV), antijenik variant E suşu (VE-IBDV) ve attenüe aşı suşu (B2-IBDV) ile yapılmış, patojen suşların aşı suşuna oranla bF’ta daha hızlı replike olarak apoptotik B lenfositlerin sayısında belirgin artışa neden oldukları kaydedilmiştir (10). Ancak araştırıcılar timustaki antijenin varlığını ortaya koyamamışlar ve bu organdaki apoptozisin bilinmeyen patolojik mekanizmalar özellikle de sitotoksik T lenfositlerin etkisi ile oluşabileceğini savunmuşlardır. Ayrıca civcivlerde doğal İBHV enfeksiyonunda, spesifik viral proteinler tarafından oluşturulan apoptozis ve yangısal olayların hala bilinmediğini vurgulamışlardır. B lenfositlerdeki apoptozisin hastalığın patogenezinde ve immun baskılanmada önemli rol oynadığı, virusun apoptozis için başlangıç faktörü olabileceği değişik araştırıcılar tarafından kaydedilmiştir (7,10-12).

     İmmunoperoksidaz tekniğinin bu çalışma kapsamında klinik ve histopatolojik olarak İBH tanısı konan doğal enfekte hayvanlarda denenmesi; B lenfositlerde apoptozisin, doğal enfeksiyonlarda, virüsün D-78 aşı suşu ile enfekte ve aşısız SPF civcivler ile karşılaştırılmalı olarak incelenmesi bu projenin amacını oluşturmaktadır.

 

MATERYAL VE YÖNTEM

 

      Araştırmanın materyalini 30 adet  21 günlük doğal enfekte, 30 adet 21 günlük İBHV D-78 suşu ile aşılı SPF ve 30 adet 21 günlük SPF civciv (kontrol grubu) olmak üzere toplam 90 adet civciv oluşturdu. Doğal enfekte civcivler Ankara ve yöresindeki broiler kümeslerinden temin edildi. SPF civcivler 30'ar hayvanlık 2 gruba ayrılarak, 1. Grup 17 günlük iken İBHV'nun D-78 (intervet) aşı suşu ile aşılandı, diğer grup kontrol olarak tutuldu. Bütün hayvanlara 21 günlük iken ötenazi uygulandı. Her üç grupta yer alan  hayvanların  sistematik nekropsileri yapılarak başta bF, sekal tonsiller, dalak ve timus olmak üzere tüm organlar incelendi. Bursa Fabricius’ların ağırlıkları, civciv ağırlıkları ile karşılaştırıldı. Alınan doku örnekleri %10’luk formaldehitte tespit edilerek, alkol ve ksilol serilerinden geçirildikten sonra, parafinde bloklandı ve mikrotom ile her bloktan 5-6 mikron kalınlığında  3 adet kesit alındı.

     Histopatolojik incelemede rutin hematoksilen eozin boyama yöntemi ile boyanan kesitler ışık mikroskobunda değerlendirildi.

     İmmunoperoksidaz boyamada 3 (triethoxysilyl) propylamine (APES) (Merck) ile hazırlanan adhesiv lamlara alınan kesitler, alkol ve ksilol serilerinden geçirildikten sonra metanol içerisinde hazırlanan %3 hidrojen peroksit solusyonu ile endojen peroksidaz aktivitesi ortadan kaldırıldı. Normal keçi serumu ile nonspesifik boyanma engellendi, poliklonal anti İBHV antiserumu (1/100 Manisa Tavuk Hastalıkları Araştırma ve Aşı Üretim Enstitüsü, Manisa) ile dokuda var olan antijen bağlandı, HRP ile işaretli anti-civciv IgG (1/1000 Sigma) ve DAB (Sigma) ile ortaya konan boyanmalar ışık mikroskopta değerlendirildi

      Apoptozisin ortaya konulması için doku kesitleri in-situ apoptosis tespit kiti ile terminal desoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labelling (TUNEL) yöntemine göre boyandı (Apoptacs, R&D systems). Deparafinize ve rehidre edilen kesitler 20 dakika cytonin (D&R systems) ile muamele edildi. Deionize su  ile 2 kez yıkandıktan sonra %3’lük hidrojen peroksitte 5 dakika tutularak endojen peroksidaz aktivitesi ortadan kaldırıldı. PBS ile yıkanan kesitler TdT işaretleme buffer’da 5 dakika tutuldu. Daha sonra 37°C de nem kamarası içerisinde TdT işaretleme karışımında 1 saat tutulan kesitler 2 kez PBS ile yıkandıktan sonra yine 37°C de 1 saat anti BrdU antikoru ile inkube edildi. PBS ile 3 kez yıkanan kesitler streptavidin-HRP solusyonunda 10 dakika bekletildi. Kromojen olarak DAB kullanıldı ve kesitler Mayer’in hematoksileni veya methyl green ile  boyandı.

Skorlama ve istatistik için, bütün kesitler 40’lık objektifte incelendi. TUNEL boyamalarda her histolojik kesitte gelişi güzel belirlenen 10 sahada toplam 1000 hücre sayıldı. Boyanan her çekirdek, boyanmanın yoğunluğu dikkate alınmaksızın pozitif kabul edildi. One-way ANOVA ve Duncan testi istatiksel farklılıkların belirlenmesinde kullanıldı. P<0.01 istatiksel olarak önemli kabul edildi.

 

 

 

ANALİZ VE BULGULAR

 

Makroskobik ve Mikroskobik Bulgular: Bursa Fabricius dışındaki organlarda makroskobik lezyon gözlenmedi. Temel bulgu bF ağırlıklarındaki hafif artıştı. Ortalama bF ağırlıkları doğal enfekte hayvanlarda 3.1 gr., D-78 inokule grupta 2.9 gr. ve kontrol grubunda 2.8 gr. olarak saptandı. Çalışmada kullanılan civcivlerin ortalama canlı ağırlıkları, doğal enfeksiyonlarda 417,14 gr., D-78 inokule edilen grupta 430,6 gr., kontrol grubunda ise 428,19 du. Mikroskobik olarak patolojik bulgu bF'un medulla bölgesinde bulunan lenfositlerde multifokal nekrotik değişiklikler ve dejenerasyondu. İntersitisyel dokuda heterofil infiltrasyonu ve ödemle karakterize akut yangı gözlendi. Bazı lenfoid folliküllerin medullasında kistik boşluklar dikkati çekti.

İmmunohistokimyasal Bulgular: İBHV antijeni lenfoid folliküllerin korteks ve medullasında bulunan lenfositlerde tespit edildi. Çok sayıda pozitif hücre gözlendi (Şekil 1). Bu bulgulara ek olarak intersitisyumda bulunan makrofajlarda da antijen saptandı. Buna karşılık D-78 inokule edilen grupta çok az sayıda ve hafif boyanan pozitif hücre gözlendi. Diğer organlarda ve kontrol grubunda antijen gözlenemedi.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 1. BF’daki lenf follikülünde İBHV’u pozitif hücreler (oklar). Avidin-biotin peroksidaz, Mayer’in hematoksileni karşıt boyama, X 120.

 

TUNEL metodu: Kontrol grubu ve D-78 inokule edilen grupta çok az sayıda apoptotik hücre lenfoid follikülerin kortikomedullar sınırında gözlendi (Şekil 2). Buna karşılık, doğal olarak enfekte grupta çok sayıda apoptotik hücre hem kortekste hem de medullada dikkati çekti (Şekil 3). Gruplardaki ortalama apoptotik hücre sayıları tablo 1 de özetlenmiştir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 2. D-78 inokule edilen grup. BF lenf follikülünün kortiko (C) medullar (M-kalın ok) sınırında apoptotik hücreler (ince oklar). TUNEL boyama, methy green karşıt boyama, X 260.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3. Doğal enfeksiyon. BF lenf follikülünde yaygın apoptotik hücreler (oklar). TUNEL boyama, methy green karşıt boyama, X 80.

 

 

 

 

 

 

N

Ortalama

Standart sapma

Minimum

Maksimum

IBDV

30

51,7667

1,3794

41,00

71,00

D-78

30

36,3667

,6669

28,00

44,00

KONTROL

30

34,6333

,7119

27,00

43,00

 

Tablo 1. Gruplarda gözlenen ortalama apoptotik hücre sayıları.

 

İstatiksel analizler: İstatistiksel sonuçlar grafik 1 de gösterilmiştir. BF ağırlıklarının istatistiksel incelenmesinde gruplar arasında önemli fark yoktu (P>0.5). Aynı zamanda, kontrol grubu ve D-78 inokule grup arasında da apoptotik indekslerde önemli farklılık saptanamadı (P>0.5). Buna karşılık doğal enfekte hayvanlar ile diğer gruplar arasında apoptotik indekslerde istatistiksel olarak önemli fark gözlendi (P<0.01).

 


Grafik 1. Apoptotik hücrelerin dağılımı

 

SONUÇ VE ÖNERİLER

İBHV enfeksiyonları, bF lenfoid hücrelerin şiddetli azalması ve yüksek ölümle karakterizedir (6,8). İBH’nın histopatolojik tanısı, diğer enfeksiyonların ve enfeksiyöz olmayan hastalıkların bursal atrofiye neden olabileceğinden dolayı her zaman geçerli olmamaktadır. Bundan dolayı, ayırıcı tanıda viral etkenin immunohistokimyasal olarak ortaya konması gerekmektedir. Deneysel çalışmalarda, İBHV antijenleri immunoperoksidaz tekniği ile bF'daki lenfositlerde ve intersitisyumdaki makrofajlarda tespit edilmiştir (1,4,5,9). Antijen lokalizasyonu bu çalışma ile doğal enfeksiyonlarda da ispatlanmıştır. İBHV antijenleri dalak ve sekal tonsiller lenfositlerde de rapor edilmiştir (9). Ancak çalışmada, bu organlarda antijen gözlenmemiştir.  Bu durum olasılıkla İBHV saha enfeksiyonlarının akut olmasından  ve etkenin yüksek virulansından kaynaklanmış olabilir. Aynı şekilde D-78 inokule edilen grupta ise etkenin düşük virulansı nedeniyle bu organlara yerleşim göstermediği düşünülebilir. Bu çalışmadaki gözlemlere göre, çalışmada kullanılan yöntem hızlı sonuç vermekte, çok sayıda örnek hızla değerlendirilebilmekte ve diğer yöntemlere oranla daha ucuz olduğu dikkati çekmektedir. 

TUNEL metodunda, lenfositlerde pozitif reaksiyon gözlenmiştir. TUNEL metodu apoptotik süreçte parçalanan DNA'yı tek hücre seviyesinde gösterebilmektedir. Bursin 2 inokule edilen 21 günlük civcivlerde bursal lenfoid folliküllerin hem kortekste hem de medullasında bulunan lenfositlerde apoptosis rapor edilmiştir (10). Ancak mevcut çalışmada kontrol grubu ve D-78 inokule edilen grupta apoptotik lenfositler kortikomedullar sınırda gözlenmiştir. Olasılıkla bunlar olgun B lenfositlere dönüşüm sırasında oluşan apoptotik yapılardır. D-78 inokule edilen grup ile kontrol grubu arasında apoptotik lenfosit sayılarında yakınlık gözlenmiştir. Bu durumun, aşı suşunun düşük virulansından ve replikasyon gücünden kaynaklanmış olabileceği düşünülmektedir. Bu bulgu hastalıkta lenfositlerde gözlenen apoptozisin, virusun replikasyon süreci ile direkt ilişkili olduğunu bildiren diğer raporları doğrular niteliktedir (2). Diğer yandan, immunoperoksidaz pozitif saha olgularında lenfositlerde şiddetli TUNEL pozitif reaksiyon gözlenmiştir. Apoptotik lenfositler hem kortekste hem de medullada saptanmıştır. Bu lokalizasyon daha önce bildirilen raporlar ile uyumludur (10).

Sonuçta, replikasyon sürecine bağlı olarak IBHV’sunun bF lenfositlerinde apoptozisi başlattığı ve hastalığın patogenezisinde apoptotik değişiklikler ile yıkımlanan lenfositlerin önemli bir yer tuttuğu ortaya konmuştur.

 

 

 

 

 

 

 

KAYNAKLAR

1. Cruz-Coy JS, Giambrone JJ, Hoerr FJ (1993). İmmunohistochemical detection of infectious bursal disease virus in formalin-fixed, paraffin-embedded chicken tissues using monoclonal antibody. Avian Dis. 37:577-581.

2. Inoue M, Fujita A, Maeda K. (1999). Lysis of myelocytes in chickens infected with infectious bursal disease virus. Vet. Pathol., 36:146-151.

3. Inoue M; Fukuda M; Miyano K (1994). Thymic lesions in chicken infected with infectious bursal disease virus. Avian Dis, 38:839-846.

4. Jonson L, Engstrom B (1986). Immunocytochemical detection of infectious bursal disease and infectious bronchitis viral antigens in fixed, paraffin embedded chicken tsissues. Avian Pathol. 15:385-393.

5. Kovacevic SA, Gagic M, Lazic S, Kovacevic M (1999). Immunohistochemical detection of infectious bursal disease virus antigen in the bursa of fabricius of experimentally infected chickens. Acta Veterinaria (Beograd), 49 : 13-20.

6. Lukert PD, Saif YM (1997). Infectious bursal disease. 10th ed. Calnek BW, Barnes HJ, Beard CW, McDougald LR, Saif MY Eds. In: Disease of Poultry. Iowa State University Press, Ames, Iowa, pp. 721-738

7. Ojeda F; Skardova I; Guarda MI; Ulloa J; Folch H (1997).Proliferation and apoptosis in infection with infectious bursal disease  virus: a flow cytometric study. Avian Dis, 41:312-316.

8. Özkul İ A (1980). Piliçlerin deneysel Gumboro hastalığında  (İnfeksiyöz bursal hastalık) oluşan bulguların histopatolojik ve elektronmikroskobik olarak incelenmesi. Doçentlik tezi, Ankara.

9. Tanimura N, Tsukamoto K, Nakamura, K, Narita M, Maeda M (1995). Association between pathogenicity of infectious bursal disease virus and viral antigen distribution detected by immunohistochemistry. Avian Dis. 39:9-20.

10. Tanimura N; Sharma JM (1998). In-situ apoptosis in chickens infected with infectious bursal disease virus. J. Comp. Pathol, 118:15-27.

11. Tham KM; Moon CD (1996). Apoptosis in cell cultures induced by infectious bursal disease virus following in vitro infection. Avian  Dis, 40:109-113.

12. Vasconcelos AC; Lam KM (1995). Apoptosis in chicken embryos induced by the infectious bursal disease virus. J. Comp. Pathol, 112:327-338.

 

                       

EKLER

A) Mali Bilanço ve Açıklamaları:

Tüm kalemler sarf malzemesi olmak üzere:

Apoptosis tespit kiti 3 adet    3.227.445.000

Doku kesitlerinin hazırlanması için (Formaldehit, parafin, ksilol,lamilamel,aseton,hidrojen peroksit, methanol) 188.000.000

İmmunoperoksidaz tekniği için (Anti-chicken IgG, normal keçi serumu, DAB, PBS tablet) 371.500.000

Isopropil alkol 204.000.000

SPF civciv 87.600.000

Toplam: 4.078.545.000

B) Yayınlar:

Projeden hazırlanan “Comparison of apoptotic changes in naturally and experimentally infected chickens with Infectious Bursal Disease Virus” ve “İnfeksiyöz Bursal Hastalığın immunoperoksidaz tekniği ile tanısı” başlıklı makaleler yayıma hazırlanmaktadır.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

T.C.

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

 

 

BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

KESİN RAPORU

 

İnfeksiyöz bursal hastalığın immunoperoksidaz tekniği ile tanısı ve B lenfositlerde  apoptozisin incelenmesi

 

 

Dr.Tolga Güvenç

2000-08-10-021

5.12.2000

5.12.2002

12.2002

 

 

 

 

 

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri

Ankara-2002