LACTOCOCCUS LACTİS SUBSP. LACTİS MA83 SUŞUNDA FAJ ADSORBSİYON
İNHİBİSYON MEKANİZMASININ HÜCRE YÜZEY KARAKTERİSTİKLERİ İLE İLİŞKİSİ
ANKARA
ÜNİVERSİTESİ ARAŞTIRMA FONU
PROJE NO:
20010711042
Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK (Proje
Yürütücüsü)
Arş. Gör. Çağla TÜKEL
2001, ANKARA
İÇİNDEKİLER
ÖZET i
ABSTRACT ii
TEŞEKKÜR iii
ŞEKİLLER DİZİNİ iv
ÇİZELGELER DİZİNİ v
1. GİRİŞ 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ 3
2.1. Lactococcus Genus’ u ve
Bu Genus’ a Ait Türlerin Özellikleri 3
2.2. L. lactis Suşlarında Faj-Konakçı İnteraksiyonları 4
2.3. L. lactis Suşlarında Doğal Faj Dirençlilik Sistemleri 5
2.3.1.
Restriksiyon/modifikasyon sistemleri 7
2.3.2.
Faj DNA
enjeksiyonunun engellenmesi 8
2.3.3.
Abortif enfeksiyon 8
2.3.4.
Faj
adsorbsiyonunun engellenmesi 9
3. MATERYAL ve YÖNTEM 17
3.1. Materyal 17
3.1.1. Bakteriler ve fajlar 17
3.2. Yöntem 18
3.2.1. L.
lactis subsp. lactis hücrelerine
kimyasal uygulaması 18
3.2.2. Faj adsorbsiyon oranının saptanması 19
3.2.3. Tek aşama faj çoğalma testi 19
3.2.4. Faj titresinin belirlenmesi 20
3.2.5. Doğal suşlardan plazmidlerin giderilmesi ve
plazmidleri giderilmiş
mutantların seçimi 21
3.2.6. L.
lactis subsp. lactis’ de plazmid
içeriklerinin tanımlanması 22
3.2.6.1. Plazmid izolasyonu 22
3.2.6.2. Plazmidlerin
saflaştırılması 25
3.2.6.3. Agaroz jel elektroforezi 26
3.2.7.
L. lactis subsp. lactis’ de hücre duvarı izolasyonu ve
hücre duvarı
proteinlerinin sodyum dodesil
sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi
(SDS-PAGE) yöntemi ile tanımlanması 27
3.2.7.1.
Hücre duvarı izolasyonu 27
3.2.7.2.
Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi
(SDS-PAGE) 28
3.2.8.
Hücre duvarı karbonhidrat analizi 30
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 32
KAYNAKLAR 48
ÖZET
LACTOCOCCUS LACTİS SUBSP. LACTİS
MA83 SUŞUNDA FAJ ADSORBSİYON İNHİBİSYON MEKANİZMASININ HÜCRE YÜZEY
KARAKTERİSTİKLERİ İLE İLİŞKİSİ
Lactococcus
lactis subsp. lactis MA83 suşunda; fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarına karşı, 32.7 kb’lık laktoz plazmidi tarafından kodlanan, faj
adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemi saptandı. Faj
dirençlilik, 32.7 kb plazmid varlığında üretilen ekzopolisakkarit materyalin
faj almaç bölgeleri maskelemesi sureti ile meydana geldi. Lactococcus
lactis subsp. lactis MA83 suşunun
hücre duvarı ekstraktlarına, terminal N-asetilglukozamin, b-D-galaktozil, glukozil ve mannozil kalıntılarına
spesifik lektinlerin uygulanması ve yüksek performans sıvı kromatografisi
(HPLC) analizleri sonucu, fajların almaç bölgesini maskeleyen materyalin
galaktozdan oluştuğu saptandı. Sodyum
dodesil sülfat-oliakrialamid jel elektroforez (PAGE) analiz sonuçları, Lactococcus lactis subsp. lactis MA83 suşunda fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarına ait almaç bölgenin
hücre duvarı üzerinde bulunduğunu ve protein yapıda bir materyal tarafından
oluştuğunu gösterdi.
ANAHTAR
KELİMELER: Lactococcus lactis subsp. lactis, ekzopolisakkarit, faj adsorbsiyonunun engellenmesi, faj almaç bölge
ABSTRACT
RELATIONSHIP BETWEEN PHAGE ADSORPTION INHIBITION
MECHANISM AND CELL SURFACE
CHARACTERISTICS IN LACTOCOCCUS LACTIS
SUBSP. LACTIS MA83
Adsorption inhibition type resistance, encoded by the 32.7 kb lactose
plasmid, in Lactococcus lactis subsp.
lactis MA83 for phages fla2, fld5, flc7 ve f857, was determined. Phage resistance was occured by masking phage
receptor sites by exopolysaccharide material which produced in the precence of
32.7 kb plasmid. This exopolysaccharide
material was found to be formed by galactose by the end of terminal b-D-galactosyl, N-acetylglucoseamine, glucosyl and mannosyl residues
spesific lectins treatments and high performance liquid chromatography (HPLC)
analysis of cell wall extracts of Lactococcus
lactis subsp. lactis strain MA83.
Sodyum dodesil sulphate-polyacrilamide gel electrophoresis analyses showed that
the receptor site for fla2, fld5, flc7 ve f857 phages was on cell wall and
formed by a proteinaceous material in Lactococcus lactis subsp. lactis
MA83.
KEY WORDS: Lactococcus lactis subsp. lactis, exopolysaccharide inhibition of phage adsorption, phage receptor site
TEŞEKKÜR
Bu
araştırma Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.
Katkılarından dolayı tüm fon yönetimine ve proje değerlendirme grubu
personeline, araştırma biyomateryallerinin sağlanmasında yardımlarından
dolayı da Dr. A. Budde Niekiel’e
(Whisby/Germany) sonsuz teşekkürlerimizi sunarız.
Prof.
Dr. Mustafa AKÇELİK
Arş.
Gör. Çağla TÜKEL
Ankara
2001
1. GİRİŞ
Süt endüstrisinde, başta peynir olmak üzere bir çok fermente süt ürününün üretiminde starter kültür olarak kullanılan laktokok suşlarının faj enfeksiyonu sonucu inaktive edilmesi, halen bütün dünyada önemini koruyan ticari bir sorundur. Faj enfeksiyonu ile laktik asit üretimi yavaşlamakta, ürün miktarı ve kalitesi düşmektedir. Süt fermentasyonları; hammaddenin steril olmaması, sıvı doğasından dolayı fajların tüm ortama dağılmasına olanak tanıması ve aynı saf kültürlerin sürekli kullanımı gibi ana nedenlerle faj kontaminasyonuna oldukça duyarlıdır.
Laktik asit bakterileri içerisinde faj kontaminasyonlarından en yüksek düzeyde etkilenen starter suşlar, Lactococcus genus’u üyeleridir. Bu nedenle, faj dirençlilik sistemlerinin tanımlanması ve geliştirilmesi araştırmaları laktokok türleri üzerinde yoğunlaşmıştır. Moleküler biyoloji tekniklerinin gelişimine paralel olarak, bu bakterilerde yeni dirençlilik sistemlerinin tanımlanması ve daha önce tanımlanan sistemlerin detaylı analizlerle moleküler doğasının anlaşılması olanaklı hale gelmiştir. Faj dirençlilik sistemlerinin genetik determinantlarının ve biyokimyasal etki mekanizmasının analizi, faj dirençli suşların endüstriyel kullanımında güvenilirlik sağlamaktadır. Sadece genetik verileri esas alan endüstriyel starter suş geliştirme çalışmalarının önemli sakıncalar taşıdığı bilinmektedir. Zira etki mekanizması ve bu mekanizmanın faj ya da konakçı bakteriye bağlı değişimleri kimyasal yönden bilinmeyen dirençlilik sistemleri, farklı ürünlerde ve üretim koşullarında aynı etkinliği gösterememektedir. Biyokimyasal araştırmalar, faj dirençlilik sistemlerinin etkinliğinin; faj almaç bölgelerin, faj adsorbsiyon karakteristiklerinin, faj DNA restriksiyon/modifikasyon potansiyellerinin ve faj replikasyon karakteristiklerinin değişimine bağlı olarak sınırlandırıldığına işaret etmektedir.
L. lactis suşlarında tanımlanan faj dirençlilik sistemleri içerisinde, endüstriyel suşlarda kullanım açısından en büyük potansiyele sahip olan, faj adsorbsiyonunun engellenmesidir. Çünkü bu dirençlilik sisteminde fajın konakçı suş ile ilişkisine ilk aşamada olanak tanınmamakta ve böylece, diğer dirençlilik sistemleri için laktokok suşlarında tanımlanan faj modifikasyonuna bağlı duyarlılık, faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemi içeren suşlarda meydana gelmemektedir. Endüstriyel starter suşlarda sağladığı bu emsalsiz avantajlara rağmen, söz konusu faj dirençlilik sisteminin genetik ve biyokimyasal doğası oldukça karmaşıktır ve faj tipine bağlı etkinlik değişimi, diğer sistemlerden çok daha yüksek oranda gerçekleşmektedir.
Bu araştırmada; daha önce laktokok fajlarına karşı faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik özelliği içerdiği belirlenmiş olan Lactococcus lactis subsp. lactis MA83 suşunda, faj almaç bölgenin plazmid varlığında aktivite değişiminin belirlenmesi ve söz konusu bölgenin maskelenmesinde rol oynayan materyalin biyokimyasal tanısının yapılması, amaçlanmıştır.
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1. Lactococcus Genus’ u ve Bu Genus’ a Ait Türlerin
Özellikleri
Laktik asit bakterilerinin 15 cinsinden biri olan Lactococcus genus’ u; L.
lactis, L. gavriae, L. plantarum, L. piscium ve L. raffinolactis türlerini içermektedir. Gram pozitif
kemoorganotrofik, spor ve kapsül oluşturmayan bu bakteriler, hem bağımlı
katalaz sistemi içermemektedir. Flavoprotein peroksidaz enzimlerinin sınırlı
oksijen redüksiyonundan dolayı, moleküler oksijeni tolere etme
yeteneğindedirler. Homofermentatif özelliktedirler ve karbonhidrat
katabolizması sonucu ana ürün olarak L(+) laktik asit oluştururlar.
Hareketsizdirler ve hemolitik reaksiyon göstermemektedirler. Yalnız bazı L. lactis subsp. lactis suşları zayıf a
hemoliz yeteneğinde bulunmuştur. N grup antisera ile aglutine olmayan nadir
suşlar hariç, tümü N grup antijen içermektedir. 10 0C inkübasyon
sıcaklığında gelişme gösterirken, 45 0C
de gelişememe özellikleri, bu genus’ u hem streptokoklardan hem de
enterokoklardan ayırmaktadır. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 0C’
dir. Siferik hücreler ortalama 0.5-1.2 x 0.5-1.5 mm boyutlarındadır ve hücre çiftlerinin temas yönünde
uzaması, bu bakterilerin morfolojik tanıda laktobasillerle karıştırılmasına yol
açmaktadır (Schleifer 1987, Holt 1994,
Boumerdassi 1997).
Laktokoklar
içerisinde süt endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan suşlar, L. lactis alt türleridir. L. lactis türü, iki alt tür ve bir
biyovaryete içermektedir. Bunlar; L.
lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris ve L. lactis
subsp. lactis biovar. diacetylactis’ dir. L. lactis subsp. lactis
suşları, arjinin hidrolizi sonucu amonyak oluşturma ve 40
2.2. L. lactis Suşlarında
Faj-Konakçı İnteraksiyonları
L. lactis suşları ile fajları arasında;
litik, lizogenik ve pseudolizogenik yaşam döngüleri olarak tanımlanan, 3 ana interaksiyon tipi saptanmıştır. Litik
döngü genel hatları ile, fajın hücre yüzeyinde yer alan özel almaç bölgelere
geri dönüşsüz bir şekilde adsorbsiyonu, faj DNA’ inin hücre yüzey proteinleri
ve kasılabilir kuyruk kılıfı ile faj lisinleri gibi faj elemanlarının yardımı
sonucu hücre içine enjeksiyonu, konakçı hücre replikasyonunun durdurulması ve
bu sistemin faj replikasyonu için yönlendirilmesi, faj RNA ve proteinlerinin
sentezi, baş, kuyruk, ve kuyruk fibrilleri gibi yapıların montesi ile olgun faj
partiküllerinin oluşturulması ve salınma aşamalarını içermektedir (Sanders
1988). Dinamik denge halindeki faj-bakteri süspansiyonlarında adsorbsiyon, 12
dk içerisinde tamamlanmaktadır. Faj DNA enjeksiyonu ise, adsorbsiyonun
tamamlanmasından hemen sonra gerçekleşmektedir. Faj DNA enjeksiyonundan,
çoğalan faj partiküllerinin konakçıdan salınmasına kadar geçen süre olarak
tanımlanan latent dönem 20-60 dk, populasyonda bulunan bazı bireylerde faj
salınmasının gecikmesi ile karakterize edilen artış dönemi ise 10-30 dk,
arasında değişmektedir. Konakçı suşlarda litik bir döngünün tamamlanması için
ortalama süre, 50-70 dk arasındadır (Klaenhammer 1984, Sanders 1988, Hill 1993,
Dinsmore and Klaenhammer 1995, Garvey et
al. 1996). Olgun faj partiküllerinin bakteriyi parçalayarak ortama
salınması, bakteri içerisinde üretilen faj partiküllerinin oluşturduğu osmotik
basınç ve faj lisinlerinin etkisi ile sağlanmaktadır. Bir fajın enfeksiyonu
sonucu bir bakteride üretilen ve bakterinin parçalanması ile ortama salınan
enfeksiyöz virüs partikülü sayısını ifade eden faj patlama büyüklüğü ise; 9–105
adet arasında değişebilmektedir (Shaerman et
al. 1989, Klaenhammer and Dinsmore
1997).
Lizogeni,
adsorbsiyon ve faj DNA enjeksiyonundan sonraki faj enfeksiyon aşamalarının kesintiye
uğratılarak, hücre içine giren faj DNA’ inin konakçı genomuna bağlanması ile
karakterize edilmektedir. L. lactis
suşlarında faj-konakçı dinamik dengesi ile doğrudan ilişkili olan bu durumun
hangi fizyolojik ve biyokimyasal süreçlerde gerçekleştiği bilinmemektedir.
Bakteri genomunda profaj halinde bulunan faj DNA’ i, kromozomal DNA ile
birlikte replike edilerek yeni kuşaklarda da sürekliliğini korumaktadır.
Temperent fajlar, kendiliğinden ya da mitomisin C veya ultraviyole ışınları
uygulaması gibi deneysel koşullarda litik döngüye geçebilmektedir (McKay and
Baldwin 1973, Reyrolle et al. 1982,
Dinsmore and Klaenhammer 1995).
Pseudolizogeni; hücre içine enjekte edilen faj
DNA’ inin replikasyonunun bloke edilmesi, ancak konakçı genomuna
entegrasyonunun gerçekleşememesinden dolayı, faj DNA’ inin stoplazmada plazmid
davranışı göstermesi sonucu oluşmaktadır. Laktokoklarda, pseudolizogen suşların
yeni faj enfeksiyonlarına karşı dirençli hale geldikleri saptanmıştır. Gram
negatif bakterilerde faj almaç bölgelerin kromozomal mutasyonlarla
indirgenmesinin, faj almaç bölgelerin bozulmasının ve temperent fajların litik
mutantlarının bu direnç oluşumunda rol aldığı bilinmekte, ancak L. lactis suşlarında söz konusu
mekanizmanın etkinliğine ait bir çalışma bulunmamaktadır (de Vos 1989).
2.3. L. lactis Suşlarında
Doğal Faj Dirençlilik Sistemleri
L. lactis’ de faj dirençlilik sistemlerinin
fenotipik, genetik ve biyokimyasal karakterizasyonu, bu bakterilerin daha
detaylı bir şekilde anlaşılmasına ve süt fermentasyonları için starter kültür
özelliklerinin geliştirilmesine olanak tanımıştır. Faj dirençli endüstriyel suş
seçimi çalışmalarında temel yaklaşım, fermentasyon ortamlarında fajlar ile
sürekli temas halinde olan L. lactis
suşlarındaki doğal dirençlilik mekanizmalarının tanımlanması ve kullanım
alanlarının araştırılmasıdır. Halen tartışma konusu olan bir diğer yaklaşım
ise, modern genetik tekniklerin kullanımı ile bu sistemlerin genetik
determinantlarının duyarlı starter suşlara aktarımı ve ifadesi çalışmalarını esas
almaktadır (de Vos et al. 1984,
Klaenhammer 1984, Teuber 1990).
L. lactis suşlarında bugüne kadar saptanan
doğal faj dirençlilik sistemleri, etki tipine göre dört ana grupta toplanmıştır. Bunlar; faj adsorbsiyonunun engellenmesi, faj DNA
Faj enfeksiyon Faj
Dirençlilik Sistemi
Aşamaları
Adsorbsiyonun engellenmesi
Adsorbsiyon
Faj
DNA enjeksiyonunun engellenmesi
Faj DNA enjeksiyonu
Restriksiyon
ve modifikasyon
Faj DNA replikasyonu
Faj RNA ve protein
Sentezi
Abortif
Enfeksiyon
Faj montesi
Salınma
Şekil 2.1. L.
lactis suşlarında doğal faj dirençlilik sistemleri ve bunların faj
enfeksiyon
sürecindeki etki basamakları
(Dinsmore and Klaenhammer 1995).
Enjeksiyonunun
engellenmesi, restriksiyon/modifikasyon sistemleri ve abortif faj enfeksiyon
mekanizmaları olarak tanımlanmaktadır (Hill 1993). Bu sistemler üzerinde
yürütülen yoğun araştırmalar, şüphesiz ki yeni grupların ilavesine yol
açacaktır. L. lactis suşlarında doğal
faj dirençlilik sistemlerinin faj enfeksiyon sürecinde etkinlik gösterdiği
aşamalar, şekil 2.1’de şematize edilmiştir.
2.3.1. Restriksiyon/modifikasyon sistemleri
Restriksiyon/modifikasyon tipte faj dirençlilik sistemleri, tüm laktik asit bakterilerinde yaygın olarak bulunmaktadır. Sistemin restriksiyon enzim komponenti, modifiye olmamış DNA sekanslarını özel bölgelerden tanıma ve kesme aktivitesi göstermektedir. Bu şekilde, hücreye giren modifiye olmamış faj DNA parçalanarak faj çoğalması engellenmektedir. Konakçı DNA’ inin kendi restriksiyon enzim aktivitesinden korunması ise, bu sistemin ikinci komponenti olan modifikasyon aktivitesi ile sağlanmaktadır. Modifikasyon aktivitesinden sorumlu enzimler, restriksiyon kesim bölgelerini metilleyen özel metilazlardır (Dinsmore and Klaenhammer 1995). Restriksiyon/modifikasyon sistemleri, faj DNA enjeksiyonu gerçekleşir gerçekleşmez aktive olduğu için, hücrenin faj enfeksiyonundan zarar görmesine olanak tanınmadan faj DNA parçalanmaktadır. Bu avantajına rağmen, konakçı restriksiyon sistemlerinden kaçan fajların modifikasyon sistemleri tarafından konakçı hücre genomu gibi algılanmak suretiyle modifiye edilmeleri, sistemin etkinliğini düşürmektedir (Hill 1993, Daly et al. 1996).
Restriksiyon/modifikasyon sistemlerinin genetik determinantları üzerinde yürütülen araştırmalarda, L. lactis suşlarında bu özelliğin genellikle plazmidler tarafından kodlandığı saptanmıştır (Fitzgerald et al. 1982, Chopin et al. 1984, Sanders 1988, Hill 1993, Twomey et al. 1997, Akçelik 1999). Değişik L. lactis suşlarında tanımlanan LlaI ve LlBI sistemleri, gen kodu plazmidler üzerinde bulunan restriksiyon/modifikasyon sistemlerinin tipik örneklerini teşkil etmektedir (Mayo et al. 1991, O’Sullivan and Klaenhammer 1995, Twomey et al. 1997). L. lactis suşlarında gen kodu kromozomal DNA üzerinde bulunan tek restriksiyon / modifikasyon sistemi, L. lactis subsp. cremoris UC503 suşunda tanımlanan ScrFI sistemidir. Ancak sistemin içerdiği iki modifikasyon enzimine ait genler, bazı suşlarda ve rekombinantlarda plazmidler üzerinde saptanmıştır. Bu suşlarda, söz konusu plazmidler üzerindeki metilaz genlerinin dizi analizleri ve DNA homolojileri; bu genlerin de kromozomal DNA kökenli fragmentlerin transpozisyonu ile plazmidlere taşındığını göstermiştir (Hill 1993, Dinsmore and Klaenhammer 1995, Su et al. 1998).
2.3.2. Faj DNA
enjeksiyonunun engellenmesi
Faj DNA enjeksiyonunun engellenmesi tipte faj dirençlilik sisteminin laktik asit bakterilerinde bulunduğuna dair ilk veriler, Lactobacillus casei YIT 9002 suşunda, PL-1 fajı ile yürütülen çalışmalardan elde edilmiştir (Watanabe et al. 1984). L. lactis suşlarında bu faj dirençlilik sisteminin varlığı ve genetik determinantları üzerinde toplam üç makale bulunmaktadır. Garvey et al. (1996), c2 fajına karşı yüksek düzeyde duyarlılık gösteren L. lactis subsp. lactis MG1614 suşuna, pNP40 plazmidinin aktarımı sonucu oluşturdukları transformantlarda, söz konusu faj DNA’ inin hücre içine enjeksiyonunun engellendiğini saptamıştır. Yine c2 fajı ile yürütülen bir diğer araştırmada, L. lactis subsp. lactis LM2301 suşunda faj DNA enjeksiyonunun kromozomal DNA kökenli genlerin aktivitesi sonucu engellendiği belirlenmiştir (Garbutt et al. 1997). Son olarak, Akçelik (1998) L. lactis subsp. lactis MPL18 suşunda la2 fajına karşı dirençliliğin, faj DNA enjeksiyonunun bloke edilmesi suretiyle etki gösterdiğini ve kromozomal DNA kökenli bir özellik olduğunu tanımlamıştır.
L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonundan sonra, faj DNA’ inin hücre içine translokasyonunu yöneten proteinlerin varlığı saptanmıştır (Monteville et al. 1994). Ancak yukarıda özetlenen her üç araştırmada da, bu proteinlerin inaktivasyonuna dair biyokimyasal deliller sunulmamıştır.
2.3.3. Abortif enfeksiyon
Abortif
enfeksiyon (Abi), restriksiyon/modifikasyon aktiviteleri dışında kalan ve hücre
içinde faj çoğalmasını engelleyen mekanizmaların tümünü kapsamaktadır. L. lactis suşlarında tipik olarak
plazmidler tarafından kodlanan bu faj dirençlilik sisteminin, nadir kromozomal
DNA kökenli örnekleri de saptanmıştır (Dinsmore and Klaenhammer 1995,
Klaenhammer and Dinsmore 1995,
Klaenhammer and Dinsmore 1997). L.
lactis suşlarında tanımlanan abortif enfeksiyon sistemleri; etki
mekanizması ve dirençliliğin moleküler doğası esas alınarak, AbiA, AbiB, Abi C,
Abi D, Abi D1, Abi E, Abi F, Abi G, Abi H, Abi K ve Abi L olmak üzere, 11 alt
gruba ayrılmıştır (Moineau et al. 1997).
Abi A;
2.3.4. Faj adsorbsiyonunun
engellenmesi
Fajlara karşı hücresel direncin ilk aşaması, hücre yüzeyinde faj adsorbsiyonunun (tutunma) engellenmesidir. Hücre duvarı ya da stoplazma membranı üzerinde lokalize olan faj almaç bölgelerine (faj reseptörleri) ait kimyasal bileşenlerin birinin eksikliği ya da monomerlerinin hatalı polimerizasyonu yanında, bu almaç bölge materyalini maskeleyecek bir başka kimyasalın hücre tarafından üretimi de söz konusu bölgelerin inaktivasyonuna yol açabilmektedir (Hill 1993). L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonunun engellenmesi üzerine yürütülen çalışmalar; kromozomal genlere ve plazmidlere bağlı mutant geliştirme ve seçme olmak üzere, iki temel stratejiyi esas almaktadır. Her iki genetik yaklaşım sonucunda da, bu dirençlilik sisteminin biyokimyasal esası üzerindeki bilgi, mutantların hücre yüzey karakteristiklerinde meydana gelen değişimlerin tanımlanması ile sağlanmaktadır (Dinsmore and Klaenhammer 1995).
L. lactis suşlarında faj adsorbsiyon karakteristiklerinin belirlenmesine ilişkin ilk araştırmalar Oram and Reiter (1968) tarafından yürütülmüştür. Araştırıcılar, L. lactis subsp. lactis ML3 suşunda ml3 fajına ait almaç bölgenin stoplazma membranı üzerinde lokalize olduğunu ve faj adsorbsiyonunda hücre duvarının rol oynamadığını belirlemiştir. Daha sonra ml3 fajının test edildiği diğer laktokok suşlarında da faj adsorbsiyonunun, stoplazma membranı üzerindeki özel almaç bölgelerde meydana geldiği saptanmıştır. Ancak ml3 fajı yanında denemeye alınan 5 farklı laktokok fajının ise, ml3 fajına karşı test edilen tüm laktokok suşlarına hücre duvarında yer alan almaç bölgelerden tutunduğu tespit edilmiştir. L. lactis subsp. lactis ML3 suşu membran yapılarının biyokimyasal analizi sonucu, ml3 fajına ait almaç bölgenin lipoprotein yapıda olduğu tanımlanmıştır (Oram 1971).
Günümüzde, adsorbsiyonun engellenmesi tipte dirençlilik özelliğine sahip mutantlar, fermente süt endüstrisinde önemli bir yer tutan peynir üretiminde starter kültürler olarak kullanılmaktadır (King et al. 1983, Vlegels et al. 1988). Bu mutantlar ve diğer laboratuvar suşları üzerinde yürütülen genetik ve biyokimyasal esaslı araştırmalar sonucu, laktokok hücrelerindeki faj almaç bölgelerin doğası hakkında önemli ip uçları elde edilmiştir.
Değişik araştırıcılar, laktokok suşlarında faj almaç bölgelerin adsorbsiyon spesifitelerinin, genellikle bu suşların hücre duvarında lokalize olan karbonhidratlar tarafından determine edildiğini belirlemiştir (Sijtsma et al. 1988, Sijtsma et al. 1990a, Valyasevi et al. 1990, Schaffer et al. 1991, Valyasevi et al. 1994). Valyasevi et al. (1990) tarafından L. lactis subsp. cremoris KH suşunda yürütülen araştırmada; bu suşun hücre duvarında spesifik almaç bölgeleri bulunan ve yüksek oranda adsorbsiyon yeteneği gösteren 5 laktokok fajının, hücre duvarındaki galaktozun azalışına bağlı olarak, KH suşuna karşı adsorbsiyon ilgilerini hızlı bir şekilde yitirdikleri, saptanmıştır. Galaktozun hücre duvarından tamamen elimine edilmesi halinde ise, hiç faj tutunması meydana gelmemiştir. Schaffer et al. (1991), L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis F7/2 ve L. lactis subsp. lactisWg2-1 suşlarının hücre duvarlarına metaperiodat ve asit hidrolizi uygulamaları sonucu, suşların faj adsorbsiyon ilgilerinde meydana gelen değişimleri esas alarak, bu suşlarda da faj almaç bölgelerin karbonhidrat polimerleri olduğunu ileri sürmüştür. Ancak, araştırmada faj almaç bölge tanısına yönelik detaylı kimyasal analizler yapılmamıştır.
Gopal and Crow (1993) L. lactis subsp. cremoris E8 suşu ve bu suşun kromozomal DNA mutasyonları sonucu
oluşturulmuş mutantı
Faj almaç bölgelerde lökalize olan karbonhidratlar, belirli fajların adsorbsiyonunu teşvik ederken, bazılarının adsorbsiyonunu ise engelleyebilmektedir. Bu şekilde aynı almaç bölgeye sahip fajlar arasında, L. lactis suşlarının homolog fajları lehine adsorbsiyon koşulları oluşmaktadır. L. lactis subsp. lactis C2 suşu ile yürütülen, homolog faj c1 ve diğer laktokok fajları ml3, kh, 1, h, 5 ve 13’ün kullanıldığı çalışmalarda; bu suşun hücre duvarında, tüm fajlar için tek bir almaç bölgenin bulunduğu saptanmıştır. Almaç bölgenin detaylı kimyasal analizi sonucu ramnoz içerdiği ve tüm fajların karışımına maruz bırakılan hücrelerde homolog faj c1’ in adsorbsiyonu teşvik edilirken, diğer fajların adsorbsiyonunun baskılandığı belirlenmiştir. Yine aynı araştırmada, sk1 fajının, C2 suşu hücre duvarında yer alan ancak diğer fajlardan farklı olan almaç bölgesinin, glukoz ve ramnoz polimeri olduğu saptanmıştır (Valyasevi et al. 1994).
L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemlerinin plazmidler tarafından kodlandığına dair ilk bulgular Sanders and Klaenhammer (1983) tarafından yayınlanmıştır. Bu araştırmada, L. lactis subsp. lactis ME2 suşunda, Ø18 fajının adsorbsiyonunun pME0030 olarak adlandırılan 31 MDa büyüklükteki bir plazmidin varlığında engellendiği saptanmıştır. pME0030 plazmidinin giderildiği L. lactis subsp. lactis ME2 mutantlarında Ø18 fajı adsorbsiyonu % 98 gibi yüksek bir orana ulaşmıştır. Ancak araştırma kapsamında plazmid kodlu dirençlilik sisteminin biyokimyasal doğasına dair bir sonuç verilmemiştir. Benzer olarak de Vos et al. (1984) L. lactis subsp. cremoris SK110 suşunda tanımladıkları 54 kb büyüklükteki pSK11 plazmidinin sk11G fajı adsorbsiyonunu engelleyen mekanizmayı kodladığını belirlemiştir. Bu suşta faj dirençlilik sisteminin etki mekanizmasının analizine yönelik çalışmalar sonucu (Sijtsma et al. 1988, Sijtsma et al. 1990a, Sijtsma et al. 1990b); pSK11 plazmidini içeren doğal suş L. lactis subsp. cremoris SK110 ile, bu suşun pSK11 plazmidini içermeyen ve sk11G fajına duyarlı mutantı SK112’ nin hücre yüzey karakteristiklerinin farklı olduğu kanıtlanmıştır. İlk belirlenen farklılıklar; SK112 mutantında hücre yüzeyinin, SK110 suşuna göre daha yüksek oranda negatif yük içermesi ve daha yüksek düzeyde hidrofobisiteye sahip olması şeklinde tanımlanmıştır. Araştırmalarda, hücre yüzeyi karbonhidrat kompozisyonu; lektinlerin spesifik şekerlere ilgisi esas alınarak belirlenmiştir. Adsorbsiyonun engellenmesi tipte faj dirençlilik özelliğine sahip doğal suş SK110, terminal b-D-galaktozil kalıntılarına spesifik lektinlerin muamelesi sonucu aglutine olmuş, ancak terminal glukozil kalıntılarına spesifik lektinlerle muamele edildiğinde reaksiyon vermemiştir. Bu suşun faj duyarlı mutantı SK112 ise; atasal suş SK110’ un aksine, terminal b-D-galaktozil kalıntılarına spesifik lektinlerle reaksiyon vermezken, terminal glukozil kalıntılarına spesifik lektinlerle muamelesi sonucu aglutine olmuştur. Atasal suş ve mutant suşa ait hücre duvarı bileşimi karşılaştırıldığında; SK110 suşunun, SK112’ ye oranla çok yüksek miktarda galaktoz içerdiği belirlenmiştir. Atasal suşta, alkali muamelesi sonucu faj duyarlılığın meydana gelmesi ise; söz konusu suşta faj almaç bölgenin bozulmadığının, ancak bu bölgeyi maskeleyen ve galaktozil içeren materyalin ortadan kalktığının işareti olarak kabul edilmiştir. Her iki suşta da lipotaykon asidinin (LTA) analiz sonuçları karşılaştırıldığında; tek farklılığın atasal suşa ait lipotaykon asidindeki galaktoz olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar, bu bulgulardan hareketle, SK110 suşunda lipotaykon asidinin faj adsorbsiyonundan sorumlu yapı olduğunu ileri sürmüştür.
Dunny et al. (1988) L. lactis subsp. lactis LM2301 suşunda faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sisteminin gen kodunu içeren 90 kb büyüklükteki plazmid ile, bu suşun hücre duvarında yer alan antijenik özellikteki proteinlerin ilişkisini araştırdıkları çalışmada; söz konusu plazmidin varlığında, faj almaç bölgede lokalize olan 16 ve 20 kDa’ luk iki proteinin üretildiği ve 22 kDa’luk bir başka proteinin ise üretiminin engellendiği saptanmıştır. Araştırıcılar, 16 ve 20 kDa’ luk proteinlerin faj almaç bölgeyi maskeleyerek inaktive ettiğini, 22 kDa’ luk proteinin ise faj tutunması için aktif merkez görevi gördüğünü ileri sürmüştür. Bu araştırmada; Oram (1971) tarafından bildirilen bulgulardan sonra, L. lactis suşlarında faj almaç bölgelerin protein doğasına dikkat çeken ilk araştırma olması bakımından da önem taşımaktadır. Laktokoklarda faj almaç bölgelerin protein yapıda materyaller tarafından maskelenmek suretiyle inaktive edildiklerine dair bir başka delil Akçelik and Tunail (1992) tarafından yürütülen araştırmada elde edilmiştir. Bu çalışmada Türkiye’ den izole edilen L. lactis subsp. lactis P25 suşunda, laktoz fermantasyon yeteneği ve 4 farklı faja karşı adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik sistemini kodlayan, 37.5 kb büyüklükte bir plazmid tanımlanmıştır. Fajlara dirençli konjugal verici atasal suş, 37.5 kb büyüklükteki p2520L plazmidini içeren transkonjugantlar ve fajlara duyarlı konjugal alıcı suşun immünoblotting ile kombine edilmiş poliakrilamid jel analizleri; faj dirençli suşların, faj duyarlı suşlardan yegane farkının, protein profillerinde saptanan 30 kDa’ luk protein bandı olduğunu göstermiştir. Bu bulgular ışığında araştırıcılar, 30 kDa’ luk proteinin faj almaç bölgeleri maskelemek suretiyle inaktive ettiğini ileri sürmüştür.
Harrington and Hill (1992), L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis DPC220 suşunda, ØD1 fajı ile enfeksiyon işleminden sonra oluşan spontan bir faj dirençli mutant (DPC 721) tanımlamış ve söz konusu mutantın atasal suşta bulunmayan 26.75 kb büyüklükte pHA90 plazmidini içerdiğini tesbit etmiştir. Restriksiyon endonukleaz enzim haritaları ve DNA hibridizasyon çalışmaları bu plazmidin, atasal suşta bulunan pHA82 (20.75 kb) ve pHA33 (6 kb) plazmidlerinin birleşmesi sonucu oluştuğunu göstermiştir. DNA sekans analizleri ile, pHA90 plazmidinin restriksiyon/modifikasyon ve faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte faj dirençlilik sistemlerinin gen kodunu taşıdığı belirlenmiştir. Araştırıcılar, bu plazmid üzerindeki faj dirençlilik genlerinin, ancak pHA33 plazmidi ile birleşme sonucu aktive olmasının; bir regülatör protein aracılığı ile meydana gelebileceğini ileri sürmüş, ancak bu öngörüyü destekleyen delilleri saptayamamıştır.
Lucey et al. (1992) L. lactis subsp. lactis UC503 suşunda izole ettikleri pCI528 plazmidinin (46 kb), hücre yüzeyinde değişim meydana getirmek suretiyle faj adsorbsiyon etkinliğini düşürme yönünde dirençlilik sağladığını belirlemiştir. pCI528 plazmidinin L. lactis subsp. lactis UC503 suşundan, faj duyarlı suş L. lactis subsp. lactis MG1363’ e aktarımı sonucu; prolat ve küçük izometrik fajlara karşı tam dirençlilik fenotipinin oluştuğu saptanmıştır. Bu dirençlilik sisteminin farklı fajların adsorbsiyonunu aynı şekilde engellemesi, pCI528 tarafından üretilen maskeleyici materyalin belirli bir faj almaç bölgesine özel olmadığına işaret etmiştir. Dirençli ve duyarlı suşlar ile sürdürülen çalışmalarda, pCI528 plazmidini içeren kolonilerin agarlı besiyerinde oldukça sıkı koloni morfolojisi oluşturduğu gözlenmiş ve bu suş kültürleri santrifüj işlemine tabi tutulduğunda yumuşak (kolay çözülebilir) bir hücre çökeltisi oluşmuştur. Elektron mikroskopik incelemeler sonucunda da, söz konusu hücrelerin yüzeyinde düzensiz bir dağılım gösteren, ekstraselüler bir materyalin varlığı tesbit edilmiştir. pCI528 plazmidini içermeyen ve faj duyarlı olan hücreler ise, pürüzsüz ve düzenli bir hücre yüzeyi karakteristiğine sahip bulunmuştur. pCI528 plazmidini içeren L. lactis subsp. lactis UC503 hücrelerinin deterjanlar, asitler ve proteazlarla muamelesi sonucunda, faj dirençlilik fenotipinde herhangi bir değişim meydana gelmemiştir. Ancak, bu hücrelerin alkali muamelesi ile faj adsorbsiyonunu engelleme özelliklerini yitirdiği saptanmıştır. Bu değişimin kimyasal doğasını belirlemek için, pCI528 plazmidini içeren atasal suşun alkali muamelesinden önce ve sonra izole edilen hücre duvarı örneklerinde polisakkarit içeriği, gaz-sıvı kromatografisi yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Sonuçta alkali (NaOH) muamelesinden sonra hücre duvarında galaktoz ve ramnoz oranının önemli ölçüde düştüğü belirlenmiştir. Aynı şekilde, faj duyarlı mutantların hücre duvarında da galaktoz ve ramnoz oranının belirgin bir şekilde düşük bulunması; L. lactis subsp. lactis UC503 suşunda faj almaç bölgenin galaktoz ve ramnoz polimerizasyonu ile oluşan bir materyal tarafından maskelendiğinin delili olarak kabul edilmiştir.
Daha önce de belirtildiği gibi, L. lactis suşlarında faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte dirençlilik özelliği gen kodu, kromozomal DNA üzerinde de bulunabilmektedir. Kromozomal DNA kökenli faj adsorbsiyonunun engellenmesi sistemlerinin moleküler doğasına ilişkin ilk önemli bulgular, Valyasevi et al. (1991) tarafından yapılan araştırmada ortaya konmuştur. Araştırıcılar L. lactis subsp. lactis C2 suşunda, c2 fajının hücre duvarından sonra membrana tutunmasının, gen kodu kromozomal DNA üzerinde bulunan bir protein tarafından engellendiğini belirlemiştir. Diğer yandan, bu suşun c2 fajına dirençlilik özelliğini sürdüren mutantlarında ise; faj adsorbsiyonunun her iki aşamada da yüksek bir oranda meydana geldiği saptanmıştır. Söz konusu mutant suşlar ile doğal suşun hücre duvarı karbonhidrat bileşimi karşılaştırıldığında, tamamen aynı bulunmuştur. Doğal suşta nihai faj tutunmasını engelleyen ve mutantlarda aktif olmayan yapının protein doğası, hücrelerin proteinaz K ile muamelesi sonucu tanımlanmıştır. Proteinaz K uygulaması ile, doğal suşta c2 fajı adsorbsiyonu ve duyarlılık fenotipi meydana gelmiştir. Kısmi saflaştırması gerçekleştirilen bu protein, 32 kDa moleküler ağırlıkta bulunmuştur. Protein denatürasyonunun yapılmadığı elektroforez koşullarında, 32 kDa’ luk proteinin, 350 kDa büyüklükte bir membran kompleksinin bileşeni olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmayı esas alan bir diğer araştırmada, Geller et al. (1993) L. lactis subsp. lactis C2 suşu kromozomal DNA’ inden klonladıkları ve c2 faj DNA’ i enjeksiyonu için zorunlu proteini kodlayan pip genini, faj adsorbsiyonunun gerçekleştiği ancak halen faj dirençlilik özelliğini sürdüren mutantlara aktardıklarında; söz konusu mutantların duyarlı hale dönüştüğünü saptamıştır. Klonlanan genin DNA sekanslarından hareketle, protein ürününün yaklaşık 99.5 kDa ağırlıkta olduğu ileri sürülmüştür. Ayrıca söz konusu proteininin amino ucunda bir sinyal serisinin bulunduğu ve bu serinin membran üzerinde 4-6 adet arası potansiyel bağlanma bölgesi içerdiği öngörülmüştür. Ancak, L. lactis subsp. lactis C2 suşunda belirlenen ve faj adsorbsiyonunu engelleme görevi gören 32 kDa’ luk protein ile faj DNA enjeksiyonu için zorunlu 99.5 kDa’ luk “pip” proteini arasındaki ilişki bu çalışma kapsamında tanımlanamamıştır. Monteville et al. (1994) L. lactis subsp. lactis C2 suşunda, 7 farklı laktokok fajının geri dönüşebilir adsorbsiyonunun hücre duvarında bulunan ramnoz komponenti üzerinde gerçekleştiğini ispat ettikleri araştırmaları, Geller (1993) tarafından elde edilen sonuçları anlaşılır hale getirmiştir. Bu araştırmada, söz edilen 7 fajın nihai ve geri dönüşsüz adsorbsiyonunun “pip” geni tarafından kodlanan membran proteini üzerinde meydana geldiği saptanmıştır. Pip geni içermeyen mutantlarda faj adsorbsiyonu hücre duvarında meydana gelirken, stoplazma membranında nihai adsorbsiyonunun ve dolayısı ile hücre içine faj DNA enjeksiyonunun gerçekleşememesi nedeni ile faj dirençlilik özelliği devam etmektedir. Zira faj DNA’inin hücre içine enjeksiyonu, ancak faj adsorbsiyonunun geri dönüşsüz olarak gerçekleştiği ikinci aşamadan (pip proteinine tutunma aşaması) sonra meydana gelebilmektedir. Doğal suşta ise, 32 kDa’ luk protein hücre membranında yer alan pip proteinini maskeleyerek geri dönüşsüz faj adsorbsiyonunu engellemektedir. Sadece 32 kDa’luk proteininin üretiminin engellendiği C2 mutantlarında, pip proteininin varlığı nedeniyle nihai adsorbsiyon ve faj DNA enjeksiyonu gerçekleşmekte ve faj duyarlı fenotip oluşmaktadır. L. lactis subsp. lactis C2 suşunda faj morfotiplerine göre, pip proteini etkinliğinin araştırıldığı çalışmada; bu membran proteininin prolat fajların enfeksiyonu için zorunlu olduğu, ancak küçük izometrik baş yapılı fajlara karşı bir etkinlik göstermediği saptanmıştır (Kraus and Geller 1998).
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Bakteriler ve fajlar
Araştırmada
kullanılan L. lactis subsp. lactis MA83 suşu ile Øla2 ve Øld5 ve Ølc7 fajları, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi
Gıda Mühendisliği Bölümü, Gıda Mikrobiyolojisi kültür kolleksiyonundan, Ø857
fajı ise Dr. Andrea-Budde Niekiel’ den (Wisby, Niebüll, Germany) sağlanmıştır. Bakteriler, M17 (Terzaghi and
Sandine, 1975) dik agarda +4
M17 Broth ve Agar
Polipepton 5 g
Fitopepton 5 g
Maya ekstraktı 2.5 g
Et ekstraktı 5 g
β- disodyum glisero fosfat 19 g
Laktoz (% 10) 50 mL
MgSO4.7H2O (
Askorbik asit 0.5 g
Agar 15 g
Destile su 950 mL
pH 7.15 (Sterilizasyondan önce)
Ortam içerikleri 950 mL destile su içerisinde çözülerek, agar
ilavesinden önce pH 7.15’
e ayarlanmıştır. Sterilizasyon 121 0C
de 15 dk süre ile yapılmıştır. Ortam soğutulduktan sonra (45 0C ), ayrı sterilize
edilen laktoz çözeltisi (50 mL) ilave edilmiştir (Terzaghi and Sandine 1975).
3.2. Yöntem
3.2.1. L. lactis subsp. lactis hücrelerine kimyasal
uygulaması
30 0C’ de 18 saat süreyle geliştirilen bakteri kültürleri (15
mL), 1.5 mL’ lik hacimler halinde steril eppendorf tüplerine aktarılmış ve 5000
devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilmiştir. Hücre çökeltileri üç kez steril
destile su ile yıkandıktan sonra; farklı tüplere, 1.5 mL steril triton-X-100 (%
1), sodyum dodesil sülfat (SDS % 1), HCl (0.1 M ), NaOH (0.05 M ), α-amilaz (0.5
mg/mL), pronaz E (1.5 mg/mL), tripsin (1.5 mg/mL) ve proteinaz K (1.5 mg/mL)
ilave edilmiştir. Kontrol tüplerdeki hücre çökeltisine, 1.5 mL steril destile
su uygulanmıştır. Triton-X-100 ve sodyum dodesil sülfat uygulanan tüpler 45 0C’
de, sırasıyla 30 ve 45 dk, NaOH ve HCl uygulanan tüpler 21 0C’ de 30
dk, pronaz E, proteinaz K ve tripsin uygulanan tüpler 37 0C’ de 30
dk ve α-amilaz uygulanan tüpler 37 0C’ de 60 dk süreyle
inkübasyona tabi tutulmuştur (Sijtsma et al. 1988). İnkübasyon işlemi bitiminde
her bir tüp için, faj adsorbsiyon oranı tanımlanmıştır.
L. lactis subsp. lactis’ de faj
adsorbsiyonunun farklı monosakkaritlere spesifik lektinler ile inhibisyonu; Vicia
sativa, Banderiaea simplificolia ve Momordica
charantia lektinlerinin (Sigma Chem. Co.,
USA) hücrelere denenmesi suretiyle saptanmıştır. İlk aşamada, hücrelerin
lektinlerle aglutinasyon verip vermedikleri araştırılmıştır. 30 0C’
de 18 saat geliştirilen kültürler (10 mL), 5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj
edilerek çöktürülmüş ve 1 mL β-gliserofosfat tampon (% 1.9
β-gliserofosfat, % 0.025 MgSO4, 10 mM kalsiyum-boro-glukonat,
pH 6.8) içeresinde süspanse edilmiştir. Hücre süspansiyonlarına lektinler, 1
μg/mL olacak şekilde uygulandıktan sonra, 25 0C’ de 20 dk
inkübasyona tabi tutulmuştur. Aglutinasyon, ışık mikroskobunda 1500X büyütmede
gözlenmiştir (Sijtsma et al. 1998).
Hücrelerin lektinlerle aglutinasyon karakteristikleri belirlendikten sonra,
yukarıda anlatıldığı şekilde geliştirilip çöktürülen bakteri kültürleri, yine 1
mL β-gliserofosfat tampon içerisinde süspanse edilmiş ve 2.5 mg/mL olacak
şekilde lektinler uygulanmıştır. 25 °C’ de
20 dk inkübasyondan sonra, hücreler 5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj
edilerek çöktürülmüştür. (Valyasevi et al. 1994). Hücre çökeltisi, steril M17 broth’ ta 105 düzeyine
kadar dilüe edilerek; Ømpl51, Ømpl86, Ølc961 ve Øld1083 fajlarına karşı
adsorbsiyon oranlarındaki değişmeler araştırılmıştır (3.2.2.).
3.2.2. Faj
adsorbsiyon oranının saptanması
30 0C’ de 18 saat süreyle geliştirilen bakteri kültürlerinden
0.7 mL alınarak, titreleri 105 pfu/mL düzeyine seyreltilen 0.75 mL
faj süspansiyonu ve 37.5 μL CaCl2.6H2O (0.185 M ) çözeltisi ile
karıştırılmıştır. Bu karışımları içeren eppendorf tüpleri 30 0C su banyosunda 15
dk tutularak, adsorbsiyonun tamamlanması sağlanmıştır. Bu süre bitiminde
tüpler, 5000 devir/dk hızda 3 dk santrifüj işlemine tabi tutulmuştur. Adsorbe
olmayan fajları içeren üst sıvıdan 1 mL alınarak, 9 mL’ lik steril fizyolojik
su içeren tüplerde seri dilüsyonları hazırlanmıştır. Bu dilüsyonlar, fajların
homolog konakçı suşlarına denenmek suretiyle faj adsorbsiyonundan sonraki titre
saptanmıştır. % Faj adsorbsiyonu, aşağıdaki formül kullanılarak belirlenmiştir:
(Başlangıç faj titresi – Adsorbsiyondan sonraki titre)
% Faj adsorbsiyonu =
x 100
Başlangıç faj titresi
(Luria et al. 1978, Lucey et al.
1992).
3.2.3. Tek aşama faj çoğalma testi
Latent
dönem, artış dönemi ve patlama büyüklüğü gibi faj gelişme parametrelerinin
belirlenmesinde, tek aşama faj çoğalma testi kullanılmıştır (Luria et al. 1978). Faj ve homolog konakçı suş
1/1 oranında ( 105 pfu/mL ve 105 cfu/mL) karıştırıldıktan
sonra,
İlk faj
partiküllerinin M17 çift tabaka agar ortamında görüldüğü süre, faj latent
döneminin sonu olarak değerlendirilmiştir. Ancak populasyondaki bazı hücrelerde
latent dönemin uzamasına bağlı olarak, bu süreden sonra da faj plak sayısında
artış meydana gelmiştir. Latent dönemin sonundan, M17 çift tabaka agar
ortamlarında faj plak sayısının sabitleşmesine kadar geçen süre de, artış
dönemi olarak karakterize edilmiştir. Artış döneminde saptanan ortalama faj
plak sayısının, latent dönemde saptanan ortalama faj plak sayısına bölünmesi
suretiyle, faj patlama büyüklüğü tanımlanmıştır.
Faj plak
etkinliği; fajların homolog konakçılarında belirlenen titrenin, test suşunda
belirlenen titreye bölünmesi sonucu saptanmıştır.
Çift tabaka M17 agar ortamlarının
hazırlanması: Faj denemelerinde, M17 alt tabaka agar ortamı, ayrı
sterilize edilen
3.2.4. Faj titresinin belirlenmesi
Faj
titresinin, plak oluşturma birimi/mL (pfu/mL) esasına göre saptanmasında M17
çift tabaka agar ortamları kullanılmıştır. İçerisinde 9 mL steril fizyolojik
tuzlu su (% 0.85 NaCl) bulunan tüplere, aseptik koşullarda ve steril pipet
aracılığı ile faj süspansiyonlarından 1 mL aktarılmış ve 10-8
düzeyine kadar seyrelti dizisi hazırlanmıştır. 3 saatlik M17 broth
kültürlerinden, M17 yumuşak agar içine 0.1 mL ilave edilip, köpürmeyecek bir
şekilde karıştırılmış ve petri kutusuna, homojen yayılmasına özen gösterilerek,
dökülmüştür. Yumuşak agarın donması için 15 dk beklendikten sonra, cam yazar
kalem ile çizilerek bölümlere ayrılan petri plaklarının herbir bölümüne, faj
süspansiyonlarından ve hazırlanan faj seyreltilerinin herbirinden
3.2.5. Doğal suşlardan plazmidlerin giderilmesi ve plazmidleri giderilmiş mutantların seçimi
L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda plazmid giderme ajanı olarak akriflavin
(Sigma Chem. Co.,USA) kullanılmıştır. Öncelikle, 5 μg/mL – 50 μg/mL
oranında akriflavin içeren bir dizi steril M17-glukoz broth ortamı
hazırlanmıştır. Bu ortamları içeren herbir ardışık tüpte akriflavin oranı,
1μg/mL olacak şekilde arttırılmıştır. 30 0C’ de 12 saat süreyle
geliştirilen aktif L. lactis subsp. lactis kültürlerinden, akriflavin
içeren tüplere % 1 oranında inokülasyon yapılmış ve inkübasyona devam edilmiştir.
İşlem beş kez tekrar edildikten sonra, bu ortamlardan hazırlanan seri
dilüsyonlardan laktoz indikatör agar ortamlarına sürme ekim yapılmış ve 30 0C’
de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi bitiminde, ortamda
gelişimleri sonucu indikatör boya rengini sarıya dönüştüren koloniler, laktoz
fermentasyon yeteneğini sürdüren (Lac+), beyaz koloniler ise laktoz
fermentasyon yeteneğini kaybetmiş (Lac-) koloniler olarak
değerlendirilmiştir (McKay et al.
1972, McKay and Baldwin 1973, Wolfe and McKay 1983). Son aşamada plazmidleri
giderilmiş mutant suşun tanımlanması, bu ortamda seçilen Lac+ ve Lac-
kolonilere akriflavin uygulamasına devam edilerek gerçekleştirilmiştir.
Laktoz İndikatör Agar
Tripton 20
g
Jelatin 2.5
g
Dekstroz 2.5
g
Glukoz (% 1) 100 mL
NaCl 4
g
Sodyum asetat 1.5
g
Askorbik asit 0.5
g
Brom krezol purpur
(% 0.004) 10 mL
Agar 15
g
Destile su 880 mL
pH 6.8
(Sterilizasyondan önce)
880 mL destile su
içerisinde ortam içerikleri çözülmüş ve pH
3.2.6. L. lactis subsp. lactis’de plazmid içeriklerinin tanımlanması
3.2.6.1. Plazmid izolasyonu
M17 broth
besiyerinde 30 0C’ de 18 saat geliştirilen L. lactis subsp. lactis
kültürlerinden,
Sakkaroz Tampon
Tris 0.655 g
EDTA 0.0372 g
Sakkaroz 6.7
g
Destile su
100 mL
pH 8.0
Lizozim Çözeltisi
Tris 0.3 g
Lizozim 0.1 g
Destile su
10 mL
pH 8.0
Tris–EDTA–1
Tris 0.60 g
EDTA 9.31
g
Destile su 100 mL
pH 8.0
Tris–Cl
Tris – Cl 31.52 g
Destile su 100 mL
pH 7.0
SDS Çözeltisi
Tris 0.60 g
EDTA 0.74
g
SDS 20 g
Destile su 100 mL
pH 8.0
Tris–EDTA–2
Tris 0.121 g
EDTA 0.037
g
Destile su 100 mL
pH 7.5
RNaz A stok çözeltisinin
hazırlanması : 5 mL destile su içerisinde hazırlanan
% 3 NaCl ile doyurulmuş fenol
çözeltisinin hazırlanması :
3.2.6.2. Plazmidlerin saflaştırılması
Bakterilerden
izole edilen plazmidlerin saflaştırılmasında, sezyum klörür – etidyum bromit
yoğunluk gradienti yöntemi kullanılmıştır (Klaenhammer et al. 1978). 4 Farklı DNA örneği için;
Dializ tüplerinin hazırlanması : Dializ
membran şeritlerinden
3.2.6.3. Agaroz jel elektroforezi
DNA
örneklerinin elektroforezi % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde yapılmıştır
(Meyers et al. 1976). Yatay ve dikey jel sistemleri için agaroz, 100 mL
tris-fosfat elektroforez tamponu içerisinde, kaynar su banyosunda çözülmüştür.
45 0C’ ye kadar soğutulan ortam elektroforez plakalarına dökülmüş ve
jel tarakları yerleştirilerek 60 dk beklenmiştir. Bu süre sonunda elektroforez
tampon çözeltisi, tank içerisine jeli kapatacak düzeyde ilave edilmiş ve
taraklar çıkarılmıştır. 37 0C’ de 45 dk inkübe edilen DNA örnekleri,
su banyosundan alınarak 2 μl marker boya çözeltisi ile karıştırılmış ve
mikro pipet aracılığı ile jel kuyucuklarına aktarılmıştır. Elektroforez, 100
voltta 3.5 saat süreyle yapılmıştır. Marker boyanın jel sistemleri terk
etmesinden sonra elektrik akımı kesilmiş ve ortamdan alınan jeller, kullanılan
elektroforez tamponunun, yeni hazırlanmış 0.2 μg/mL etidyum bromit içeren
çözeltisinde 1 saat boyanmıştır. Boyama işlemi bitiminde jeller, 366 nm dalga
boyunda ultraviyole ışıkta incelenmiş ve fotoğraflar siyah-beyaz film
kullanılarak alınmıştır. Fotoğrafların çekiminde ultraviyole filtreden (Kodak #
15) yararlanılmıştır (Macrina et al.
1982).
Tris-Fosfat Tampon (10 x)
Tris 108 g
% 85 Fosforik asit (1.679
μg/mL) 15.5
mL
EDTA (
pH 8.0
Marker Boya Çözeltisi
Bromfenol blue 0.25 g
Sakkaroz 40 g
Destile su 100 mL
3.2.7. L. lactis subsp. lactis’ de hücre duvarı
izolasyonu ve hücre duvarı proteinlerinin sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid
jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi ile tanımlanması
3.2.7.1. Hücre duvarı izolasyonu
30 0C’
de 18 saat geliştirilen L. lactis subsp.
lactis kültürleri (
DNaz I stok çözeltisinin
hazırlanması : % 50 Gliserol,
3.2.7.2. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)
SDS-PAGE deneyleri
Laemmli (1970) tarafından önerilen yöntem kullanılarak yapılmıştır.
Elektroforez plakaları %
Ayırıcı Jel
Akrilamid 12 mL
Tris (2M, pH 8.8) 5.62 mL
SDS (% 10) 300 mL
Destile su 12.1 mL
Dökmeden hemen
önce, 200 μL % 10 amonyum persülfat ve 20 μL tetrametil etilen diamin
(TEMED) ilave edilmiştir.
Toplayıcı Jel
Akrilamid 1.8
mL
Tris (
SDS (% 10) 150 μL
Destile su 9.4
mL
Dökmeden hemen
önce, 100 μL % 10 amonyum persülfat ve 10 μL TEMED ilave edilmiştir.
Tris-SDS Tampon
Tris 5.9 g
SDS 0.4 g
Destile su 100 mL
pH 6.7
Akrilamid Çözeltisi
Akrilamid 30 g
Bis-akrilamid 0.8
g
Destile su 100 mL
Çözeltinin
hazırlandığı erlenmayer, alümünyum folyo ile kaplanarak +4 0C’ de
tutulmuştur.
Elektrot Tamponu
Glisin 8 g
Tris 12.64 g
SDS
2 g
Destile su 2 L
Kaynatma Çözeltisi
Tris-SDS tampon 1 mL
SDS (% 25) 0.8 mL
β-merkaptoetanol 0.5 mL
Gliserol 1 mL
Brom fenol blue 0.01 g
Commasie Brilliant Blue Boya Çözeltisi
Commasie brilliant
blue 1.25 g
Metanol 250
mL
Glasiyel asetik
asit 50
mL
Destile su 200
mL
Jel Fiksasyon Çözeltisi
Glasiyel asetik
asit 70
mL
Metanol 50
mL
Destile su 880
mL
3.2.8. Hücre duvarı karbonhidrat analizi
L. lactis subsp. lactis atasal suşu ve faj adsorbsiyonunu engelleme özelliğini
kaybetmiş mutantında hücre duvarı karbonhidrat bileşimindeki değişimler, Yüksek
Performans Sıvı Kromotografisi (HPLC, Specra System, Thermo Separation
Products, USA) analizleri yapılarak araştırılmıştır (Wallace 1980, Kennedy and
Sutherland 1987). 30 0C’ de18 saat geliştirilen bakteri kültürleri,
5000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj işlemi ile çöktürülmüş ve % 30 NaOH
çözeltisinde, 100 0C’ de 3 saat muamele edilmiştir. Bu ekstraktlara,
1/1 oranında etanol uygulanarak hücre duvarı polimerleri çöktürülmüştür. İzole
edilen materyal,
HPLC analizlerinde;
P4000 model pompa (maksimum basınç, 600 psi), SCM 1000 tip vakum degasser,
RI-71 tip rekraktif endeks detektörü (Showa Denko, Japan), SN 4000 dijital
analog konventer içeren SN 4000 tip interface card, IPX 486 DX4/100 MHz, 16 MB
RAM, 540 MB HD, bilgisayar, PC 1000 software program, 7125 NS vakum pompası
(KNF/No 26.1-2 AN 18, Germany), Asihipac NH2P-50 poliamid-bağlı
polimerik jel kolonu (4.6x250 IDxL, mm çapında, 5μm partikül çapına
uygun), maksimum 100
Analiz süresince,
kolon sıcaklığı 55
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA
Akçelik et
al. (2000) Lactococcus lactis
MA83 suşunun; Türkiye’ nin farklı bölgelerinden sağlanan çiğ süt ve peynir altı
suyu örneklerinden izole edilen 22 laktokok fajına karşı, faj adsorbsiyonun
engellenmesi tipte dirençlilik sistemi içerdiğini, saptamıştır.
Çalışmamızın
ilk aşamasında, L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda; ekzopolisakkarit
yapının, bu suşun faj dirençlilik özelliği ile ilişkisi araştırılmıştır. L.
lactis subsp. lactis MA83 şuşunda ekzopolisakkarit kapsül yapısı,
boyama yapılmaksızın lam-lamel arasında hazırlanan preparatların faz-kontrast
mikroskopta (1500xbüyütme) incelenmesi sonucu saptanmıştır. Daha önceki
çalışmalarda (Akçelik et al. 2000) Türkiye ve Avrupa kökenli bir çok
dominant faja karşı direnç özelliği belirlenmiş olan MA83 suşu için;
araştırmamızda faj duyarlılık testlerinde kullanılmak üzere, 3 adet Türkiye
kökenli (fla2, fld5, flc7) ve 1 adet, Avrupa’da
peynir işletmelerinde sorun yaratan laktokok fajı (f857) (Dr. A. Budde-Niekiel,
Whisby, Niebüll/Germany) seçilmiştir. L. lactis subsp. lactis
MA83 suşunda faj dirençliliğin, bu suşun ürettiği ekzopolisakkarit yapı ile
ilişkisi, bu suş kültürlerinin ayrı
tüplerde ancak eş zamanlı olarak; SDS (%1), Triton X-100 (%1), HCl (
Almaç
bölgenin maskelendiği koşullarda, hücre duvarı ekstraktlarında tüm fajların
adsorbsiyonunun geri dönüşsüz bir şekilde meydana gelmesi, MA83 suşunda faj
almaç bölgenin hücre duvarında yer aldığını kanıtlamaktadır. Zira, bazı
laktokok suşlarında hücre duvarı ekstraktlarında meydana gelen faj
adsorbsiyonunun, santrifüj işlemi uygulandığında fajların almaç bölgeden
ayrılması ile sonuçlandığı saptanmıştır. Bu suşlarda faj adsorbsiyonunun ilk
aşaması (geri dönüşebilir adsorbsiyon) hücre duvarındaki almaç bölgelerde
gerçekleşirken, faj enfeksiyonunun başlangıcı olarak nitelendirilen geri
dönüşsüz adsorbsiyon, fajların bir stoplazma membran proteini ile ilişkilenmesi
sonucu meydana gelmektedir (Klaenhammer 1984, Lodics and Steenson 1993, Akçelik
1994, Monteville et al. 1994, Garbutt
et al. 1997 Allison and Klaenhammer
1998). Ancak MA83 suşunda, fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarının geri dönüşsüz adsorbsiyonu için
herhangi bir stoplazma membran yapısına gereksinim duyulmamaktadır.
Çizelge 4.1. L. lactis subsp. lactis MA83
suşunda fajların adsorbsiyonu üzerine kimyasalların etkisi
|
Uygulanan Kimyasal |
Suş Kod No. |
Faj Adsorbsiyonu (%) |
|||
|
fla2 |
fld5 |
flc7 |
f857* |
||
|
Kontrol** |
MA83 |
- |
- |
- |
- |
|
SDS (%1) |
94.4 |
98.0 |
98.4 |
94.6 |
|
|
Triton
X-100 (%1) |
96.0 |
97.6 |
98.8 |
95.2 |
|
|
HCl ( |
96.2 |
98.2 |
98.2 |
94.0 |
|
|
NaOH ( |
96.2 |
98.0 |
98.4 |
94.4 |
|
|
a-Amilaz
(0.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
|
Proteinaz
K (1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
|
Pronaz E
(1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
|
Tripsin
(1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
* Kontrol litik faj (Whisby, Niebüll/Germany)
** Hiçbir
kimyasal muameleye tabi tutulmamıştır
L. lactis subsp. lactis MA83
suşunun hücre duvarında yer alan faj almaç bölgelerinin kimyasal doğasının
saptanması için, yukarıda söz edilen kimyasallar; bu kez MA83 suşunun
akriflavin muamele edildikten sonra seçilen, ekzopolisakkarit yapı oluşturma
yeteneğini kaybetmiş mutantına (L.
lactis subsp. lactis MA83-28)
karşı denenmiştir. Ekzopolisakkarit yapı oluşturma yeteneğini kaybetmiş mutant,
doğal suşa 50 mg/mL
akriflavin (Sigma Chem. Co., USA) uygulamasından sonra, laktoz indikatör agar
(McKay vd. 1972) ortamında seçilmiş ve daha önce söz edildiği şekilde
hazırlanan bakteri preparatlarının faz-kontrast mikroskopta incelenmesi
suretiyle tanımlanmıştır. Mutant suş MA83-28’de faj adsorbsiyonu; fla2 için %98.6, fld5 için %98.2, flc7 için %96.6 ve f857 için %99.4 oranlarında
meydana gelmiştir ve bu mutanta SDS, Triton X-100, HCl, NaOH ve a-amilaz uygulaması söz
konusu adsorbsiyon oranlarında herhangi bir değişime yol açmamıştır (Çizelge
4.2). Kontrol deneme ile kimyasal uygulamalar arasında saptanan %1’in altındaki
faj adsorbsiyon farklılıkları deneysel hassasiyetten kaynaklanmaktadır. Diğer
yandan, Proteinaz K, Tripsin ve Pronaz E uygulaması sonucunda mutant suş
MA83-28’de -tıpkı doğal suş MA83’de olduğu gibi – hiç bir fajın adsorbsiyonu
meydana gelmemiştir (Çizelge 2). Bu sonuçlar, L.
lactis subsp. lactis MA83
suşunda, denemeye alınan fla2, fld5, flc7 ve f857 fajlarının almaç
bölgelerinin hücre duvarında bulunduğunun ve protein yapıda olduğunun güçlü
kanıtlarıdır. Aynı denemenin ekzopolisakkarit yapı oluşturmayan ve faj almaç
bölge materyali protein olan kontrol suş L.
lactis subsp. lactis 965 (Dr. A.
Budde-Niekiel, Whisby, Niebüll/Germany) ile tekrarlandığında, MA83-28 mutant
suş ile benzer sonuçların alınması da (Çizelge 4.3) bu bulguları
doğrulamaktadır.
L. lactis subsp. lactis MA83 doğal suşunda alkali muamelesinden sonra tüm fajların
adsorbsiyonunun meydana gelmesi (Çizelge 4.1) ve MA83-28 mutantında ise,
proteolitik enzim uygulaması ile tüm fajların adsorbsiyonunun tamamen
engellenmesi (Çizelge 4.2), bu suşta söz konusu fajlar için tek bir almaç
bölgenin bulunduğunu kanıtlamaktadır. Bu bulgu, bazı laktokok suşlarında birden
fazla faj için tek bir almaç bölgenin bulunduğuna yönelik literatür verilerini
(Valyasevi et al. 1994, Neve 1996,
Kraus and Geller 1998) desteklemektedir.
Çizelge
|
Uygulanan Kimyasal |
Suş Kod No. |
Faj Adsorbsiyonu (%) |
|||
|
fla2 |
fld5 |
flc7 |
f857 |
||
|
Kontrol* |
MA83-28 |
98.6 |
98.2 |
96.6 |
99.4 |
|
SDS (%1) |
98.2 |
97.8 |
96.4 |
99.4 |
|
|
Triton
X-100 (%1) |
98.2 |
97.8 |
96.6 |
99.4 |
|
|
HCl ( |
98.0 |
98.2 |
96.2 |
99.2 |
|
|
NaOH ( |
98.4 |
98.0 |
96.6 |
98.8 |
|
|
a-Amilaz
(0.5 mg/mL) |
98.0 |
98.2 |
96.0 |
99.0 |
|
|
Proteinaz
K (1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
|
Pronaz E
(1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
|
Tripsin
(1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
* Hiçbir
kimyasal muameleye tabi tutulmamıştır
Çizelge 4.3. Ekzopolisakkarit
üretmeyen ve faj almaç bölge materyali proteinden oluşan kontrol suş L. lactis subsp. lactis 965’de
(Whisby, Niebüll/Germany) faj adsorbsiyonu üzerine kimyasalların etkisi
|
Uygulanan Kimyasal |
Suş Kod No. |
Faj Adsorbsiyonu (%) |
|||
|
fla2 |
fld5 |
flc7 |
f857 |
||
|
Kontrol* |
965 |
98.2 |
96.0 |
92.4 |
94.6 |
|
SDS (%1) |
98.2 |
96.0 |
90.8 |
94.2 |
|
|
Triton
X-100 (%1) |
98.2 |
95.6 |
91.6 |
94.6 |
|
|
HCl ( |
97.6 |
95.8 |
90.6 |
94.6 |
|
|
NaOH ( |
98.0 |
96.0 |
92.4 |
94.6 |
|
|
a-Amilaz
(0.5 mg/mL) |
98.0 |
96.2 |
92.0 |
94.4 |
|
|
Proteinaz
K (1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
|
Pronaz E
(1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
|
Tripsin
(1.5 mg/mL) |
- |
- |
- |
- |
|
* Hiçbir
kimyasal muameleye tabi tutulmamıştır
L. lactis subsp. lactis MA83
suşunda ekzopolisakkarit yapının biyokimyasal doğasının ön belirlenmesi amacı
ile lektin aktivasyon testleri yapılmıştır. Bu amaç doğrultusunda MA83 suşu;
terminal b-D-galaktozil
(Momordica charantia, MCA), N-asetilglukozamin (Bandeiraea
simplificolia, BS-I) ile glukozil ve mannozil (Vicia sativa, VCA)
kalıntılarına spesifik lektinlerle muamele edilmiş ve aglutinasyon özellikleri
belirlenmiştir. Test sonucunda yalnız Momordica charantia lektini ile
aglutinasyon meydana gelmiştir (Çizelge 4.4). Bu bulgu, L. lactis subsp. lactis MA83
suşunun oluşturduğu ekzopolisakkarit yapının bir galaktoz polimeri olduğuna
işaret etmektedir. L. lactis
subsp. lactis MA83 suşunda, bazı literatür verilerinin aksine (Dinsmore
and Klaenhammer 1995, Daly et al.
1996), galaktoz faj almaç bölgenin oluşturulmasında değil faj adsorbsiyonunun
engellenmesinde rol almaktadır. Bu açıdan söz konusu suş laktokoklarda faj
dirençlilik araştırmalarına yeni bir boyut katma potansiyeli taşımaktadır.
Çizelge 4.4. L. lactis subsp. lactis MA83
suşunun monosakkaritlere spesifik lektinlerle aglutinasyonu
|
Lektinler |
Suş Kod No. |
Aglutinasyon |
|
Kontrol |
MA83 |
- |
|
BS-I |
- |
|
|
MCA |
+ |
|
|
VSA |
- |
BS-I : Bandeiraea simplificolia
MCA : Momordica charantia
VSA : Vicia sativa
L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda
ekzopolisakkarit yapının ve faj reseptör materyalinin yüksek basınç sıvı
kromotografisi (HPLC) ve sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi
yöntemleri ile kesin tanısı yapılmıştır. Klasik testler sonucunda L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği ekzopolisakkarit materyalin % 49.9
oranında karbonhidrat ve % 9.3 oranında
fosfat içerdiği saptanmıştır (Çizelge 4.5).
Ekzopolisakkarit yapının ana materyali olan karbonhidratların oluştuğu
alt ünitelerin tanısında ise HPLC yöntemi kullanılmıştır (Wallace 1980, Kennedy
and Sutherland 1987). HPLC analizleri sonucunda ekzopolisakkarit yapının ana
bileşen galaktoz yanında galaktozamin ve ramnoz içerdiği de saptanmıştır (Çizelge
4.6).
faj reseptör proteinin tanısı
amacı ile; bu suşun ekzopolisakkarit üretme yeteneği giderilmiş faj duyarlı
mutantı MA83-28 ve bu mutantın 40°C ısı uygulaması sonucu (48 saat) seçilen faj dirençli türevinin
(MA83-28-T) hücre duvarı protein profilleri karşılaştırılmıştır. Suşlarda hücre
duvarı izolasyonunda Schaffer et al.
(1991) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. Hücre duvarı protein
analizlerinde ise SDS-PAGE (Laemmli 1970) sisteminden yararlanılmıştır.
SDS-PAGE analizleri sonucunda L. lactis subsp.
lactis MA83-28 mutantında
büyüklükleri 16.3 kDa ile 102.7 kDa arasında değişen 28 adet proteinin varlığı
belirlenmiştir. Bu suşun faj dirençli türevinde ise (MA83-28-T) sadece 102.7 kDa büyüklükteki
protein kaybolmuştur (Şekil 4.1). Bu sonuçlar L. lactis subsp. lactis MA83
suşunda faj almaç bölgeyi oluşturan yapının 102.7 kDa büyüklükteki protein
olduğunu kanıtlamaktadır.
Çizelge
4.5. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği
ekzopolisakkarit yapının kimyasal bileşimi
Bileşik
|
L. lactis subsp. lactis MA83 |
|
Miktar
(mg/100mg kuru hücre için) |
Ekstrakte Edilen Toplam
Ekzopolisakkarit (%) |
|
|
Toplam Ekzopolisakkarit |
6.95 |
100 |
|
Karbonhidrat |
3.72 |
49.9 |
|
Fosfat |
0.70 |
9.3 |
|
Protein |
- |
- |
Çizelge
4.6. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği
ekzopolisakkarit materyalin monosakkarit bileşimi
Monosakkarit
|
L. lactis subsp. lactis MA83 |
|
Miktar
(mg/100mg kuru hücre için) |
Molar Oran |
|
|
Galaktoz |
284.4 |
3.3 |
|
Galaktozamin |
157.3 |
1.8 |
|
Ramnoz |
62.1 |
0.7 |
Şekil 4.1. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ekzopolisakkarit
üretme yeteneğini kaybetmiş (Eps-), faj duyarlı (fs)
mutant suşu (MA83-28) ve bu suşun faj dirençli (fr)
türevinin (MA83-28-T) protein içerikleri
|
1 Protein Marker |
2 MA83-28 (Eps- fs) |
2 MA83-28-T (Eps- fr) |
|
kDa |
kDa |
kDa |
|
200.0 |
102.7 |
97.4 |
|
116.2 |
97.4 |
93.8 |
|
97.4 |
93.8 |
88.3 |
|
66.2 |
88.3 |
80.9 |
|
45.0 |
80.9 |
73.5 |
|
31.0 |
73.5 |
71.8 |
|
21.5 |
71.8 |
69.1 |
|
|
69.1 |
66.2 |
|
|
66.2 |
65.5 |
|
|
65.5 |
61.7 |
|
|
61.7 |
55.9 |
|
|
55.9 |
53.9 |
|
|
53.9 |
50.2 |
|
|
50.2 |
46.5 |
|
|
46.5 |
43.4 |
|
|
43.4 |
39.6 |
|
|
39.6 |
37.8 |
|
|
37.8 |
35.5 |
|
|
35.5 |
33.2 |
|
|
33.2 |
30.5 |
|
|
30.5 |
29.4 |
|
|
29.4 |
27.1 |
|
|
27.1 |
25.9 |
|
|
25.9 |
24.8 |
|
|
24.8 |
23.6 |
|
|
23.6 |
18.7 |
|
|
18.7 |
16.3 |
|
|
16.3 |
|
HPLC sonuçları da, lektin testlerinde
olduğu gibi, L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği
ekzopolisakkaritin ana bileşeninin galaktoz olduğunu doğrulamaktadır. Galaktoza
ilave olarak, ekzopolisakkarit yapısında galaktozamin ve ramnoz da düşük
miktarda saptanmıştır. Ancak bu şekerlerin hücre duvarı kontaminantları olma
olasılığı yüksektir. Laktokokların faj almaç bölgelerinde lökalize olan
karbonhidratların, asit ve alkali muamelesine yüksek düzeyde hassasiyet
gösterdiği, değişik araştırıcılar tarafından belirlenmiştir (Sijtsma et al. 1990a, Klaenhammer and Fitzgerald
1994, Daly et al. 1996, Şanlıbaba et al. 1999). Ancak, laktokokların ürettiği
ekzopolisakkaritlere yönelik kromotografik analizlere ait az sayıda literatür
verisi bulunmaktadır (Sijtsma et al.
1988, Valyasevi et al. 1991).
Araştırmada elde edilen HPLC analiz verileri, bu açıdan da önem taşımaktadır
Bakterilerde faj adsorbsiyonun,
karbonhidrat-protein interaksiyonlarına bağlı inhibisyonu ilk kez Goldstein et al. (1965) tarafından tanımlanmıştır.
Genellikle laktokoklarda faj almaç bölgeler ve faj almaç bölgeleri maskeleyen
materyallerin tanısı, bağımsız araştırmalarda ve farklı suşlarda yürütülmüş
olduğu için, bu interaksiyonu kanıtlayan çok az sayıda araştırma bulunmaktadır
(Lodics and Steenson 1993, Monteville et
al. 1994, Allison and Klaenhammer 1998). Özellikle Bacillus türlerinde tanımlanan söz konusu interaksiyon, bu
araştırma kapsamında L. lactis subsp.
lactis MA83 suşu için, kesin
delillerle tanımlanmıştır. Bu interaksiyonların kimyasal doğasının detaylı
analizler sonucu belirlenmesi; özellikle faj adsorbsiyonunun engellenmesi tipte
dirençlilik sistemi içeren endüstriyel starter suş geliştirme çalışmalarına,
yeni bir ufuk ve ivme kazandıracaktır.
L. lactis
subsp. lactis MA83 suşunda
ekzopolisakkarit yapının genetik
determinantlarının araştırılmasında , ekzopolisakkarirt üretme
yeteneğini kaybetmiş mutantların, ekzopolisakkarit üretme yeteneğine sahip
doğal suş ile arasındaki plazmid içeriği farklılıkları esas alınmıştır.
Çalışmada mutajen ajan olarak akriflavin kullanılmıştır. Akriflavin
uygulamasından sonra, laktoz indikatör agar ortamında tanımlanan laktoz
fermentasyon özelliğini sürdüren (Lac+) ve laktoz fermentasyon
özelliğini kaybetmiş (Lac-) mutantların faj duyarlılıkları; Akçelik
et al. (2000) tarafından kullanılan materyalden seçilen fla2, fld5, flc7 ve Dr. Andrea-Budde Niekiel’ den (Wisby, Niebüll,
Germany) sağlanan f857 fajlarına denenmek suretiyle saptanmıştır.
Faj duyarlı mutant suşların tümünde ekzopolisakkarit üretim özelliğinin ve
laktoz fermenrasyon yeteneğinin eş zamanlı bir şekilde kaybolduğu
belirlenmiştir. Mutant suşlarla yürütülen faj duyarlılık testleri ve plazmid
analizleri; L. lactis subsp. lactis MA83 suşunda faj adsorbsiyonunun
engellenmesi tipte dirençlilik fenotipinin ( dolayısı ile ekzopolisakkarit
üretiminin ve laktoz fermentasyon yeteneğinin), 32.7 kb plazmidin giderilmesine
bağlı olarak, stabil bir şekilde etkinliğini kaybettiğini göstermiştir. Diğer
yandan sadece bu plazmidi içeren mutantlarda bile ekzopolisakkarit üretiminin,
laktoz fermentasyonun ve faj dirençlilik özelliklerin sürdürülmesi, bu
özelliklerin 32.7 kb plazmid tarafından kodlandığına işaret etmektedir (Şekil
4.2). Bu güne kadar değişik laktokok suşları ile yürütülen araştırmalarda; bu
bakterilerin içerdiği bazı laktoz plazmidlerinin, ekzopolisakkarit üretimi ile
ilişkili olduğu belirlenmiş ancak , ekzopolisakkarit üretimi ile faj
dirençlilik arasında bir ilişki tanımlanmamıştır (Sanders 1988, Daly et al. 1996, Fitzgerald et al. 1996, Kok 1996, Leewacharamas et al. 1997, Moineau et al. 1997, Yi-Mo et al. 1999, Tükel ve Akçelik 2000).
Şekil 4.2. L.
lactis subsp. lactis MA83 suşu ve
mutantlarında plazmid
içerikleri
1 (MA83-36, Lac+,
Ør , Eps+): 32.7 kb
2 (MA83-80, Lac+,
Ør , Eps+): 32.7 kb
3(MA83-28, Lac-, Øs , Eps-): Tüm plazmidleri
giderilmiş
4(MA83, Doğal suş, Lac+,
Ør, Eps+): 44.3, 32.7, 19.6, 16.2, 10.4, 9.1, 4.0 kb
5(MA83-13, Lac+,
Ør , Eps+): 32.7 kb
6(MA83-78, Lac+,
Ør , Eps+): 32.7 kb
Lac+: Laktoz fermentasyonu yeteneğ
Lac- : Laktoz fermentasyonu
yeteneğini kaybetmiş
ØS
: Faj duyarlı
Ør : Faj dirençli
kb :
Kilobaz
Araştırmada, ekzopolisakkarit üretim özelliğinin, adsorbsiyonun
engellenmesi gibi güçlü bir faj dirençlilik sistemine yol açtığının
tanımlanması ve bu materyalin ana bileşeninin belirlenmesi, starter kültür
suşlarının geliştirilmesini esas alan endüstriyel çalışmalara büyük katkılar
yapacaktır. Diğer yandan bu özelliklerin konjugal hareketliliğe sahip ve
laktokok suşlarında oldukça stabil olan laktoz plazmidlerin üzerinde taşınıyor
olması da, genetik manupilasyonlara kolaylık sağlaması açısından, kritik önem
taşımaktadır.
KAYNAKLAR
Akçelik, M. and
Tunail, N.
Akçelik, M. 1994. Adsorption and growth characteristics of some lactic phages. Doğa (Tr. J. of Biology), 18; 155-160.
Akçelik, M.
Akçelik, M. 1999. The conjugal plasmid pLL10236 encodes lactose
fermentation ability, restriction/modification activity, bacteriocin production
and immunity in Lactococcus lactis subsp.
lactis LL102. Food Microbiology, 16;
487-494.
Akçelik, M., Şanlıbaba, P. and Tükel, Ç. 2000. Phage resistance in L. lactis subsp. lactis isolated from tradional fermented milk products in turkey. Int. J. Food Sci. Technol., In Press.
Allison, G.E.and Klaenhammer, T.R. 1998. Phages resistance mechanisms in lactic acid bacteria. Int. Dairy J., 8; 207-226.
Anderson, D.G. and Mc Kay, L.L.
Babu, K.S., Spence, W.S., Monteville, M.R. and Geller, B.R. 1995. Characterization of a cloned gene (pip) from Lactococcus lactis required for phage infection. In: Genetics of Streptococci, Enterococci and Lactococci (J.J. Ferretti, M.S. Gilmore, T.R. Klaenhammer and F. Brown, Eds), p. 569-575, Basel, Switzerland.
Boumerdassi, H., Monnet, C., Desmazeaud, M. and Corrieu, G. 1997.
Isolation and properties of Lactococcus
lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis CNRZ 483 mutants
producing diacetyl and acetoin from glucose. Appl. Environ. Microbiol., 63;
2293-2299.
Chopin, A., Chopin, M.C., Batt, G.M. and Langella, P. 1984. Two plasmid
determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid, 11; 260-263.
Cluzel, P.J., Chopin, A., Ehrlich, S.D. and Chopin, M.C. 1991. Phage abortive infection mechanism from Lactococcus lactis subsp. lactis, expression of which is mediated by an ISO ISS 1 element. Appl. Environ. Microbiol., 57; 3547-3551.
Daly, C., Fitzgerald, G.F.
And Davis, R. 1996. Biotechnology of lactic acid bacteria
with special reference to
bacteriophage resistance. Antonie Van Leeuwenhoek,
70; 99-110.
de Vos, W.M., Underwood, H.M. and Davıes, F.L. 1984. Plasmid encoded bacteriophage resistance in Streptococcus cremoris SK11. FEMS Microbiol. Lett. 23, 175-178.
de Vos, W.M. 1989. On the carrier state of bacteriophages in starter lactococci. Neth. Milk Dairy J., 43; 221-228.
Dinsmore, P.K. and Klaenhammer, T.R. 1995. Bacteriophage resistance in Lactococcus. Molecular Biotechnology, 4;
297-314.
Dunny, G.M., Krug, D.A., Pan, C.L. and Ledford, R.A. 1988. Identification of cell wall antigens associated with a large conjugative plasmid encoding phage resistance and lactose fermentation ability in lactic streptococci. Biochemie, 70; 443-450.
Erlandson, K. and Batt, C. 1997. Strain-specific differentiation of
lactococci in mixed starter culture population using randomly amplified
polymorphic DNA-derived probes. Appl. Environ. Microbiol., 63; 2702-2707.
Fitzgerald, G.F., Daly, C., Brown, L.R. and Gingeras, T.R. 1982. ScrF1:
A new sequence spesific endonuclease from Streptococcus
cremoris. Nucleic Acid Research, 10; 8171-8178.
Fitzgerald, G.F., Hill, C. and Garvey, P.1996. Restriction modification systems in Lactococcus lactis. Gene, 157; 13-18.
Garbutt, K.C., Kraus, J. and Geller, B.L. 1997. Bacteriophage
resistance in Lactococcus lactis
engineered by replacement of a gene for a bacteriophage receptor. J. Dairy Sci,
80; 1512-1519.
Garvey,P., Fitzgerald, G.F. and Hill, C. 1995. Cloning and DNA sequence analysis of two abortive infection phage resistance determinants for the lactococcal plasmid pNP40. Appl. Environ. Microbiol., 61; 4321-4328.
Garvey, P., Hill,C. and Fıtzgerald, G.F. 1996. The lactococcal plasmid
pNP40 encodes a third bacteriophage resistance mechanism, one which affect
phage DNA penetration. Appl. Environ. Microbiol., 62; 676-679.
Gasson, M. 1980. Production, regeneration and fusion of Protoplasts in
lactic streptococci. Appl. Environ. Microbiol., 40; 964-966.
Geller, B.L., Ivey, R.G., Trempy, T.E. and Hettinger-Smith, B. 1993. Cloning of a chromosomal gene required for phage infection of Lactococcus lactis subsp. lactis C2. J. Bacteriol., 175, 5510-5519.
Goldstein, I.J., Hollerman, C.E. and Smith, E.E. 1965. Protein-carbohydrate ınteraction II. inhibition studies on the interaction of concanavalin A with polysaccharides. Biochemistry, 4: 876-883.
Gopal, P.K. and Crow, V.L. 1993. Characterization of loosely associated material from the cell surface of Lactococcus lactis subsp. cremoris E8 and its phage resistant variant strain 398. Appl. Environ. Microbiol., 59; 3177-3182
Harrington, A. and Hill, C. 1992. Plasmid involvement in the formation of a spontaneous bacteriophage insensitive mutant of Lactococcus lactis. FEMS. Microbiol. Lett., 96; 135-142.
Hill, C. 1993. Bacteriophage in dairy starter culture technology. Food
Technology, 38; 41-50.
Holt, G.H., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T. and Williams, S.T. 1994. Bergey’ s manual of determinative bacteriology. Williams and Wilkins Co., Ninth Edition, 787 p.
Kennedy, F,D. and Sutherland, I,W. 1987. Analysis of bacterial exopolysacchorides. Biotechnol. Appl. Biochem., 9: 12-19.
King, W.R., Collins, E.B. and Barrett, E.L. 1983. Frequencies of bacteriophage-resistant and slow acid-producing variants of Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol, 45; 1481-1485.
Klaenhammer, T.R., McKay, L.L. and Baldwin, K.A. 1978. Improved Lysis of Group N streptococci for isolation and rapid characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. Appl. Environ. Microbiol., 35; 592-600.
Klaenhammer, T.R. 1984. Interactions of bacteriophages with lactic
streptococci. Adv. Appl. Microbiol., 30; 1-29.
Klaenhammer, T.R. and Fitzgerald, G.F. 1994. Bacteriophage and
bacteriophage resistance. In: genetics and biotechnology of lactic acid
bacteria (M.J. Gasson, W.M. de Vos, Eds), Blackie Acad. Press., Glaskow, pp;
106-168.
Klaenhammer, T.R. and Dinsmore, P.K. 1995. Phenotypic consequences of
altering the copy number of abi A, infection in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 60; 1129-1136.
Klaenhammer, T.R. and Dinsmore, P.K. 1997. Moleculer characterization
of a genomic region in a Lactococcus
bacteriophage that is involved in its sensitivty to the phage defense mechanism
Abi A. J. Bacteriol., 63; 2949-2957.
Kok, J. 1996. Inducible gene expression and environmentally genes in
lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek, 70; 129-145.
Kraus, J. and Geller, B.L. 1998. Membrane receptor for prolate phages is not required for infection of Lactococcus lactis by small or large isometric phages. J. Dairy Sci., 81; 2329-2335.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685.
Leewacharamas, V., Chia, L.G., Charoenchai, P., Kunajakr, N., Liu, C. and Dunn, N.W. 1997. Plasmid-encoded copper resistance in Lactococcus lactis. Biotechnology Letters, 19; 639-643.
Lodics, T.A. and Steenson, L.R. 1993. Phage-host interactions in commerical mixed dairy starter cultures: practical significance-a rewiev. J. Dairy Sci., 76; 2380-2391.
Lucey, M., Daly, C. and Fitzgerald, G.F. 1992. Cell surface characteristics of Lactococcus lactis harbouring pCI528, a 46 kb plasmid encoding inhibition of bacteriophage adsorption. J. Gen. Microbiol., 138; 2137-2143.
Luria, S.E., Darnel, Y.E. and Campbell, A. 1978. General virology. Joh Wiley and Sons, New York, 578p.
Macrina, F.L., Kopecko, D.J, Jones, K.R., Evans, R.P. and
Clewell, D.B.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. 1986. Molecular cloning. a laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory (CSH), New York. 455p.
Mayo, B., Hardisson, C. and Brana, A.F. 1991. Nucleolytic activities in
Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 497. FEMS Microbiol. Rev.,
52; 812-818.
McKay, L.L., Baldwin, K.A. and Zottola, E.A. 1972. Loss of lactose metabolism in lactic streptococci. Appl. Microbiol, 23; 1090-1096.
McKay, L.L. and Baldwin, K.A. 1973. Induction of prophage in Streptococcus lactis C2 ultraviolet
irradiation. Appl. Microbiol., 25; 682-684.
McLandsborough, L.A., Sechaud, L. and McKay, L.L. 1998. Synergistic
effect of Abi E or Abi F from pNP40 when cloned in combination with Abi D from
pBF61. J. Dairy Sci., 81; 362-368.
Meyers, J.A. Sanches, D., Elwell, L.P. and Falkow, S. 1976. Simple
agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization
of plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol., 127; 1529-1537.
Moineau, S., Kondo, J.K., Vedamuthu, E.R., Emond, E., Holler, J.B.,
Boucher, I. and Vandenbergh, P.A. 1997. Phenotypic and genetic characterization
of the bacteriophage abortive infection mechanism Abi K from Lactococcus lactis. Appl. Environ.
Microbiol., 63; 1274-1283.
Monteville, M.R., Ardestani, B. and Geller, B.A. 1994. Lactococcal phages require a host cell wall carbohydrate and a plasma membrane protein for adsorption and ejection of DNA. Appl. Environ. Microbiol., 60; 3204-3211.
Neve, H. 1996. Bacteriophage. In: dairy starter cultures (T.M. Cogan and J.P. Accolas. Eds), VCH Publishers, New York, pp; 157-189.
Nordström, K. and Forsgren, A. 1974. Effect of protein A on adsorption of bacteriophages of Staphylococcus aureus. J. Virol., 14; 198-202.
Oram, J.D. and Reiter,B. 1968. The adsorption of phage to group N streptococci. The specificity of adsorption and the location of phage receptor substances in cell-wall and plasma-membrane fractions. J. Gen. Virol., 3; 103-119.
Oram, J.D. 1971. Isolation and properties of a phage receptor substance from the plasma membrane of Streptococcus lactis ML3. J. Gen. Virol., 13; 59-71.
O’Sullivan, D.J. and
Klaenhammer, T.R. 1995. C-LlaI is a bifunctional regulatory protein of
the LlaI restriction modification operon from Lactococcus lactis. In Genetics of Streptococci, Enterococci, and Lactococci; Proceeding of the IVth
International Conference on Streptococcal Genetics (Ferretti, J.J, Gilmore, M., Klaenhammer, T.R., Brown, F.,
Eds.), Dev. Biol. Stand., Basel, 85; 591-595.
Özcan, B.D. 1998. Bacillus subtilis’e ait selülaz genlerinin E. coli’ de klonlanması. Çukurova Üniversitesi Fen Bil. Enst. Yüksek Lisans Tezi. 70 s, basılmamış.
Prevots, F., Daloyau, M., Bonin, O., Dumont, X. and Tolou, S. 1996. Cloning and sequencing of the novel abortive infection gene abiH of Lactococcus lactis subsp.lactis biovar. diacetylactis S94. FEMS Microbiol. Letters, 142; 295-299.
Renault, P. 1996. Progress in genetic research of lactic acid bacteria. Current Advances in Metabolism, Genetics and Applications. 15-37p, France.
Reyrolle, J., Chopin, M.C., Letellier, F. and Novel, G. 1982. Lysogenic
strains of lactic acid streptococci and lytic spectra of their temperate
bacteriophages. Appl. Environ. Microbiol., 43; 349-356.
Sandberg, S., Laux, P. and Süssmuth, R. 1994. Correlation between
phage-resistance and fructose-tolerance in Lactococcus
lactis subsp. lactis 4513-5.
Milchwissenschaft, 49; 552-555.
Sanders, M.E. and Klaenhammer, T.R. 1983. Characterization of phage-sensitive mutants from a phage-insensitive strain of Streptococcus lactis: evidence for a plasmid determinant that prevents phage adsorption. Appl. Environ. Microbiol., 46; 1125-1133.
Sanders, M.E. 1988. Phage resistance in lactic streptococci. Biochemie,
70; 411-421.
Schaffer, A., Geis, A., Neve, H. and Teuber, M. 1991. Bacteriophage receptors of Lactococcus lactis subsp. diacetylactis F7/2 and Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2-1. FEMS Microbiol. Lett., 78; 69-74.
Schleifer, K.H. 1987. Recent changes in taxonomy of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Rev., 46; 201-203.
Shaerman, C., Underwood, H.M., Jury, K. and Gasson, M. 1989. Cloning
and DNA sequence analysis of Lactococcus bacteriophage
lysin gene. Molecular General Genetics, 218; 214-221.
Sijtsma, L., Sterkenburg, A. and Wouters, J.T.M. 1988. Properties of the cell walls of Lactococcus lactis subsp. cremoris SK110 and SK112 and their relation to bacteriophage resistance. Appl. Environ. Microbiol., 54; 2808-2811.
Sijtsma, L., Jansen, N., Hazeleger, W.C., Wouters, J.T.M. and Hellingwerf, K.J. 1990a. Cell surface characteristics of bacteriophage-resistant Lactococcus lactis subsp. cremoris SK110 and its bacteriophage-sensitive variant SK112. Appl. Environ. Microbiol., 56; 3230-3233.
Sijtsma, L., Jansen, N., Wouters, J.T.M. and Hellingwerf, K.J. 1990b. Isolation and characterization of lipoteichoic acid, a cell envelope component in preventing phage adsorption, from Lactococcus lactis subsp cremoris SK110. J. Bacteriol., 172; 7126-7130.
Su, P., Ng, A., Kennelly, V., Costello, M., Harvey, M. and Dunn, N. 1998. Additive effects of two different plasmid-linked restriction and modification systems in lactococcus. Biotechnology Letters, 20; 515-518.
Şanlıbaba, P., Tükel, Ç., Tuncer, Y. ve Akçelik, M.
Şanlıbaba, P. ve Akçelik, M. 2000. Çiğ süt ve peyniraltı sularından izole edilen laktokokların faj duyarlılıkları. Doğa (Tr. J. of Biology), Yayına kabul edildi.
Terzaghi, B.E. and Sandine, W.E. 1975. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl. Microbiology, 29; 807-813.
Teuber, M. 1990. Strategies for genetic modification in lactic acid
bacteria. Food Biotechnology, 4; 537-546.
Tükel, Ç. ve Akçelik, M. 2000. Lactococcus
lactis subsp. lactis suşlarında
laktoz plazmidlerinin tanımlanması. Doğa (Tr. J. of Biology), basımda.
Twomey, D.P., Gabillet, N., Daly, C. and Fitzgerald, G.F. 1997.
Molecular characterization of the restriction endonuclease gene (Scr FI)
associated with the ScrFI restriction/modification system from Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503. Microbiology, 143;
2277-2286.
Valyasevi, R., Sandine, W.E. and Geller, B.L. 1990. The bacteriophage kh receptor of Lactococcus lactis subsp. cremoris KH is the rhamnose of the extracellular wall polysaccharide. Appl. Environ. Microbiol., 56; 1882-1889.
Valyasevi, R., Sandine, W.E. and Geller, B.L.
Valyasevi, R., Sandine, W.E. and Geller, B.L. 1994. Lactococcus lactis subsp. lactis C2 bacteriophage sk1 receptor involving rhamnose and glucose moieties in the cell wall. J. Dairy Sci., 77; 1-6.
Vlegels, P.A.P., Hazeleger, W.C., Helmerhorst, T.H. and Wouters, J.T.M. 1988. Phage resistance of Streptococcus cremoris due to low adsorption efficiency. Neth. Milk Dairy J., 42; 195-206.
Watanabe, K., Ishibashi, K., Nashima, Y. and Sakurai, T.
Wallace, R.J. 1980. Cytoplasmic reserve polysaccharide of Selenomonas ruminantium. Appl. Environ. Microbiol., 39; 365-366.
Wolfe, T.W. and McKay, L.L. 1983. Isolation and partical characterization of lactose-negative mutants from Streptococcus lactis C2 defective in the phosphotransferase system. J. Dairy Sci., 67; 950-959.
Yi-Mo, D., Liu, C-Q. and Dunn, N.W. 1999. Genetic organization and functional analysis of a novel phage abortive infection system, Abi L, from Lactococcus lactis. J. Biotechnol., 67; 135-149.
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. L. lactis suşlarında doğal faj dirençlilik sistemleri ve bunların
faj enfeksiyon sürecindeki etki
basamakları……………………………..6
Şekil 4.1. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun ekzopolisakkarit
üretme yeteneğini kaybetmiş
(Eps-), faj duyarlı (fs)
mutant suşu (MA83-28) ve bu
suşun faj dirençli (fr)
türevinin (MA83-28-T) protein
içerikleri ………………………………43
Şekil 4.2. L. lactis subsp. lactis
MA83 suşu ve mutantlarında plazmid içerikleri…46
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 4.1. L. lactis subsp. lactis
MA83 suşunda fajların
adsorbsiyonu üzerine kimyasalların etkisi 34
Çizelge 4.2. L. lactis subsp. lactis
MA83 suşunun ekzopolisakkarit üretmeyen
mutantında (MA83-28) fajların adsorbsiyonu üzerine kimyasalların
etkisi……………………………........................................................38
Çizelge 4.3. Ekzopolisakkarit
üretmeyen ve faj almaç bölge materyali
proteinden oluşan kontrol
suş L. lactis subsp. lactis 965’de
(Whisby, Niebüll/Germany)
faj adsorbsiyonu üzerine
kimyasalların
etkisi..............................................................................37
Çizelge 4.4. L. lactis subsp. lactis MA83 suşunun monosakkaritlere
spesifik lektinlerle aglutinasyonu……………………………………39
Çizelge 4.5. L.
lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği
ekzopolisakkarit
yapının kimyasal
bileşimi…………………………………………....41
Çizelge 4.6. L.
lactis subsp. lactis MA83 suşunun ürettiği
ekzopolisakkarit
materyalin
monosakkarit bileşimi…………………………………….42