GİRİŞ VE
AMAÇ
Protetik
amaçlı kullanılan alaşımlarının bileşiminde bulunan bazı elementlerin
salınımları, biyouyumluluk problemini ortaya çıkarmaktadır. Biyouyumluluk,
canlı dokularla temasta olan herhangi bir malzemenin sistemik ve lokal
toksisite, allerjik, mutajenik ve karsinojenik etki yapmayan inert özellikleri
ile vücudun yumuşak ya da sert dokularında “doku reaksiyonu” oluşturmaması
olarak ifade edilir 4,32, 64. Diğer bir deyişle kullanılan
materyalin uygun konakçı cevabı oluşturmasıdır
55, 85.
Ağız
epiteli, bağ dokusu, diş sert dokuları ve kemik ile temasta kalan
restorasyonlarda kullanılan metalik materyallere karşı biyolojik cevap, salınan
elemente, miktarına ve dokularla temasta kalam süresine bağlıdır 64, 85.
Metalik
materyalin vücuttaki dokularla etkileşimi iki faktöre bağlıdır. İlk faktör
olarak korozyon oranı ve mekanizması göz önüne alınırken, ikincisi iyon
formunda erimeyen bileşiklerin, korozyon ürünlerinin, biyolojik aktivitelerinin
değerlendirilmesidir 85.
Biyouyumluluğun
değerlendirilmesi biyolojik fonksiyonlar üzerine materyallerin zarar verme ya
da toksik etkilerinin derecelerini içerir. Bu terimin aralığı geniştir ve tam
uyumluluk çok nadir olduğu için göreli hassasiyette kullanılır. Potansiyel
tehlikeler ve bildirilen ya da gerçek yan etkiler arasındaki ayırım önemlidir 43.
Biyomateryal ve organizma arasındaki etkileşimlerin tümü biyouyumluluğun
sınırları içerisinde düşünülmelidir 85. Çünkü in vivo koşullarda
materyal ile dokular ve vücut sıvıları arasında oluşan etkileşimin taklit
edilmesi oldukça güçtür 84. Klinik kullanım temel alındığında, kısa
dönemde dental alaşımlardan salınan elementlerin düşük seviyeleri için in vivo
olarak belirgin bir tolerans olduğu bilinmektedir. Bu düşük element
seviyelerine uzun dönem reaksiyonlarının soruları cevapsız kalmaktadır. Element
salınımından kaynaklanan bazı kronik irritasyonların riski, kullanılan bu
malzemelerin bilinen faydaları karşısında dikkatlice değerlendirilmelidir. Bu alanda
çalışan pek çok araştırmacı son zamanlarda diş hekimliğinde kullanılan pek çok
alaşımın faydalarının risklerine göre daha ağır geldiği konusunda hem fikirdir 64.
Elementin ve alaşımın özelliklerinden ve
hazırlanma şeklinden başka, ağız içi faktörlere de bağlı olan element salınımı,
alaşımın soy metal içeriği azaldıkça, artmaktadır. Salınan elementlerin canlı
dokularda zararlı etki yapabilmesi için, belli konsantrasyonlara ulaşması
gerekmektedir. Ağız içi dokuları ile uzun süre temasta kalan alaşımlardan
element salınımı, özellikle lokal toksisite açısından önem taşımaktadır. Dental
alaşımlardan salınan elementlerin sistemik toksisiteye yol açtığı
bildirilmezken, biyouyumluluğun diğer faktörleri olan allerji, mutajenite ve
karsinojenite üzerindeki çalışmalar devam etmektedir. Dental alaşımların
biyouyumluluğu, salınan elementlerin lokal etkilerini değerlendirebilmek amacı
ile, çoğunlukla alaşımlarla hücre dizilerinin direkt temasta olduğu hücre
kültürü ortamlarında yürütülen, in vitro sitotoksisite incelemeleri ile
araştırılmaktadır. Bu konudaki çalışmalarda, hücrelerde canlılık tespiti,
morfoloji, membran geçirgenliği ve bütünlüğü, mitoz insidansı, total protein
miktarı, lizozomal aktivite, oksijen
tüketimi, hemolizis gibi konuların yanı sıra, mitokondriyal enzim olan süksinik
dehidrogenazın (SDH) aktivitesi ve hücre içi ATP (Adenozin Tri Fosfat)
seviyesinde azalma üzerinde durulmaktadır
Hücresel yapıların fonksiyonunun devamlılığı için belli hücre içi enerji
seviyelerine ihtiyaç olduğu bilindiğinden, azalmanın hücre içi diğer yapılarda
meydana getireceği etkiyi inceleme ihtiyacı ortaya çıkmıştır.
Çalışmamızda, temel metal (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımları ile in vitro hücre kültürü ortamında temasta kalan insan embriyonel fibroblastlarının, hücre iskeletini oluşturan ve hücre şeklinin korunması, hücre içi olayların koordinasyonu ve hücre içi madde taşınması gibi görevlere sahip olan mikrofilaman (aktin), ara filaman (vimentin) ve mikrotübülüs yapılarında meydana gelen değişiklikleri ve mitotik aktivite oranını değerlendirmek için, histoloji’nin yeni gelişen dalı olan immünositokimyasal yöntemler kullanılarak, sonuçların bilgisayarlı görüntü analizi sistemini kullanan konfokal mikroskop ile incelenmesi ve hücresel değerlendirmelerle salınımın bağıntısının irdelenmesi amaçlanmıştır.
GENEL BİLGİLER
1. ALAŞIMLAR
Diş hekimliği biyoloji ve mekanik arasında
bir bölgede geliştiğinden restoratif metalik materyaller hem biyolojik hem de
mekanik açıdan değerlendirilir. Protetik restorasyonlarda, konservatif olarak,
cerrahide ve ortodontik uygulamalarda pek çok metal alaşımı kullanılmaktadır.
Bu alaşımlar, genellikle erimiş halde birbirleri içinde çözünen en az dört
sıklıkla altı veya daha fazla metalin birleşmesiyle meydana gelir. Alaşımlardaki
ana elementlerin yanı sıra minör elementler daha çeşitlidir. Periyodik tablodaki elementlerin
yirmibeşinden daha fazlası dental alaşım yapımında kullanılabilmektedir (Tablo 1). Alaşım
reaksiyonları saf metalin davranışından pek farklı değildir. Ancak, saf bir
metale başka bir metalin katılması bazı özellikler açısından karmaşık durum
ortaya çıkarabilir 18, 33, 38, 40, 50, 51, 52, 64, 87.
Diş hekimliğinde protetik amaçla kullanılan alaşımlar Mc Lean (1979)
tarafından aşağıdaki gibi sınıflandırılmıştır.
Soy
Metal Alaşım Sistemleri
Yüksek Altın Alaşımları -
Altın-Platin-Palladyum Alaşımları
- Altın-Platin-Tantal
Alaşımları
Düşük Altın Alaşımları -
Altın-Palladyum-Gümüş Alaşımları
Altınsız Alaşımlar - Palladyum-Gümüş Alaşımları
Temel
Metal Alaşım Sistemleri
- Nikel-Krom Alaşımları
-
Kobalt-Krom
Alaşımları
Dental alaşımlar yaygın olarak alaşımdaki
her elementin ağırlık yüzdesi (wt % - weight percentage) ve atom sayısının
yüzdesi (at % - atomic percentage) şeklinde ifade edilen bileşimleri ile
tanımlanırlar. Ağırlık yüzdesi alaşımın bileşimini tarif etmenin en çok
kullanılan yoludur, üreticiler ve standart organizasyonlar tarafından
kullanılır. Alaşımın ağırlık yüzdesi ve atomik yüzdesi birbirinden farklı
olabilir. Alaşımın atomik yüzdesinin bilinmesi ile biyolojik özellikleri daha
iyi anlaşılır. Atomik yüzde açığa çıkan ve vücudu etkileyen atom sayısını daha
iyi haber verir 64.
Tablo 1. Dental alaşımların
yapısına katılan elementlerin korozyon direnci üzerine etkileri ve havadaki
toksik miktarları (mg / m3) 31, 62, 87.
Element |
Korozyon ve lekelenme direnci |
Havadaki
toksik miktarı (mg/ m3) |
|
Altın
|
(Au) |
↑ |
|
Platin
|
(Pt) |
↑ |
|
Palladyum |
(Pd) |
↑ |
|
Tantalyum |
(Ta) |
|
|
Gümüş |
(Ag) |
↓ |
|
Bakır
|
(Cu) |
↓ |
|
Nikel |
(Ni) |
|
0,015 |
Krom
|
(Cr) |
↑ |
1 |
Kobalt |
(Co) |
|
0,05 |
İridyum
|
(Ir) |
↑ |
|
Aluminyum |
(Al) |
|
10 |
Berilyum |
(Be) |
|
0,002 |
Demir
|
(Fe) |
|
10 |
İndiyum |
(In) |
|
0,1 |
Kalay
|
(Sn) |
|
0,1 |
Manganez |
(Mn) |
↑ |
5 |
Titanyum |
(Ti) |
|
|
Silisyum |
(Si) |
|
10 |
Boron
|
(Bo) |
↑ |
|
Molibden |
(Mo) |
↑ |
5 |
Tungsten |
(W) |
↑ |
|
Karbon |
(C) |
|
|
Çinko |
(Zn) |
|
|
Alaşımın biyolojik güvenilirliğini ortaya
koyan özelliği korozyondur 64. Vücut sıvıları ile karşı karşıya
kalan pek çok biyomateryalin korozyona uğradığı bilinmektedir 4.
Alaşımın aktif ya da soy element içeriği, tek fazlı ya da çok fazlı olabilen
mikro yapısı, homojen ya da inhomojen durumu, pasivasyon özelliği gibi yapısal
özellikleri, döküm şartları ve bitirme işlemleri, farklı metal ve alaşımlar ile
karşılıklı etkileşimleri korozyon direnci üzerinde etkilidir.
Ağız ortamından kaynaklanan çeşitli
faktörler de korozyon oranı üzerinde etkilidir. Tamponlayıcı sistemi ve organik
yapısı sayesinde metalik restorasyonları inaktif duruma getirme yeteneği ile
inhibitör ya da yetersiz sekresyon ve
zayıflamış tamponlama kapasitesi ile stimulatör faaliyet gösteren tükürük, ağız içi ısısı, pH ve oksijen değişimleri,
yiyecek ve içeceklerin fiziksel ve kimyasal özellikleri, dental plak, gastrik
asitin geri kaçışı, proteinlerin varlığı, ilaç alımı, ısırma kuvvetlerinin
miktar ve dağılımındaki değişiklikler, gerilim, basınç, makaslama kuvvetleri
ile bağıntılı biyomekanik koşullar ve ağız içerisinde bulunan diğer metalik
restorasyonlarla etkileşim korozyon hızını ve oranını belirler. Ayrıca
alaşımlara yapışan dental plak, pH’ı düşürücü etkisi ile asidik ortam yaratır 14,
16, 17, 22, 29, 44, 48, 49, 64, 71, 72, 82, 87 .
Alaşımdan, korosif ortamda başlangıçta fazla ancak daha sonra pasivasyon nedeni ile azalarak sabit bir oranda devam eden element salınımı olmaktadır. Alaşımdan element salınımı tamamen durmamaktadır 23, 66, 78, 79, 80. Başlangıçtaki fazla salınımın azalması alaşım yüzeyinde pasif tabakanın oluşmasına bağlıdır. Bunun sonucu alaşımın yüzeyinde korozyona dirençli bölgeler meydana gelir. Bu bölgeler herhangi bir etkenle bozulana kadar korozyon oranı çok düşük seyreder 23. Alaşıma korozyon direncini artırmak için katılan diğer elementlerin etkilerinin yanısıra Ni-Cr ve Co-Cr alaşımlarına % 16-30 oranları arasında katılan Cr, kromik oksit adı verilen pasivasyon tabakasını meydana getirmektedir. Hızlı ve kararlı pasivasyon gösteren alaşımda uygun korozyon davranışı ile oldukça düşük iyon salınımı meydana gelmektedir 5, 6, 18, 23, 87. Ağız ortamında meydana gelen pasivasyon tükürükteki koruyucu pelikıl tabakası nedeni ile özellikle dikkat çekicidir 35.
Soy metal içeriği alaşımdaki bileşenlerin
nispeten azalmış salınımına yol açar 5, 6, 18, 23, 87. Ancak çok
fazlı alaşımlardan genellikle fazla element salınımı olmaktadır ve soy metal
içeriğinin fazla olması bu alaşımdan olan salınımı azaltmada etkili değildir 48,
72. Alaşımdan korozyon nedeni ile bileşimdeki oranlara göre element
salınımı olmak zorunda değildir. Ayrıca bazı elementlerin tabiatında, yüksek bir salınım eğilimi vardır. Bu durum,
elementin kararsızlığı ya da seçici salınma fenomeni olarak da ifade
edilebilir. Bu fenomen soy element içeriğine ve elementin alaşım yüzeyindeki
çokluğuna bağlıdır. Salınması için elementin yüzeyde olması gerekli fakat
yeterli değildir 64, 66, 67, 72. Bir elementin salınımı alaşımdaki
diğer elementlerden de etkilenebilir 8,
14, 15, 17, 22, 66, 71.
Biyolojik sıvılara maruz kaldığında alaşım yüzeyinde meydana gelen değişiklikler ve bunun element salınımı ile ilgisi, alaşımın yüzey bileşiminin, hacim bileşiminden daha önemli olduğunu düşündürmektedir. Alaşımın yüzeyden itibaren etkilenme derinliği önemlidir. Bunun nedeni yüzeyden itibaren 5 Ao alttaki bileşim incelendiğinde yüzeydekinden farklı bulunmasıdır. Buna göre 5 Ao’ luk kalınlık, element salınımına engel olan veya izin veren tabakadır. Dental döküm alaşımlarındaki her bir geçiş element atomunun metalik çapı yaklaşık 3 Ao olduğuna göre söz konusu 5 Ao’ luk yüzey tabakası 1 ya da 2 atom kalınlığındadır 67 .
Alaşımlardan salınan elementler ağız
mukozasından membran diffüzyonu ya da dentin tübülleri içinden pulpaya
migrasyonu ile alınabilir. Lenfatik sistem ve damarlarla yayılabilirler. Kan
damarları ve lenfatiklerle taşınan
makrofaj gibi hücreler metal partiküllerini (0,5 - 10 μm) içlerine
alabilirler. Tükürüğün yutulmasını takiben gastrointestinal yollardan
emilirler 5, 64. Vücut
genelde bu metalleri idrar, feces ve akciğerler yolu ile atabilir. Elementin
atılımı, vücuda giriş yoluna bağlı olacaktır. Metalin oksidasyon durumu ve
kimyasal formu, absorpsiyonu, yayılımı, tutulumu, yarı ömrü ve atılımına önemli
ölçüde etki eder 64.
Dişeti ve ağız içi sert dokularına,
dental restorasyonlardan metal alınımının varlığı gösterilmiştir. Ayrıca
implante edilmiş test materyali yüzeyinden lokal depozisyon sonucu karaciğer,
böbrek, beyin gibi dokular içerisine metal iyonlarının taşınabildiği tespit
edilmiştir 60.
2. SİSTEMİK TOKSİSİTE
Sistemik toksisite
toksik maddenin organizmaya giriş yollarındaki biyolojik membranları geçip, kan
dolaşımına girmesini takiben etki bölgesine ulaştıktan sonra oluşur. Bu etki
için belli bir dozda ve belli bir konsantrasyonda yeterli süre toksik maddeye
maruz kalınması gerekmektedir 62.
Toksisite ölçüsü LD50 (latent
doz) ile belirlenir. LD50 değeri
deney hayvanlarının % 50’sini
öldüren dozdur ve birimi mg / kg’ dır. Toksisite derecesi LD50
değerine göre değişik derecelerde ortaya çıkabilmektedir (Tablo 2).
Tablo 2. LD50 değerine göre toksisite
dereceleri 34.
Toksisite
derecesi |
LD50 (mg / kg) |
etkisiz |
> 15.000 |
az |
5.000 -
10.000 |
orta
derecede |
500 - 5.000 |
çok |
50 - 500 |
şiddetli
derecede |
5 - 10 |
süper |
< 5 |
Diş hekimliğinde
kullanılan alaşımlardan salınan elementlerin vücutta sistemik etki yaptığına
dair çok az kanıt vardır. Birçok durumda dental alaşımı oluşturan elementlerin
günlük diyetle alımları ile karşılaştırıldığında dental alaşımdan salınan
elementlerin miktarının diyetle alınan miktardan çok daha az olması nedeni ile
sistemik toksisite oluşmaması sürpriz değildir (Tablo 3).
Tablo 3. Bazı elementlerin diyetle günlük alınım dozları 64.
Element |
Doz (μg) |
Altın |
<7 |
Civa
|
20 |
Gümüş |
25 |
Krom
|
240 |
Kobalt
|
250 |
Molibden |
400 |
Nikel
|
300-600 |
Titanyum |
750 |
Bakır |
3110 |
Çinko
|
14250 |
Demir
|
23250 |
Aluminyum |
9000-36000 |
Eğer bir alaşım diyetle alınan miktara
yakın miktarlarda salınım yapıyorsa, sistemik biyolojik toksisiteye sahip bir
alaşım olarak düşünülemez. Ayrıca, dental döküm alaşımları ile ilgili hiçbir
çalışmada dental kron kullanımıyla, sistemik metal düzeyinin arttığı
gösterilememiştir. Salınan metallerin vücuda çeşitli yollardan giriş yaptığı,
geniş bir alana dağılabildiği bildirilmesine rağmen bu metallerin varlığının
sistemik toksisite oluşturduğu gösterilmemiştir 64.
3.
BİYOUYUMLULUĞUN ORTAYA KONULMASI
Biyolojik dokularda
kullanılacak materyalin zararlı etkilerinin araştırılmasında kullanılan
yöntemlerin prensibi, materyal ile biyolojik sistemin teması sonucunda canlı
hücredeki fonksiyonel ve yapısal değişmenin niteliğini ve ölçüsünü
belirlemektir. Bir başka deyişle bu etkinin, biyolojik sistemin yapısında belirgin
bir değişiklik şeklinde olup olmadığını ve etkinin reversibl olup olmadığını
ortaya çıkarmaktır. Her maddenin biyolojik sistemde etki göstermediği minimum
bir konsantrasyon vardır. Yine her maddenin bu miktarın üstünde belli bir etki
gösterdiği konsantrasyon vardır. Canlı sistemin maddeye verdiği cevap
kantitatif olarak değerlendirilebilir. Biyolojik etkilerin incelenmesinde “aynı
fonksiyonu ve aynı biyokimyasal metabolik yolları olan hücreler belirli bir
kimyasal maddeye karşı aynı etkiyi gösterir” prensibi büyük önem taşır. Bu
prensip farklı türlerde hücreler içinde tersi şeklinde geçerlidir. Materyal
biyolojik aktivite açısından incelenirken kullanım amacı da göz önünde
bulundurulmalıdır 62.
Dental materyallerin biyolojik olarak
incelenmesinde çok sayıda teknik sunulmuştur. Biyouyumluluğun araştırılmasında
standart, basit ve kısa sürede sonuç veren bir test yönteminin kullanımı tercih
edilmelidir. Dental materyallerin incelenmesi:
-
İn vitro
deneyler (birincil ya da eleme testleri),
-
İn vivo hayvan
deneyleri (ikincil testler),
-
İnsanlarda
klinik çalışmalar
olmak üzere üç basamakta yürütülmektedir.
Sonuçlarının in vivo koşulların sonuçları
ile bağıntısının kurulması güç olsa bile, kontrollü olması ve
tekrarlanabilirliği ile in vitro hücre kültürü deneyleri, potansiyel biyolojik
zararların analizine dayanmaktadır.
İn vivo hayvan deneyleri, materyalin
subkutan, kas ya da kemik içerisine yerleştirdikten sonra doku cevabının
incelenmesine dayanır. İn vitro hücre kültürü deneyleri, hayvan deneyleri ile
yer değiştiremez ancak ön eleme yaparak kullanımını (hayvan deneylerine olan
ihtiyacı) azaltabilir.
İnsanlarda yürütülen klinik çalışmalar
ise birinci ve ikinci basamak testlerde güvenilir bulunan materyalin klinik
kullanım ve reaksiyonlar açısından değerlendirilmesidir. Zaman, ekonomi ve etik
problemler yeni materyallerin tümünün bu basamakların hepsinden geçirilerek
test edilmesini zorlaştırmaktadır. Materyalin biyolojik aktivite mekanizmasının
in vitro deneylerle öğrenilmesi özelliklerinin geliştirilmesini sağlar 7,
10, 16, 27, 28, 46, 54, 55, 56, 63, 66, 83.
İn vitro hücre kültürü deneylerinde
hücrelerin yaşatılması için Açık Sistem ya da Kapalı Sistem inkübatörü
kullanılmaktadır.
Açık sistemde kültür ortamı ile inkübatör
içindeki hava ilişkidedir. Bu tür inkübatörlerde ortama bağlı olan bir tüpten
CO2 gelir, hücre ve dokuların yaşatılması için genellikle 37 oC,
% 5 CO2 li ve % 95 nemli ortam sağlanmış olur. Uzun süreli
kültürlerde mutlaka açık sistem kullanılmalı ve birkaç gün ara ile kültür
vasatı yenilenmelidir. Bu, metabolizma artıklarının uzaklaştırılıp yeni gelişim
ve besleyici faktörlerin sağlanması için yapılmaktadır.
Kapalı Sistemde kültür kaplarının
ağızları hava almayacak şekilde kapatılır bu yüzden ortamın CO2
gazlanmasına ihtiyaç yoktur ve kısa süreli kültürlerde kullanılır 11.
Kültür ortamında hücrelerin yaşaması,
beslenmesi ve çoğalması için bazı şartların yerine getirilmesi gerekmektedir.
Kültür ortamında, fibroblastların, tüm
hücreler gibi mikrotübülüsler, mikrofilamanlar ve ara filamanlardan oluşan
iskelet yapıları üzerinde çalışmalar yürütülmektedir 19, 30.
4. BİYOLOJİK
SONUÇ
Hücrenin incelenmesi
hücrelerde canlılık tespitinin yanı sıra morfoloji, membran geçirgenliği,
hücresel enzim aktiviteleri, çoğalma oranı, mitoz insidansı, hücre erimesi,
total protein miktarı gibi pek çok bakımdan değerlendirilebilir 7, 27, 28,
55.
Bu değerlendirilmenin
iyi bir şekilde yapılabilmesi
-
Hazırlama
tekniği
-
Mikroskopi’ye
bağlıdır 20.
Hücrenin belirli yapısal özelliklerini
vurgulamak için ayrı ayrı teknik
kullanılmaktadır 19.
HAZIRLAMA TEKNİĞİ
Çoğunlukla
protein yapılarından meydana gelen, hücrelere özgü molekülleri işaretlemeyi
hedefleyen immünflüoresan boyama işlemi, karışık hücrelerden oluşan bir
kültürde hücreleri birbirinden ayırt etmede de çok yardımcıdır. Flüoresan
görüntülemenin diğer yöntemlere en üstün tarafı, sadece flüorokroma bağlı olan
molekülün görünür kılınması, diğer yapıların karanlıkta kalmasıdır 12.
Ancak, flüoresan yayılımın gücü sınırlıdır, belli bir hızda solma (bleaching)
özelliği vardır ve derin sahalardaki moleküllerden kaynaklanan flüoresan
görüntülerin süperpoze olması gerçek üç boyutlu moleküler düzenin saptanmasını
güçleştirir 13.
İmmünflüoresan yöntemde direkt,
indirekt ve çoklu boyama prensipleri kullanılmaktadır (Şekil 1). Direkt
yöntemde hücre ve dokudaki bir antijen, flüorokromla konjuge edilmiş tek bir
antikorla işaretlenir. İndirekt yöntemde önce primer antikor ile belirleme
yapılır, sonra sekonder antikor ile boyama yapılır. Çoklu immünflüoresan
boyamada, hücre veya dokudaki birden fazla kimyasal molekülün görünür hale
getirilmesinde temel prensip önce küçük moleküllerin sonra daha büyüklerin
işaretlenmesidir. İlk işaretlenecek molekül için primer ve flüorokrom ile
konjuge edilmiş sekonder antikor uygulanır. İkinci molekül için aynı işlemler
tekrarlanır. Önemli olan nokta ilk ve diğer moleküller için kullanılacak primer
antikorların aynı hayvanda üretilmemiş olmasıdır. Aksi halde sekonder
antikorlar rahatlıkla çapraz reaksiyona girip karşılıklı primer antikorlarla
yapışabilirler 12 .
Şekil 1. İmmünflüoresan boyama yöntemleri 13.
1990 yılında yapılan bir çalışmada Naji ve
Harmand, Co-Cr dental alaşımının farklı yüzey durumuna göre
sitokompatibilitesini değerlendirmek için gingival fibroblast ve osteoblast
hücrelerinin çoğalma oranı, total protein miktarı ve hücre iskeleti
incelenmiştir. Hücre iskeleti elemanlarından mikrotübülüsler indirekt
immünflüoresan boyama yöntemi kullanılmıştır. Mikrotübülüsler anti
α-tübülin primer antikoru ile işaretlenip, fluorescien ile konjuge edilmiş
koyun anti fare IgG sekonder antikoru ile boyandıktan sonra epiflüoresan ışık
mikroskobu ile incelenmiştir. Pürüzlü yüzeyli ve Radyofrekans ile kaplanmış
yüzeyli örneklere tabi tutulan hücrelerde depolimerize mikrotübülüsler
gözlenmiştir 45.
MİKROSKOPİ
Hücre
iskeleti elemanlarını ve mitotik aktiviteyi incelemek üzere son zamanlarda
Flüoresan Mikroskopiye dayalı, gelişmiş ve en iyi teknik donatıları ile
desteklenmiş olan Konfokal Mikroskop kullanılmaktadır 13.
Konfokal
Mikroskop bir optik mikroskop sistemi olup aydınlatma kaynağı olarak
pankromatik görünür ışınlar yerine monokromatik lazer ışınlarını kullanır.
Nokta ışık, nokta tarama, nokta algılama ile Üçlü Eş Odaklama ortaya koyar.
Lazer ışınları, cismi sadece bir düzlemde odaklar (nokta ışık), bu odaktan geri
yansıyan flüoresan yayılım, foton olarak çok küçük bir delikten geçirilerek
(nokta tarama), detektör tarafından
algılanır (nokta algılama) (Şekil 2). Gelen sinyaller elektrik sinyallerine ve
daha sonra da sayısal hale çevrilerek bilgisayarda görüntülenir. Gelişmiş yazılımlar sayesinde görüntü toplama,
işlemlendirme ve depolama sağlanmaktadır. Konfokal Mikroskopta tek boyutlu
çizgi tarama, iki boyutlu alan tarama, üç boyutlu uzaysal tarama ve dört
boyutlu zaman içinde tarama yapılmaktadır. Mikroskobun en önemli özelliği
odak-dışı görüntülerin ortadan kaldırarak belli bir kalınlığı olan net görüntüler
ortaya koymasıdır. Optik kesit olarak bilinen bir incelikte görüntü ve farklı
derinliklerdeki düzlemlerden flüoresan görüntülerin seri kesitleri bilgisayar
tarafından kaydedilir ve bunların kombine edilmesi ile üçboyutlu görüntü elde
edilebilir. Zaman değişimlerini kaydeder ve kesintisiz izleme yapılabilir 13,
19 .
Şekil 2. Konfokal
Mikroskobun çalışma prensibi.
Bu
mikroskop tipinde apokromatik ve plan objektifler kullanılarak mercek kusurları
ortadan kaldırılmıştır. Maksimum Sayısal Açıklık (1.2-1.4) ve yüksek çözünürlük
göstermektedir. Kullanılan lazer kaynağı sayesinde preparat üzerinde yapılan
hızlı tarama, flüoresanın daha geç solmasını sağlamakta ve daha uzun inceleme
süresi vermektedir. Ayrıca optik kesit halinde görüntü elde edilerek, odak
düzleminin altındaki ve üstündeki moleküllerden kaynaklanan flüoresan
görüntülerin süperpoze olması engellenmektedir 13.
ATOMİK ABSORBSİYON SPEKTROMETRESİ
Korozyon etkisi ile metal ve alaşımlardan
salınan elementler ayrı ayrı tespit edilebilmektedir. Bu tespit ortamda serbest
kalmış elementlerin ayrıştırılması ve miktarlarının ölçümü şeklinde
yapılabilmektedir. Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi (AAS) bu amaçla sıklıkla
kullanılan hassas bir analiz yöntemidir. Atomik Absorpsiyon Spektroskopisi, bir
elementin önce nötral sonra buhar hale gelmesi daha sonrada bir kaynaktan gelen
ışın demeti ile karşılaşması prensibine göre çalışmaktadır 26. Bu
yöntemin esası, metal tuzunun ısı ile buhar haline geldiği sırada içerisinden
geçen elektromanyetik ışığı absorbe etmesine dayanmaktadır 3, 26, 61.
Şekil 3. Şematik Atomik Absorpsiyon Spektrofotometresi.
Işık kaynağı olarak en çok, her element
için ayrı ayrı yapılmış olan hallow (oyuk) katot lambaları kullanılmaktadır.
Katot Lambası düşük basınçla doldurulmuş Azot, Argon veya Helyum gibi inert bir
gaz içerir. Lambaya 600 volttan daha yüksek bir gerilim uygulandığında anot ve
katot arasında bir sarj oluşur ve içerideki gaz iyonlaşır. Bu iyonlar katottaki
metal atomlarına çarparak onları bir üst enerji seviyesine çıkarır. Atomlar
tekrar normal enerji seviyelerine inerken ışıma meydana getirir.
Atomlaştırıcı Kısım, çözelti halindeki
elementin buhar haline getirilip
atomizasyonun sağlandığı bölümdür. Bu bölümde yapılan ısı işlemi sırasında
elementi bileşik halinde ihtiva eden çözelti;
-
Alevli Atomik
Absorpsiyon Spektrometrisinde sis halinde yüksek sıcaklıktaki bir alev içine
püskürtülerek atomize edilir.
-
Grafit Fırınlı
Atomik Absorpsiyon Spektrometrisinde ise karbon numune kabına konarak elektrik
arkıyla yüksek sıcaklıkta atomize edilir.
Atomizasyon sırasında
çözeltideki ölçülecek element atomlarının maksimum absorbsiyon gösterdiği
spesifik dalga boyundaki ışık gönderilir 3, 26.
Optik sistem, ısıtma işlemi sonucunda
alevden çıkan ışınları bir mercek vasıtası ile monokromatöre
göndermektedir.
Monokromatörlerin düz ve küresel
aynaları, metal için karakteristik olan, istenen dalga boyundaki ışığı diğer
ışıklardan ayırarak dedektöre gönderir.
Dedektörler, ışık şeklindeki bir sinyali
elektriksel sinyale dönüştürürler. Bu amaçla genellikle fotomultiplier tüpler
kullanılmaktadır. Daha sonra bu elektriksel sinyal amplifiye edilerek bir ölçüm
veya kaydedici bölüme gönderilerek sonuçlar galvanometre, ampermetre veya
dijital bir yazıcı sistemi ile kaydedilmektedir 3, 26, 37, 61 .
GEREÇ VE YÖNTEM
Döküm
alaşımlarının, hücre düzeyinde, hücre iskeletini oluşturan yapılar üzerinde
potansiyel zararlı etkilerini in vitro hücre kültürü ortamında değerlendirmeyi
amaçlayan çalışmamız, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji - Embriyoloji
Anabilim Dalı, Hücre Kültürü ve İmmünositokimya laboratuarında yürütüldü.
Alaşımlardan element salınımı sonuçları Gülhane Askeri Tıp Akademisi Eczacılık
Bilimleri Başkanlığı Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalında değerlendirildi.
İN
VİTRO HÜCRE KÜLTÜRÜ İNCELENMESİ
Metal
Örneklerin Hazırlanması
Çalışmamızda,
Tablo 4’de içerisindeki elementlerin ağırlık yüzdeleri belirtilen dental döküm
alaşımları incelendi. Temel metal alaşımlarından (Ni-Cr ve Co-Cr) farklı
miktarlarda element içeriği olan üçer adet Ni-Cr ve Co-Cr temel metal alaşımı
ve iki adet soy metal alaşımı seçildi.
Örnekler, ISO (International Standardization Organization) (ISO 10993-5)
standartları bilgilerinden yararlanılarak, sitotoksisite deneyleri için uygun
olan test örneği modeline göre hazırlandı.
Bu
pirinç modelin öncelikle silikon esaslı katılma tip elastomerik ölçü malzemesi
(Panasil Contact Plus-PC-Kettenbach, Eschenburg, Almanya) ile hazırlanan
kalıplarından, mum örneği hazırlandı. Mum eritme tekniği kullanılarak, temel
metal alaşımları için Unicast (VOP Co., Botevgrad, Bulgaristan) indüksiyonlu
döküm makinesinde, soy metal alaşımları için ise Heraues (Kulzer, Almanya)
basınçlı, vakumlu döküm makinesinde, her metal için üretici firma tarafından
önerilen eritme ve döküm ısıları kullanılarak, standart dental döküm
alaşımlarının metal örnekleri elde edildi. Örnekleri birbirinden ayırt etmek
için, tesviye sırasında her alaşım tipinin tutucu kısımların uçlarına farklı
geometrik şekiller yapıldı. Her bir metal alaşımı için hazırlanan on örnekten
beş adedine bilinen tesviye ve parlatma işlemleri yapıldı. Diğer beş adedi
tesviye yapıldıktan sonra, protetik restorasyonların doku yüzeylerine yapılan
kumlama işlemine uygun olarak, temel metal alaşımlarından hazırlanan örnekler
250 μm, soy metal alaşımlarından hazırlanan örnekler 50 μm’luk Al 3 O 2 ile kumlandı.
Örneklerin yüzeyinden, parlatma patının bıraktığı kalıntılar, % 99’luk etanol
içerisinde 15 dakika ultrasonik temizleme ile kaldırıldıktan sonra, distile edilmiş,
deiyonize su ile
alkolü uzaklaştırmak için çalkalandı. Cam petri kaplarında 125 °C’de
30 dakika 1500 mmHg’de otoklavda (OT 012 Nüve, Türkiye) steril edilip, 48 saat
60 °C’de kuru hava fırınında
bekletilerek kurutma işlemi uygulandı (Resim 2).
Resim 2
Metal örnekler.
Hücre Kültürü Hazırlanması
Sitotoksisite
deneyleri, direkt temasta, açık sistem inkübatöründe yürütüldü. Öncelikle,
kültür vasatını değiştirme ve hücrelerin günlük gelişiminin takibinde yapılacak
mikroskobik incelemeler için, kültür kaplarının inkübatörden çıkarılması
sırasında metal örneklerin hareket ederek hücrelere mekanik zarar vermesini
önlemek üzere, parlatılmış ve kumlanmış aynı alaşımın beş örneği ayrı ayrı
lamellere parafin ile sabitlendi. Bu örneklerin aynı alaşıma ait olanları 24
kuyucuklu 6 x 4 polistiren kültür kabının aynı sırasında yer alacak şekilde,
kuyucuklara yerleştirildi. Kontrol grubu kuyucuğuna metal örnek konulmadı.
Sitotoksisite deneylerinde, canlı hücre olarak gelişimi hızlı olan tek
katlı kültür hücreleri halindeki insan embriyonel fibroblastları (Human
Embriyonal Fibroblasts-HEF / Alp CAN) kullanıldı. Hücreler, pipet yardımı ile
kuyucuklardaki lamel ve metal örnek üzerine ekildikten sonra, yüzeyle
adezyonunun sağlanması amacı ile kültür kapları bir saat inkübatör içinde bekletildi.
İnkübatör, hücrelerin yaşayabileceği 37 o C ’ de % 5 CO2
’ li % 97 nemli ortam
sağlamaktadır. Daha sonra, inkübatör içindeki kültür kuyucuklarına, hazırlanan
kültür vasatı eklendi. Kültür vasatı (Tablo 5), besleyici madde (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium –
DME F-12 Ham / Sigma D 0547) üzerine
belirtilen maddelerin ilavesi ile oluşturulan karışımın çift distile su ile (dd
H2O) 1000 ml ’ye tamamlanması
ile hazırlanarak pH ’sı
Tablo 5. Kültür vasatı (DME F-12 Ham).
DME-F12 HAM
12,1 g / L .
Penisilin
125,0 IU / ml
Streptomisin
125,0 mg / ml
Amphoterricin B 2,5 mg / ml
Bikarbonat
1,2 g / L .
Çift distile su (dd
H2O)
1000,0 ml
Hazırlanan bu in vitro şartlar altında, 120 saat (5 gün) sonunda,
biyolojik değerlendirmeler yapıldı. Hücrelerin gelişimi, 24 saatte bir faz
kontrast mikroskobu ile incelendi. 72
saat sonra, metabolizma artıklarını uzaklaştırmak ve besleyici faktörler
sağlamak üzere kültür vasatı yenilendi (Resim 3).
Resim 3. İn vitro hücre kültürü.
MİKROSKOBİK İNCELEME
Hücresel zarar, hücre
iskeletini oluşturan mikrofilaman (aktin), ara filaman (vimentin) ve
mikrotübülüs yapıları ve ayrıca mitotik aktivite bakımından incelendi. Bu
amaçla, hücrede bu bölümlerin görüntü analizlerini yapabilmek için, bir seri
işlem yürütüldü.
Fiksasyon
ve Boyama
Fiksasyon işlemi için
süre bitiminde inkübatörden çıkarılan kültür kabının her bir kuyucuğundan vasatın çekilmesinden sonra
lamel üzerindeki metal test örnekleri pensetle çıkarıldı. Lamel üzerindeki
hücreler fiksasyon solusyonu ile (Microtubule Stabilization Buffer Extraction
Fix / MTSB-FX) oda ısısında 30 dakika fikse edildi (Tablo 6).
Tablo 6. Fiksasyon solüsyonu (MTSB-FX).
MTSB 10 ml
.
Stabilizasyon
tamponu(SB-5x stok) 2 ml
Aprotinin (Sigma / A 1153)
0.001 ml
DTT (Di thio
threitol) (Sigma / 9779) 0.010 ml
D2O
(Deuterium Oxide-Ağır Su) (Sigma / 4501)
5 ml
Taxol 0.10 ml
MTSB-FX______________________________________________
Triton* (%10
stok) 0.100 ml
Formaldehit 0.540 ml
*Triton her fiksatifin içinde bulunmayabilir. Hücre
iskeleti incelemelerinde boyama ajanının hücre içerisine kolay girebilmesi için
hücre zarı penetrasyonunu artırmak üzere ilave edilir.
Fiksasyon sonunda, MTSB-FX solüsyonu
kuyucuklardan alındı. Boyama işlemlerine kadar hücrelerin kurumaması için
fosfat tamponlu tuzlu su (Phosphate
Bufferred Saline / PBS) (Tablo 7) ilavesini takiben buharlaşmayı önlemek
üzere, kültür kapları sıkıca
bantlandı. Boyama işlemlerine
kadar + 4 °C’ de buzdolabında bekletildi.
Tablo 7. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (
Na 2 HPO 4 sodyum fosfat dibazik, susuz
KH 2 PO 4 potasyum fosfat monobazik
NaCl sodyum klorür 7.20 g_____________
Distile suda
Boyama işlemi için, hücre iskeleti
elemanları olan aktin ve vimentini incelemek ve mitotik hücre sayısını
belirlemek üzere, kültür kuyucuklarından alınan bir lamel üzerinde çoklu
indirekt immünflüoresan boyama işlemi yürütüldü:
1. Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra
sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.
2. Vimentinin belirlenmesi için, fareden elde
edilmiş primer antikor anti-vimentin [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp, 90 dakika,
37 °C’ lik etüvde, nemli ve
karanlık ortama konuldu.
3. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
4. Vimentinin boyanması için, keçiden elde
edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein
Isothiocyanate-Goat Anti Mouse (FITC-GAM) [ 1:100 PBS (Jackson) / yeşil]
uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’ lik
etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
5. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
6. Aktin filamanın boyanması için,
otoflüoresan zehirli bir mantar türü Rhodamine Phalloidin [ 1:10
Wash ( Molecular Probess) / kırmızı ] uygulanıp, 45
dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
7. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
8. Lamel, içine hücre çekirdeklerini boyayan
Hoechst maddesi ilave edilmiş kapatma sıvısı (Tablo 8) damlatılan lam üzerine
hücreler arada kalacak şekilde kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam
sabitlendi.
9. Mikroskobik değerlendirmeye kadar – 20 °C’ da buzlukta saklanarak preparatların bozulması ve
ışıktan etkilenmesi önlendi.
Kontrol grubu
lamellerine de aynı işlemler yapıldı.
Tablo 8. Kapatma sıvısı.
__ 5,0 ml__
Gliserol 2,5 ml
PBS 2,5 ml
Azide 125,0 mg__
Hoechst 33258
(1mg / ml stok) 0,005 ml
Mikrotübülüsleri incelemek ve sadece mitotik
hücrelerin sayısını belirlemek için, kültür kuyucuklarından alınan diğer lamel
üzerinde, aşağıdaki çoklu indirekt immünflüoresan boyama işlemleri yapıldı:
1. Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra
sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.
2. Mikrotübülüslerin belirlenmesi için,
fareden elde edilmiş primer antikor anti-a tübülin [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp,
90 dakika, 37 °C’
lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
3. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
4. Mikrotübülüslerin boyanması için, keçiden
elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein
Isothiocyanate-Goat Anti Mouse FITC-GAM [ 1:100 PBS
(Jackson) / yeşil] uygulanıp, 90
dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve
karanlık ortama konuldu.
5. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
6. Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini
belirlemek için, tavşandan elde edilmiş primer
antikor anti-H3 (histone3) [ 1: 100
PBS (Upstate)] uygulanıp,
90 dakika, 37 °C ’
lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
7. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
8. Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini
boyamak için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder
anti-tavşan antikoru Indocarbocyanine-Goat Anti Rabbit (Cy 3 GA
Rb) [ 1:100 PBS (Jackson)
/ kırmızı] uygulanıp, 90 dakika, 37
o C’ lik etüvde, nemli ve
karanlık ortama konuldu.
10. PBS
tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.
11. Lamel, kapatma sıvısı damlatılan lam
üzerine hücreler arada kalacak şekilde
kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam sabitlendi.
12. Mikroskobik değerlendirmeye kadar -20 °C’ da buzlukta saklanarak preparatların bozulmaması ve ışıktan etkilenmesi
önlendi.
Kontrol grubu
lamellerine de aynı işlemler yapıldı.
BİYOLOJİK DEĞERLENDİRME
Biyolojik
değerlendirmede, temel (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımların parlatılmış ve kumlanmış örneklerinin, hücre
iskeleti elemanları ve mitotik aktivitede meydana getirdiği etkiler, boyanan
preparatlarda öncelikle tüm metaller için değerlendirildi. Şüphe uyandıran bir
sonuçta, diğer lameller yeniden boyanarak değerlendirme tekrarlandı. Hücre
iskeleti elemanları, çıkarılan metal örneğe yakın veya uzakta olan bölgelerdeki
tüm hücrelerde incelendi. Normale göre alaşımlardan etkilenme bulguları,
inceleme bölgeleri için kırılma, eğilme ve kesintiye uğrama şeklinde kalitatif
olarak değerlendirildi. Her bölgedeki hücrelerin aynı bulguları gösterdiği
gözlendi. Mikroskobik değerlendirme sonunda daha net görüntü veren bölgeler,
488 nm Argon iyon, 543 nm yeşil He - Ne, 633 nm kırmızı He - Ne lazerleri ve 63
x Zeiss Plan-Apo objektifi ile donatılmış Zeiss LSM - 510 Konfokal Mikroskobu
(Almanya) ile bilgisayar ekranında kaydedildi.
Hücrelerdeki mitotik aktivite ise
Hoechst ile boyanan hücre çekirdeklerinden mitotik olanların sayılarını, toplam
hücre sayısına oranlayarak ve ayrıca sadece mitoz aşamasındaki hücrelerin
çekirdeklerini boyayan anti-H3 antikoru boyanması ile tespit edilen mitotik hücrelerin sayılarını,
toplam hücre sayısına oranlayarak kantitatif olarak ortaya konuldu. Toplam
hücre sayısı olarak, her preparattan yaklaşık 1000’er hücrelik bölgede sayım
yapıldı.
Resim 3. İn vitro hücre kültürü.
MİKROSKOBİK İNCELEME
Hücresel zarar, hücre
iskeletini oluşturan mikrofilaman (aktin), ara filaman (vimentin) ve
mikrotübülüs yapıları ve ayrıca mitotik aktivite bakımından incelendi. Bu
amaçla, hücrede bu bölümlerin görüntü analizlerini yapabilmek için, bir seri
işlem yürütüldü.
Fiksasyon
ve Boyama
Fiksasyon işlemi için
süre bitiminde inkübatörden çıkarılan kültür kabının her bir kuyucuğundan vasatın çekilmesinden sonra
lamel üzerindeki metal test örnekleri pensetle çıkarıldı. Lamel üzerindeki
hücreler fiksasyon solusyonu ile (Microtubule Stabilization Buffer Extraction
Fix / MTSB-FX) oda ısısında 30 dakika fikse edildi (Tablo 6).
Tablo 6. Fiksasyon solüsyonu (MTSB-FX).
MTSB 10 ml
.
Stabilizasyon
tamponu(SB-5x stok) 2 ml
Aprotinin (Sigma / A 1153)
0.001 ml
DTT (Di thio
threitol) (Sigma / 9779) 0.010 ml
D2O
(Deuterium Oxide-Ağır Su) (Sigma / 4501)
5 ml
Taxol 0.10 ml
MTSB-FX______________________________________________
Triton* (%10
stok) 0.100 ml
Formaldehit 0.540 ml
*Triton her fiksatifin içinde bulunmayabilir. Hücre
iskeleti incelemelerinde boyama ajanının hücre içerisine kolay girebilmesi için
hücre zarı penetrasyonunu artırmak üzere ilave edilir.
Fiksasyon sonunda, MTSB-FX solüsyonu
kuyucuklardan alındı. Boyama işlemlerine kadar hücrelerin kurumaması için
fosfat tamponlu tuzlu su (Phosphate
Bufferred Saline / PBS) (Tablo 7) ilavesini takiben buharlaşmayı önlemek
üzere, kültür kapları sıkıca
bantlandı. Boyama işlemlerine
kadar + 4 °C’ de buzdolabında bekletildi.
Tablo 7. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (
Na 2 HPO 4 sodyum fosfat dibazik, susuz
KH 2 PO 4 potasyum fosfat monobazik
NaCl sodyum klorür 7.20 g_____________
Distile suda
Boyama işlemi için, hücre iskeleti
elemanları olan aktin ve vimentini incelemek ve mitotik hücre sayısını
belirlemek üzere, kültür kuyucuklarından alınan bir lamel üzerinde çoklu
indirekt immünflüoresan boyama işlemi yürütüldü:
13. Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra
sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.
14. Vimentinin belirlenmesi için, fareden elde
edilmiş primer antikor anti-vimentin [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp, 90 dakika,
37 °C’ lik etüvde, nemli ve
karanlık ortama konuldu.
15. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
16. Vimentinin boyanması için, keçiden elde
edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein
Isothiocyanate-Goat Anti Mouse (FITC-GAM) [ 1:100 PBS (Jackson) / yeşil]
uygulanıp, 90 dakika, 37 °C’
lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
17. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
18. Aktin filamanın boyanması için,
otoflüoresan zehirli bir mantar türü Rhodamine Phalloidin [ 1:10
Wash ( Molecular Probess) / kırmızı ] uygulanıp, 45
dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
19. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
20. Lamel, içine hücre çekirdeklerini boyayan
Hoechst maddesi ilave edilmiş kapatma sıvısı (Tablo 8) damlatılan lam üzerine
hücreler arada kalacak şekilde kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam
sabitlendi.
21. Mikroskobik değerlendirmeye kadar – 20 °C’ da buzlukta saklanarak preparatların bozulması ve
ışıktan etkilenmesi önlendi.
Kontrol grubu
lamellerine de aynı işlemler yapıldı.
Tablo 8. Kapatma sıvısı.
__ 5,0 ml__
Gliserol 2,5 ml
PBS 2,5 ml
Azide 125,0 mg__
Hoechst 33258
(1mg / ml stok) 0,005 ml
Mikrotübülüsleri incelemek ve sadece
mitotik hücrelerin sayısını belirlemek için, kültür kuyucuklarından alınan
diğer lamel üzerinde, aşağıdaki çoklu indirekt immünflüoresan boyama işlemleri
yapıldı:
9. Lamel, PBS tamponu ile yıkandıktan sonra
sıvının fazlası kağıt mendille hücrelere temas ettirmeden alındı.
10. Mikrotübülüslerin belirlenmesi için,
fareden elde edilmiş primer antikor anti-a tübülin [1:100 PBS (Sigma)] uygulanıp,
90 dakika, 37 °C’
lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
11. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
12. Mikrotübülüslerin boyanması için, keçiden
elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder anti-fare antikoru Fluorescein
Isothiocyanate-Goat Anti Mouse FITC-GAM [ 1:100 PBS
(Jackson) / yeşil] uygulanıp, 90
dakika, 37 °C’ lik etüvde, nemli ve
karanlık ortama konuldu.
13. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
14. Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini
belirlemek için, tavşandan elde edilmiş primer
antikor anti-H3 (histone3) [ 1: 100
PBS (Upstate)] uygulanıp,
90 dakika, 37 °C ’
lik etüvde, nemli ve karanlık ortama konuldu.
15. PBS tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama
işlemi yapıldı.
16. Sadece mitotik hücrelerin çekirdeklerini
boyamak için, keçiden elde edilmiş ve flüorokrom ile konjuge sekonder
anti-tavşan antikoru Indocarbocyanine-Goat Anti Rabbit (Cy 3 GA
Rb) [ 1:100 PBS (Jackson)
/ kırmızı] uygulanıp, 90 dakika, 37
o C’ lik etüvde, nemli ve
karanlık ortama konuldu.
22. PBS
tamponu ile 2 x 5 dakika tekrar yıkama işlemi yapıldı.
23. Lamel, kapatma sıvısı damlatılan lam
üzerine hücreler arada kalacak şekilde
kapatılıp, şeffaf tırnak cilası ile lamel ve lam sabitlendi.
24. Mikroskobik değerlendirmeye kadar -20 °C’ da buzlukta saklanarak preparatların bozulmaması ve ışıktan etkilenmesi
önlendi.
Kontrol grubu
lamellerine de aynı işlemler yapıldı.
BİYOLOJİK DEĞERLENDİRME
Biyolojik
değerlendirmede, temel (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal alaşımların parlatılmış ve kumlanmış örneklerinin, hücre
iskeleti elemanları ve mitotik aktivitede meydana getirdiği etkiler, boyanan
preparatlarda öncelikle tüm metaller için değerlendirildi. Şüphe uyandıran bir
sonuçta, diğer lameller yeniden boyanarak değerlendirme tekrarlandı. Hücre
iskeleti elemanları, çıkarılan metal örneğe yakın veya uzakta olan bölgelerdeki
tüm hücrelerde incelendi. Normale göre alaşımlardan etkilenme bulguları,
inceleme bölgeleri için kırılma, eğilme ve kesintiye uğrama şeklinde kalitatif
olarak değerlendirildi. Her bölgedeki hücrelerin aynı bulguları gösterdiği
gözlendi. Mikroskobik değerlendirme sonunda daha net görüntü veren bölgeler,
488 nm Argon iyon, 543 nm yeşil He - Ne, 633 nm kırmızı He - Ne lazerleri ve 63
x Zeiss Plan-Apo objektifi ile donatılmış Zeiss LSM - 510 Konfokal Mikroskobu
(Almanya) ile bilgisayar ekranında kaydedildi.
Hücrelerdeki mitotik aktivite ise
Hoechst ile boyanan hücre çekirdeklerinden mitotik olanların sayılarını, toplam
hücre sayısına oranlayarak ve ayrıca sadece mitoz aşamasındaki hücrelerin
çekirdeklerini boyayan anti-H3 antikoru boyanması ile tespit edilen mitotik hücrelerin sayılarını,
toplam hücre sayısına oranlayarak kantitatif olarak ortaya konuldu. Toplam
hücre sayısı olarak, her preparattan yaklaşık 1000’er hücrelik bölgede sayım
yapıldı.
Resim 4. Konfokal mikroskop ve bilgisayarlı görüntü analizi sistemi.
ELEMENT SALINIMI İNCELENMESİ
Döküm alaşımlarından
element salınımını tespit etmek için, parlatılmış ve kumlanmış beşer adet metal
örneği, 24 kuyucuklu 6 x 4 polistiren kültür kaplarına yerleştirildi. Daha
sonra fetal calf serum ilave edilmeden, hazırladığımız kültür vasatından (pH
7,4), kontrol grubu da dahil olmak üzere tüm kuyucuklara 0,5 ml konuldu. Açık sistem inkübatörü şartlarında
otuz gün beklenildi. Süre bitiminde, kültür kapları kuyucuklarından metal
örneklerin çıkarılmasını takiben, kültür vasatını taşıyan kaplar, değerlendirme
yapılana kadar sıvı kaybını önlemek amacı ile kapakları kapatılıp, kenarları
bantlanmış şekilde – 20 o C’ de buzlukta saklandı.
Element salınımının incelemesinde sadece Fe elementi için alevli atomik
absorbsiyon spektroskopisi kullanılırken, diğer elementler için grafit fırınlı
atomik absorbsiyon spektroskopisi (AAS) (Varian, 30 / 40 Model, GTA 96,
Avustralya) kullanıldı. AAS cihazının,
her element için belirli bir ölçüm aralığı vardır. Bu nedenle ticari olarak 1000 μg / ml konsantrasyonunda stok halinde mevcut olan her elemente ait solüsyonlardan (Sigma),
elemente ait ölçüm aralığındaki konsantrasyonlarda standart solüsyonlar
hazırlanıp cihaza okutularak, cihaz kalibre edildi ve her element için değişik konsantrasyonlardaki
kalibrasyon grafiği çizdirildi. Deneme ölçümleri sonucu, analizi yapılan
vasattaki element konsantrasyonlarının ölçüm aralığının dışında olduğu
anlaşıldığında %
Parlatılmış
ve kumlanmış temel metal alaşımlarının (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal
alaşımlarından hücre kültürü ortamına Tablo 10’daki elementlerinin salınım
miktarları tespit edildi. Alaşımların diğer elementleri, eser miktarlarda
oldukları için değerlendirilmedi. Kontrol grubu olarak kullanılan hücre kültürü
vasatında da çeşitli elementler bulunduğundan, salınım miktarlarını
incelediğimiz her element için kontrol grubu vasatında da AAS analizi yapıldı.
Temel metal (Ni-Cr ve Co-Cr) ve soy metal
alaşımlarının parlatılmış ve kumlanmış örneklerinden, hücre kültürü vasatına
salınan element miktarları ve normal vasatta bulunanların miktarları tespit
edildikten sonra, ortalamaları (X) ve standart sapmaları (s) hesaplandı. Her
alaşımın parlatılmış ve kumlanmış örnekleri arasındaki farklar (D) ve standart
sapmaları (s) hesaplanıp, farkları eş yapma testi ile irdelendi. Ni-Cr alaşımları
arasında ve Co-Cr alaşımları arasında parlatılmış ve kumlanmış örneklerin
farklarının farkları ise varyans analizi ile irdelenip farklı gruplar Duncan
testi ile saptandı.
Tablo 9. Elementler için atomik absorpsiyon parametreleri ve kalibrasyonda
kullanılan standart element solüsyonlarının konsantrasyonları.
Element |
Dalga Boyu (nm) |
Lamba Akımı (mA) |
Standart element solüsyon konsantrasyonları ( ng / ml ) |
||
Nikel
(Ni) |
232 |
4 |
20 |
40 |
60 |
Krom (Cr) |
357,9 |
7 |
5 |
10 |
15 |
Molibden (Mo) |
313,9 |
7 |
10 |
20 |
30 |
Kobalt
(Co) |
240,7 |
7 |
10 |
20 |
30 |
Manganez (Mn) |
279,5 |
5 |
1,25 |
2,5 |
5 |
Altın (Au) |
242,8 |
4 |
10 |
20 |
30 |
Palladyum (Pd) |
244,8 |
5 |
30 |
60 |
90 |
Kalay (Sn) |
235,5 |
7 |
50 |
100 |
150 |
İndiyum (In) |
303,9 |
5 |
50 |
100 |
150 |
Tablo 10. AAS analizi yapılan elementler.
Kontrol |
Ni |
Cr |
Co |
Mo |
Mn |
Fe |
Au |
Pd |
Pt |
In |
Sn |
Wiron 99 |
Ni |
Cr |
|
Mo |
|
Fe |
|
|
|
|
|
Wirocer |
Ni |
Cr |
|
Mo |
|
Fe |
|
|
|
|
|
Duceranium U |
Ni |
Cr |
|
Mo |
|
Fe |
|
|
|
|
|
Wironit |
|
Cr |
Co |
Mo |
Mn |
|
|
|
|
|
|
Wirocast |
|
Cr |
Co |
Mo |
Mn |
Fe |
|
|
|
|
|
Cr-Co Degussa |
Ni |
Cr |
Co |
Mo |
Mn |
|
|
|
|
|
|
BegoPal |
|
|
|
|
|
|
Au |
Pd |
|
In |
Sn |
PontoStar |
|
|
|
|
|
|
Au |
Pd |
Pt |
In |
|