Kedi ve Köpeklerde Sık Görülen Dermatofitlerin Teşhisine Yönelik qPCR ve LAMP Tabanlı Hızlı Tanı Kitlerinin Geliştirilmesi
Özet
Dermatofitler, hayvanlarda dünya çapında yaygın olarak görülen, bulaşıcı, zoonotik özellikte mantar etkenlerindendirler. Bunlar arasında hayvanlardan en çok izole edilen dermatofit etkenleri Microsporum canis ve Trichophyton mentagrophytes’tir. Bu çalışmada, kedi ve köpeklerden en sık izole edilen mantar türleri olan M. canis ve T. mentagrophytes’e spesifik, sahada uygulanabilir, özgül ve duyarlı, tekrarlanabilir, hızlı bir Spiral Aracılı İzotermal Çoğalma (LAMP) yöntemi ile laboratuvar analizlerinde kullanılmak üzere her iki etkeni de aynı anda teşhis edebilen, çoklu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tanı yöntemi geliştirilmesi amaçlandı.
Bu amaçla, her iki metodun tasarımında CHS-1 geni hedeflendi. Referans suşlarla yapılan optimizasyon çalışması sonrasında LAMP ve çoklu qPCR yöntemlerinin her iki hedef için de özgüllüğü %100 olarak bulunurken LAMP yönteminin duyarlılığı M. canis için %96,9, T. mentagrophytes için %93,2 olarak belirlendi. Çoklu qPCR yönteminde bu oran M. canis için %98,4, T. mentagrophytes için ise %97,7 olarak bulundu. Mikolojik test sonucu bilinen 250 adet kıl örneğinin kör numune olarak kullanıldığı validasyon çalışması sonrasında da benzer özgüllük ve duyarlılık sonuçları elde edildi.
Süre açısından değerlendirildiğinde ise LAMP yönteminin her iki hedef için 30 dk; çoklu qPCR yönteminin ise 45 dk gibi bir sürede sonuç verdiği belirlendi. Bununla birlikte yapılan tespit limiti belirlenmesi çalışmasında LAMP yönteminin tespit limiti her iki hedef için 10 spor/ml olarak belirlenirken çoklu qPCR yönteminin tespit limiti yine her iki hedef için 1 spor/ml olarak belirlendi.
Sonuç olarak bu çalışma sonunda hayvanlardan en çok izole edilen dermatofitler olan Microsporum canis ve Trichophyton mentagrophytes’in teşhisine yönelik, ilk kez, sahada uygulanabilir, özgül ve duyarlı, tekrarlanabilir, hızlı bir LAMP yöntemi ile laboratuvar analizlerinde kullanılmak üzere her iki etkeni de aynı anda teşhis edebilen, Türkiye’de ilk kez, internal kontrollü, çoklu qPCR tanı yöntemi geliştirildi.